1、本科毕业设计（20_届）香鱼热休克蛋白HSP70基因的克隆及生物信息学分析所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月0目录摘要ABSTRACT1引言22材料与方法221实验材料2211香鱼2212菌株和质粒2213试剂和酶2214仪器与设备222实验方法2221香鱼肝脏总RNA的提取2222逆转录合成CDNA3223PCR扩增HSP70基因核心序列3224PCR扩增产物的鉴定4225测序6226香鱼HSP70基因的生物信息学分析63结果与分析731香鱼HSP70基因CDNA片段的克隆732香鱼HSP70基因核苷酸序列比对1033香鱼HSP70基因编码的氨基酸序列多重比对103
2、4香鱼HSP70蛋白的特征分析1535香鱼HSP70蛋白二级结构分析1636香鱼HSP70蛋白三维结构分析1737PAHSP70基因系统进化树分析184结论19致谢19参考文献201摘要热休克蛋白70（HEATSHOCKPROTEIN70，HSP70）是一组在结构上高度保守的多肽，广泛存在于自然界原核、真核细胞中，参与细胞的损伤与修复。本实验以香鱼肝组织为实验材料，提取香鱼肝组织的总RNA，根据GENBANK上HSP70同源基因序列，设计并合成引物，使用PCR扩增的方法，克隆得到了香鱼的HSP70基因的核心片段序列，命名为PAHSP70。该基因大小为1961BP，包括完整ORF框，编码651个
3、氨基酸和一个终止子。预测PAHSP70蛋白的分子量大小为7122KDA，等电点PI516。通过比对与生物信息学分析发现，PAHSP70蛋白与其他鱼类HSP70蛋白同源性很高，因此认为该基因属于HSP70基因家族。构建PAHSP70基因系统进化树，体现了鲑科种间的亲缘关系与进化差异。关键词HSP70；香鱼；生物信息学分析ABSTRACTHEATSHOCKPROTEIN70ISAGROUPOFPEPTIDESWHICHHIGHLYCONSERVEDINTHESTRUCTURE,WIDELYFOUNDINPROKARYOTICANDEUKARYOTICCELLSHSP70ALSOPLAYSANIMP
4、ORTANTROLEINCELLINJURYANDREPAIRINTHISRESEARCH,PLECOGLOSSUSALTIVELISWASTAKENASTHEEXPERIMENTMATERIAL,ANDISOLATEDTHETOTALRNAFROMLIVERPAIRSOFPRIMERSWEREDESIGNEDANDSYNTHESIZEDACCORDINGTOTHEHOMOLOGOUSGENESOFHSP70INTHEGENBANKTHEORFSEQUENCEOFHSP70GENEFROMPLECOGLOSSUSALTIVELISWASGOTBYUSINGPCRTECHNIQUEANDNAME
5、DPAHSP70THEGENEWAS1961BPINCLUDINGAINTEGRATEORFWHICHENCODESA651AMINOACIDSPROTEINANDATERMINALCODENTHEMOLECULARWEIGHTOFPAHSP70PROTEINWASABOUT7122KDA,ANDTHEISOELECTRICPOINTPI516ALIGNEDANDBIOINFORMATIONANALYSISREVEALEDTHATTHEPAHSP70PROTEINHADINTENSIVEHOMOLOGYWITHOTHERFISHHSP70PROTEINS,INDICATINGTHATTHEPA
6、HSP70PROTEINBELONGSTOTHEMEMBEROFHSP70GENEFAMILYAPHYLOGENETICTREEOFPAHSP70GENEREFLECTEDSOMEOFMONOCOTYLEDONANDDICOTYLEDONRELATIONSHIPANDTHEDIFFERENCEOFTHEEVOLUTIONKEYWORDSHSP70SOLANUMTUBEROSUMBIOINFORMATICALANALYSIS21引言香鱼（PLECOGLOSSUSALTIVELIS）属于香鱼科PLECOGLOSSIDAE），有些学者并入鲑科SALMONIDAE，为味香美的河鱼。其常见于日本及台湾，
