1、本科毕业设计（20_届）小硅藻培养过程中脂类代谢物的变化研究所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月2目录1引言12实验材料和方法121实验材料1211实验藻种1212培养基1213仪器和试剂122实验方法2221小硅藻的培养2222小硅藻细胞密度的测定2223脂类代谢物的提取2224色谱和质谱条件2225数据处理33实验结果331小硅藻生长周期试验的指纹识别432小硅藻生长周期代谢指标物的定性分析633小硅藻周期试验过程中脂类代谢指标物的变化94讨论95总结9致谢错误未定义书签。参考文献10摘要为了研究小硅藻（NITZSCHIACLOSTERIUMFMINUTISSIMA
2、）在培养过程中脂类代谢物的变化，利用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（UPLCQTOFMS），电喷雾电离源分别在正负离子模式下，对小硅藻对数期和稳定期的脂类代谢物进行测定，并通过SIMCAP软件进行主成分分析和正交偏最小二乘法辨别分析。结果表明，从对数生长期到稳定期，三酰甘油及溶血LYSODGDG、LYSOSQDG均呈现增加的趋势；而PC、MGDG、DGDG、SQDG、PG均呈现降低的趋势。这些脂类代谢物的变化，不仅可以用来判别微藻的脂类合成途径，而且可以科学确定出脂类、能源积累的阶段，从而为微藻的能源开发提供理论依据。关键词小硅藻；生长周期；脂类代谢物；四极杆飞行时间质谱；超高效液相色谱AB
3、STRACTTHEAIMOFTHISSTUDYWASTOINVESTIGATEHOWTHELIPIDMETABOLITESCHANGEINNITZSCHIACLOSTERIUMFMINUTISSIMADURINGTHEGROWTHPHASEITWASSTUDIEDBYTHEULTRAPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHYQUADRUPOLETIMEOFFLIGHTMASSSPECTROMETRYUPLCQTOFMSUSINGELECTRONSPRAYINGIONIZATIONWITHPOSITIVEANDNEGATIVEMODE,INANEFFORTTOFINDPOTE
4、NTIALMETABOLITEBIOMARKERSDURINGTHEGROWTHAFTERTHEUPLCQTOFANALYSIS,PRINCIPALCOMPONENTSANALYSISPCAANDORTHOGONALPROJECTIONTOLATENTSTRUCTURESDISCRIMINANTANALYSISOPLSDAWEREPERFORMEDUSINGTHESIMCAPSOFTWAREFORMARKERSELECTIONANDIDENTIFICATIONACCORDINGTOTHEDATA,FROMTHEEXPONENTIALPHASETOSTATIONARYPHASE,TAG,LYSO
5、DGDGANDLYSOSQDGWERESHOWEDATRENDOFINCREASINGHOWEVER,PC,MGDG,DGDG,SQDGANDPGWEREDECREASEDTHESECHANGESOFMETABOLITEBIOMARKERSWEREATTRIBUTEDTODETERMINETHELIPIDSYNTHESISPATHWAYOFMICROALGAEMOREOVER,ITCANBEUSEDTODETERMINETHEENERGYACCUMULATIONPHASESCIENTIFICALLYANDPROVIDETHETHEORETICALBASISOFENERGYDEVELOPMENT
6、KEYWORDSNITZSCHIACLOSTERIUMFMINUTISSIMAGROWTHPHASELIPIDOMICSQUADRUPOLETIMEOFFLIGHTMASSSPECTROMETRYULTRAPERFORMANCELIQUIDCHROMATOGRAPHY11引言海洋微藻是海洋生态系统中最重要的自养生物，也是最主要初级生产者，在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起着极其重要的作用。海洋微藻作为优良的天然饵料被广泛应用于水产养殖，是海水仔鱼、虾蟹贝等水产经济动物幼体的主要食源，其产生的一些多不饱和脂肪酸（PUFA），特别是EPA，205（N3）和DHA，226（N3），其含量直接关系
7、到仔鱼及幼体的存活和生长发育1。海洋微藻中的小硅藻（NITZSCHIACLOSTERIUMFMINUTISSIMA），也称小新月菱形藻，在分类上属于硅藻门，细胞呈纺