7、上溯于清澈的河水中产卵。体淡黄或橄榄色，长约30公分1尺，外貌颇似小鱒1。因为香鱼其肉醇厚，肉质细嫩味美并有殊香，犹如从香水中捞出来一般，并无其他鱼腥味，所以评价很高，有“淡水鱼之王”的美誉2。近二十年来，由于受外界环境的影响，野生资源量急剧减少，作为具有高经济价值的新兴养殖品种，日益受到人们的关注。热休克蛋白70（HEATSHOCKPROTEIN70，HSP70）是一组在结构上高度保守的多肽，广泛存在于原核和真核细胞中，正常情况与应激条件下都发挥重要的生理功能36，但胁迫因子（包括热激、物理、化学和生物等）能破坏蛋白的高级结构、扰乱正常细胞状态和损害机体78，都能诱导HSP70表达量显著增加
8、910。HSP70作为一种分子伴侣，参与维持蛋白质空间构象，保护细胞生命活动，折叠和跨膜运输新生的蛋白1113，修复错误折叠的蛋白，帮助降解变性的蛋白，稳定细胞骨架和核骨架的等基本功能一旦细胞面临胁迫状态时14，生物体就会大量表达HSP70以阻止细胞内变性蛋白质的累积，修复变性蛋白质15，运送未成熟的蛋白质至目标细胞器以完成最后的包装、代谢或修复，增加细胞的抗逆能力以保护机体度过不良状态由于热休克蛋白重要的生物学功能，现已成为生命科学热点研究领域之一1520。近年来有研究将HSP70作为指示鱼类健康的生物指标。不同鱼类中HSP70基因的序列有所不同，到目前为止，香鱼中完整的HSP70基因还没有
9、被报道。本文以香鱼肝脏为材料，克隆其HSP70基因核心片断序列并对其进行分子生物学分析,为进一步研究鱼类HSP70的结构、功能和作用机制打下基础。2材料与方法21实验材料211香鱼香鱼，购自宁波市宁海凫溪渔场，其肝脏为本实验材料。212菌株和质粒大肠杆菌DH5感受态细胞，PMD18T载体213试剂和酶BIOZOL试剂盒，PMD18TVECTOR试剂盒，AMV反转录酶，购于TAKARA公司；DNA快速纯化/回收试剂盒，购于北京鼎国生物公司；DNA连接试剂盒，购于PROMEGA公司；RNA酶抑制剂，异丙醇，QQ水等。214仪器与设备离心机、高压灭菌锅、电泳仪、恒温水浴锅、PCR仪、紫外透射仪等。2
10、2实验方法221香鱼肝脏总RNA的提取本实验使用BIOZOL总RNA提取试剂盒（BIOFLUX，日本）提取香鱼肝脏总RNA。3在液氮条件下将100MG香鱼肝脏研磨成粉末，然后与1MLBIOZOL混合。匀浆时组织样品体积一般不要超过BIOZOL体积的10。分离将匀浆样品在室温下孵育15MIN，使样品充分裂解至匀浆液，较透明且无颗粒。按照51（BIOZOL氯仿）的比例（V/V）加入氯仿。盖紧管盖，振荡混匀并将其在冰上孵育15MIN，于4，12,000G离心15MIN。离心后混合物分层上清层，中间层，下层；RNA存在于上清层中。RNA的沉淀将上清层转移到一干净的离心管中，加入等体积冰浴的异丙醇，颠倒
11、振荡混匀，将混合的样品在20条件下孵育20MIN以上，4，12,000G离心10MIN。RNA沉淀通常形成片状沉淀附着于管壁或管底。RNA的洗涤弃去上清，用冰浴的75的乙醇洗涤RNA沉淀一次，按每1ML的BIOZOL至少加1ML的75乙醇的比例加入75乙醇。颠倒洗涤离心管管壁，并旋涡振荡样品，尽可能让沉淀悬浮，4，12,000G离心5MIN，再次去除上清，晾干沉淀。RNA的溶解在操作的最后，适度干燥RNA沉淀（避免过分干燥,那样会降低它的可溶性）。用适量的无RNA酶水或TE溶液来溶解RNA（一般可用50100L无RNA酶的水或TE溶液溶解RNA）。抽提好的RNA，保存于70。222逆转录合成C
12、DNA使用AMV反转录酶（TAKARA，日本）进行CDNA第一链的合成，将反应混和液在室温下放至10MIN后，42反转录1H。反转录反应体系如下模板RNA溶液1L5REVERSETRANSCRIPTASEBUFFER4LDNTPS2LRNASEINHIBITOR05LOLIGOD（T）PRIMER1LAMVREVERSETRANSCRIPTASE（5U/L）05LDEPCH2O11LTOTAL20L223PCR扩增HSP70基因核心序列根据GENBANK上已登陆虹鳟、大西洋鲑等鲑科鱼类HSP70基因的保守片断，设计并合成一对引物正义引物（FHSP70）5ATGTCTAA/CGGGACCAGCA
13、GTGG3反义引物RHSP705TTAGTCAACCT/ACCTCAATGGT3以香鱼反转录CDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物使用1琼脂糖凝胶电泳检测结果。PCR扩增反应体系如下410PCRBUFFER25LDNTPS（25MMEACH）2LFDFR1LRDFR1LCDNA1LTAKARAEXTAQ（5U/L）05LDDH2O17LTOTAL25L反应程序设置如下循环次数温度时间1943MIN34941MIN551MIN721MIN1728MIN14保存224PCR扩增产物的鉴定2241目的片段回收将含有目的片段的琼脂糖凝胶切下，使用小量胶回收试剂盒（ELUTEFAST，中国）进行回收。切
14、下目的胶块，放入15MLEPPENDORF管中。加入E1液450L，5560水浴510MIN至胶块完全溶解。加入E2液10L，混匀立即吸入内套管中，8000RPM离心2MIN。弃去外套管中液体，在内套管中加入500L洗液（WASHBUFFER），8000RPM离心1MIN，重复一次。弃去外套管中的液体，直接套回，8000RPM离心1MIN。取出内套管放入新的EPPENDORF管中，在内套管膜中央加入2050L洗脱液（ELUTEBUFFER）。60水浴5MIN。12000RPM离心1MIN，得到回收产物，20贮存备用。2242连接使用PMD18TVECTOR（TAKARA，日本）进行连接反应，1
15、6连接过夜。反应体系如下SOLUTION5L回收产物5L5PMD18TVECTOR05LTOTAL105L2243大肠杆菌DH5感受态细胞的制备取70甘油保存的DH5菌种20L，接种于20MLLB液体培养基中，37下220250RPM振荡过夜。取上述菌液20L，接种于20MLLB液体培养基中，37下220250RPM振荡254H，至OD8000506。取上述菌液1ML于无菌EPPENDORF管中，盖上盖，4下5000RPM离心5MIN。去上清，吸干管底残留的LB培养基，用4冰浴预冷的CACL2（01M）溶液400L重悬菌体，用移液枪混匀。置于4培养箱，冰浴30MIN。4下4000RPM离心10
16、MIN，彻底去上清，用200LCACL2（01M，预冷）重悬菌体，用移液枪轻轻混匀。置于冰浴27H可用于转化。2244转化使用自制的大肠杆菌DH5感受态细胞进行转化。无菌条件下，取10L连接产物，加入200L大肠杆菌DH5感受态细胞中，用枪头轻轻混匀（冰上操作）。4冰浴30MIN。42精确热激90S。立即转入冰水中冰浴12MIN后，恢复到室温。加入800L无抗生素LB培养基，混匀。将EPPENDORF管置于三角瓶中，37恒温摇床180RPM振荡培养2H。室温下5000RPM离心4MIN，吸去上清900L，余下100L液体重悬菌体。将菌液加入37预热的LB固体培养基（100G/MLCAB），涂布
17、至干。将培养基倒置于37恒温培养箱中，培养1224H。2245重组子的筛选与鉴定无菌条件下，随机挑取4个单菌落分别接种于4个装有1MLLB液体培养基（100G/MLCAB）的EPPENDORF管中。置于37恒温摇床，250RPM振荡培养4H，至对数生长期。进行菌液PCR鉴定，扩增产物使用1琼脂糖凝胶电泳检测。建立PCR反应体系如下10PCRBUFFER25LDNTPS（25MMEACH）2LFDFR1L6RDFR1L菌液1LTAKARAEXTAQ（5U/L）05LDDH2O17LTOTAL25L反应程序如下循环次数温度时间1943MIN34941MIN551MIN721MIN1728MIN14
18、保存225测序实验中的测序工作委托上海英俊生物工程有限公司（中国）完成。226香鱼HSP70基因的生物信息学分析本文中的序列比对均使用VECTORNTISUITE70软件和BLAST工具（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV）进行分析，ORF的查找和核苷酸的翻译在HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV网站的ORFFINDER上完成。对香鱼HSP70基因编码的氨基酸序列与其它鱼类HSP70基因编码的氨基酸序列进行多重比对（表1）。蛋白质基本性质的分析以及蛋白质三维模型的同源建模均使用HTTP/WWWEXPASYORG网站提供的相关生物信息学分析软件和WLVIEWLITE40软件进行。使
19、用CLUSTALX软件对序列进行多重比对以后，再使用MEGA4软件中的邻位相连法完成系统发生树的构建。系统进化树以香鱼以及其他鱼类的HSP70氨基酸序列（表2）作为分析对象。表1分析PAHSP70蛋白用到的其他鱼类HSP70蛋白信息TAB1ANALYSISPAHSP70PROTEINSWITHHSP70PROTEINSINFORMATIONFROMOTHERFISHSPECIES序列名称物种登陆号SSHSP大西洋鲑（SALMOSALAR）BT05877417LSHSP红笛鲷（LUTJANUSSANGUINEUS）HM1592721OMHSP虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）AB196
20、4601POHSP牙鲆（PARALICHTHYSOLIVACEUS）AB0068141ASHSP黑棘鲷（ACANTHOPAGRUSSCHLEGELII）AY7629691PMHSP大菱鲆PSETTAMAXIMAEF1910271RSHSP平鲷RHABDOSARGUSSARBAAY4367861MAHSP团头鲂（MEGALOBRAMAAMBLYCEPHALA）EU6234712CIHSP草鱼CTENOPHARYNGODONIDELLAGU4751461HMHSP鲢HYPOPHTHALMICHTHYSMOLITRIXHM0682961表2PAHSP70系统进化树分析所用氨基酸序列TAB2AMINO
21、ACIDSEQUENCESUSEDINPHYLOGENETICTREEOFPAHSP70序列名称物种登陆号所属科SSHSP大西洋鲑（SALMOSALAR）BT0587741鲑科LSHSP红笛鲷（LUTJANUSSANGUINEUS）HM1592721笛鲷科OMHSP虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）AB1964601鲑科POHSP牙鲆（PARALICHTHYSOLIVACEUS）AB0068141鲆科ASHSP黑棘鲷（ACANTHOPAGRUSSCHLEGELII）AY7629691鲷科PMHSP大菱鲆PSETTAMAXIMAEF1910271鲆科RSHSP平鲷RHABDOSARGU
22、SSARBAAY4367861鲷科MAHSP团头鲂（MEGALOBRAMAAMBLYCEPHALA）EU6234712鲤科CIHSP草鱼CTENOPHARYNGODONIDELLAGU4751461鲤科HMHSP鲢HYPOPHTHALMICHTHYSMOLITRIXHM0682961鲤科EIHSP翘嘴红鲌（ERYTHROCULTERILISHAEFORMIS）EU6939101鲤科CAHSP银鲫（CARASSIUSAURATUSGIBELIO）AY1957441鲤科3结果与分析31香鱼HSP70基因CDNA片段的克隆根据GENBANK上已登陆虹鳟、大西洋鲑等鲑科鱼类HSP70基因的保守片段设计
23、引物。用该引物，以从香鱼肝脏中提取得总RNA反转录获得的CDNA单链为模板，进行PCR扩增，得到了大小约为18002000BP的片段（图1），与预期DNA片段长度一致，将其命名为PAHSP70。8DL2000MAKERPCR产物图1香鱼HSP70基因核心片段扩增电泳图谱FIG1AMPLIFICATIONPROFILESOFHSP70COREFRAGMENTFROMPLECOGLOSSUSALTIVELISLEFTDL2000MAKERRIGHTPCRPRODUCT从扩增产物DH5感受态细胞中，随机挑取转化子，进行PCR鉴定。电泳检测得到了与扩增PCR大小一致的条带。初步表明扩增的PCR产物已转
24、入大肠杆菌中。将阳性克隆送公司测序。测序结果表明PCR扩增产物大小为1956BP，包括完整ORF框，编码651个氨基酸和一个终止子（图2）。起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。2000BP1000BP750BP100BP500BP200BP910图2PAHSP70基因核心片段序列及编码的氨基酸序列起始密码子与终止密码子用方框标出，下划线部分为引物序列FIG2NUCLEOTIDESEPUENCEANDTHEDEDUCEDAMINOACIDSEQUENCEOFPAHSP70THESTARTCODEANDTHESTOPCODEWEREBOXEDPRIMERSEQUENCEWASUNDERLINE
25、D1132香鱼HSP70基因核苷酸序列比对登陆HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV网站，进行核苷酸序列比对（NUCLEOTIDEBLAST），结果显示香鱼HSP70基因与大西洋鲑HSP70基因（序列号BT0587741）同源性高达87，与虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS，序列号NM0011242321）相似度87，与红笛鲷（LUTJANUSSANGUINEUS，序列号为HM1592721）相似度86，与五条鰤（SERIOLAQUINQUERADIATA，序列号为AB4364681）相似度86，与牙鲆（PARALICHTHYSOLIVACEUS，序列号为AF0530591）相似度
26、86，与大菱鲆（PSETTAMAXIMA，序列号为EF1910271）相似度86。这表明实验获得的核苷酸片段正是香鱼的HSP70基因，并且说明HSP70基因在不同鱼类之间序列差异不大，比较保守。33香鱼HSP70基因编码的氨基酸序列多重比对使用VECTORNTISUITE70软件，对香鱼HSP70基因编码的氨基酸序列与其它鱼类HSP70基因编码的氨基酸序列进行多重比对（图3，表1）。结果显示，香鱼HSP70基因编码的氨基酸序列具有典型的HSP70家族签名基序IDLGTTYS序列、IFDLGGGTFDVSIL特征基序、IVLVGGSTRIPKIQK特征基序。250A至262A处为定位序列KKDI
27、SDNKRAVRR。在C端具有两个重复GGMP,以及细胞质特异性调控序列EEVD，并在N端有高度保守的约为44KDA的三磷酸腺苷酶（ATPASE）功能域，基本可以确定其属于HSP70家族。12131415图3PAHSP70蛋白的氨基酸序列与其它鱼类HSP70蛋白序列多重比较。完全相同的氨基酸位点用白色的字体和黑色的背景表示。保守的氨基酸位点用白色的字体和深灰色的背景表示，相似氨基酸的位点用白色的字体和灰色的背景表示，弱相似的氨基酸用黑色的字体和浅灰色的背景表示。非相似的氨基酸用黑色字体和白色的背景表示。方框，方框和表示HSP70的签名序列IDLGTTYS特征基序、IFDLGGGTFDVSIL特
28、征基序、IVLVGGSTRIPKIQK特征基序。方框表示HSP70的定位序列KKDISDNKRAVRR。方框表示GGMP4肽特征基序。方框表示细胞质特异性调控序列EEVD。FIG3MULTIPLEALIGNMENTOFTHEDEDUCEDAMINOACIDSEQUENCESOFPAHSP70WITHHSP70PROTEINSFROMOTHERFISHSPECIES1634香鱼HSP70蛋白的特征分析应用COMPUTERPI/MWTOOL软件（HTTP/WWWEXPASYORG）预测香鱼HSP70蛋白的分子量大小为7122KDA，等电点PI516。使用BLAST软件（HTTP/WWWNCBINL
29、MNIHGOV）以及VECTORNTISUITE70软件的分析表明，PAHSP70与其它鱼类的HSP70有很高的相似性（94）（表3）。PAHSP70与大西洋鲑（SALMOSALAR）、红笛鲷（LUTJANUSSANGUINEUS）、牙鲆（PARALICHTHYSOLIVACEUS）、团头鲂（MEGALOBRAMAAMBLYCEPHALA）、鲢（HYPOPHTHALMICHTHYSMOLITRIX）、草鱼CTENOPHARYNGODONIDELLA、斑马鱼（DANIORERIO）HSP70蛋白的相似性均在94以上，从而推测PAHSP70属于HSP70家族。表3PAHSP70蛋白与其他鱼类HSP
30、70蛋白同源性比较TAB3HOMOLOGYCOMPARISONOFPAHSP70PROTEINWITHHSP70PROTEINSFROMOTHERFISHSPECIES登陆号物种相似性NP0011330791大西洋鲑（SALMOSALAR）94ADK889041红笛鲷（LUTJANUSSANGUINEUS）94BAD051361牙鲆（PARALICHTHYSOLIVACEUS）94ACC939932团头鲂（MEGALOBRAMAAMBLYCEPHALA）94ACJ035951鲢（HYPOPHTHALMICHTHYSMOLITRIX）94ACJ035961草鱼CTENOPHARYNGODONID
31、ELLA94NP0011038731斑马鱼（DANIORERIO）9435香鱼HSP70蛋白二级结构分析用HTTP/WWWEXPASYORG网站的SECONDARYSTRUCTURETOOLS进行PAHSP70蛋白二级结构预测（图4）。PAHSP70二级结构预测显示，有275个氨基酸参与形成螺旋（ALPHAHELIX），占所有氨基酸的4163，有180个氨基酸参与形成伸展链（EXTENDEDSTRAND），占总氨基酸的2765，有89个的氨基酸参与形成转角（BETATURN），占总氨基酸的1367，另有215个氨基酸参与形成无规卷曲（RANDOMCOIL），占总氨基酸的3303。1020304
32、0506070|MSKGPAVGIDLGTTYSCVGVFQHGKVEIIANDQGNRTTPSYVAFTDSERLIGDAAKNQLAMNPTNTVFDACCCCEEEEEECCCCCHEEEEECTTCEEEEECCCCCCCCCEEEEECTTCEEEHHHHHHHHCCCTTCHEEHHKSLIGRRFDDGVVQSDMKHWPFEVINDNTRPKVQVEYKGETKSFYPEEISSMVLVKMKEIAEAYLGKTVNHHHHTCCCCCCHHHHHHTCCCEEEECCCCCEEEEECCCCCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHNAVVTVPAYFND
33、SQRQATKDAGTISGLNVLRIINEPTAAAIAYGLDKKVGAERNVLIFDLGGGTFDVSILHEEEECCCCCCTTHHHHHHHHHHHHHHEEEEEECCCCHHHHHHHCCCCCCCCCEEEEEEETTCCEEEEEETIEDGIFEVKSTAGDTHLGGEDFDNRMVNHFIAEFKRKYKKDISDNKRAVRRLRTACERAKRTLSSSTQAEECTTEEEEEECTTCCEECCCCCHHHHHHHHHHHHHHTCCCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCSIEIDSLYEGVDFYTSITRARFEELNADLFRG
34、TLDPVEKSLRDAKMDKGQVHDIVLVGGSTRIPKIQKLLHEEEHHHCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHTTCCHTCCCEEEEETCCCCCCHHHHHHQDFSNGKELNKSINPDEAVAYGAAVQAAVLSGDKSENVQDLLLLDVTPLSLGIETAGGVMTVLIKRNTTIHHHHTTCCCCCCCCTTHHHHHHHHHHHHHHHTCCCCCCCHEEEEECCCCCEEEECCCCHEEEEECTTCCCPTKQTQTFTTYSDNQPGVFIQVYEGERAMTKDNNLLGKFELTGIPPAPRGVP
35、QIEVTFDIDANGIMNVSA17CCCCCEEEEECCTTCCEEEEEEETTCCCCCCCCHHHCEEEEECCCCCCCCCCEEEEEEEECTTTEEEEEEVDKSTGKENKITITNDKGRLSKEDIERMVQEAEKYKAEDDVQRDKVSSKNSLESYAFNMKSTVEDEKLTGHCCCCCCCCEEEEECCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHKISEEDKTKILEKCNEVISWLDKNQTAEKEEYEHQQKELEKVCNPIITKLYQGAGGMPGGMPEGMPGGFP
36、HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHTTTCCCCCCCCCCCCCCCGAGGAAPGAGGSSGPTIEEVDCCCCCCTTTTCCCCCEEEHHHSEQUENCELENGTH651图4PAHSP70蛋白二级结构H表示螺旋，E表示延伸链，T表示转角，C表示无规卷曲FIG5SECONDARYSTRUCTUREOFPAHSP7036香鱼HSP70蛋白三维结构分析为了进一步了解PAHSP70蛋白的特征，通过使用SWISSMODELSCHWEDEETAL2003同源建模的方法，得到了香鱼PAHSP70蛋白的三维模型（图5）。发
37、现它具有酶的典型三级结构特征，为EF型，又称手型结构。中间形成一个裂沟（CLEFT）用以结合底物和发生催化反应，是酶的重要结构特点。典型的HSP70由两部分结构组成一部分主要由一个N端高度保守的约为44KDA的三磷酸腺苷酶（ATPASE）功能域；另一部分由一个分子量约为25KDA的C端区域组成。N端ATPASE功能域的结构类似于凝聚素和己糖激酶，主要由两个大的球形亚功能域I和II组成，其间被一个深的中央裂缝分开，并通过2个交叉的A螺旋相连接；亚功能域和连接的A螺旋和裂缝的底部形成一个核苷酸及所需的MG2和K的结合区域，核苷酸经过与两个磷酸结合环和一个疏水腺苷的相互作用而定位在活性部位。C端区域
38、分为一个保守的15KDA多肽结构功能域，一个不保守的靠近C端的10KDA可变区功能域和C端最末端的基序21。18图5PAHSP70蛋白三维结构模型FIG5TERTIARYSTRUCTUREOFPAHSP70PROTEIN37PAHSP70基因系统进化树分析使用CLUSTALX软件和MEGA4软件，通过NEIGHBORJOININGNJ的方法构建了香鱼HSP70蛋白的系统进化树（图6）。香鱼与大西洋鲑（SALMOSALAR）和虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）形成一个分支，鲷科形成了一个分支，鲤科组成了一个分支，值得注意的是属于鲤科的草鱼CTENOPHARYNGODONIDELLA却独
39、立出一支。签名序列定位序列签名序列N端C端19图6PAHSP70基因系统进化树FIG6PHYLOGENETICTREEOFPAHSP70分支旁的数字为BOOTSTRAPTEST1000次的置信度标尺表示2的核苷酸序列差异NUMBERSNEARTHEBRANCHESAREBOOTSTRAPPROBABILITYVALUESWITH1000REPLICATESSCALEBARCORRESPONDSTO2DIFFERENCEINNUCLEOTIDESEQUENCE4结论用PCR扩增的方法，克隆得到了香鱼的HSP70基因。该基因大小为1956BP，包括完整ORF框，编码651个氨基酸和一个终止子。起始
40、密码子为ATG，终止密码子为TAA。将其命名为PAHSP70。PAHSP70与其它鱼类HSP70基因同源性达到87以上，与其他鱼类HSP70蛋白同源性也很高，证明该序列为香鱼HSP70基因序列。获得的PAHSP70序列推断的氨基酸序列具有HSP70的签名序列IDLGTTYS特征基序、IFDLGGGTFDVSIL特征基序、IVLVGGSTRIPKIQK特征基序；HSP70的定位序列KKDISDNKRAVRR；靠近C端的GGMP4肽特征基序，细胞质特异性调控序列EEVD。20参考文献1王凤昀香鱼的生物学特性和养殖技术J河北渔业,2000,100213142李明云,丁夭喜,竺俊全,等我国香鱼的研究现
41、状及增养殖前景J宁波大学学报理工版,1999,12485903谷文萍热休克蛋白70研究进展J国外医学神经病学神经外科学分册,1999,26257594万方菊,王纪亭,等剑尾鱼热应激蛋白HSP70CDNA片段的克隆与序列分析J大连水产学院学报,2007,221155李三强,崔旭红,等热休克蛋白70研究的现状及展望J中华实用中西医杂志,2009,222462476林亚秋,郑玉才,吉红草鱼HSP70基因CDNA部分序列克隆及其组织表达差异J淡水渔业2009,39467717HES,LIANGXF,LIRQ,ETALMOLECULARCHARACTERIZATIONOFHEATSHOCKPROTEIN
42、70GENESINTHELIVEROFTHREEWARMFRESHWATERFISHESWITHDIFFERENTIALTOLERANCETOMICROCYSTINLRJJBIOCHEMMOLECULARTOXICOLOGY,2010,2452933028MEIMARIDOUE,CHAPPLEJPFROMHATCHINGTODISPATCHINGTHEMULTIPLECELLULARROLESOFTHEHSP70MOLECULARCHAPERONEMACHINERYJMOLENDOCRINOL,2009,421199ALIK,DORGAIL,ABRAHAMM,ETALTISSUEANDSTRE
43、SSORSPECIFICDIFFERRENTIALEXPRESSIONOFTWOHSC70GENESINCARPJBIOCHMICALANDBIOPHYSICALRESEARCHCOMUNICATIONS,2003,307350350910MOLINAA,BIEMARF,MULLERF,ETALCLONINGANDEXPRESSIONANALYSISOFANINDUCIBLEHSP70GENEFROMTILAPIAFISHJFEDERATIONOFEUROPEANBIOCHEMICALSOCIETIESLETTERS,2000,474151011KOTHARYRK,BURGESSEA,CAND
44、IDOEPMTHEHEATSHOCKPHENOMENONINCULTUREDCELLSOFRAINBOWTROUTHSP70MRNASYNTHESISANDTURNOVERJBIOCHIMICAETBIOPHYSICAACTAGENESTRUCTUREANDEXPRESSION,1984,783213714312ARAIA,NARUSEK,MITANIH,ETALCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFCDNASFOR70KDAHEATSHOCKPROTEINSHSP70FROMTWOFISHSPECIESOFTHEGENUSORYZIASJJAPANESEJOURNALOFG
45、ENETICS,1995,70342343313孙勇,章力,李慕婵,吴任,等克氏原螯虾一种诱导型HSP70基因克隆及分析J水生生物学报,2009,33462763514张君岚,黄善生,凌亦凌,等不同家族热休克蛋白的生理功能及病理意义J中国病理生理杂志,1998,14554955315ELLISRJTHEMOLECULARCHAPERONECONCEPTJSEMINCELLBIOL,1990,111916GABAIVL,MERIINAB,MOSSERDD,ETALHSP70PREVENTSACTIVATIONOFSTRESSKINASESANOVELPATHWAYOFCELLULARTHERMO
46、TOLERANCEJBIOLCHEM,1997,272291803318037717武斌,李宗芸,杨素春,张迪几种热激蛋白在细胞凋亡信号通路中的调控作用J中国生物化学与分子生物学报,2011,11918THOMASK,ANKEGR,NIKOLAJH,AJAYKM,OLEDO,ETALHSP70STABILIZESLYSOSOMESANDREVERTSNIEMANNPICKDISEASEASSOCIATEDLYSOSOMALPATHOLOGYJNATURE,2010,46354955319JOCELYNEF,JANINAH,ANNIKAS,ETALSTRUCTURALANALYSISOFTHER
47、IBOSOMEASSOCIATEDCOMPLEXRACREVEALSANUNUSUALHSP70/HSP40INTERACTIONJTHEJOURNALOFBIOLOGICALCHEMSTRY,2010,2853227323420PAROMITAD,AKHILG,SANJIBKMHEATSHOCKPROTEIN70EXPRESSIONINDIFFERENTTISSUESOFCIRRHINUSMRIGALAHAMFOLLOWINGHEATSTRESSJAQUACULTURERESEARCH,2005,3652552921李莉萍,陈明,等奥尼杂交罗非鱼及其亲本热休克蛋白HSP70基因CDNA序列克隆与比较分析J上海海洋大学21学报,2009,184391397
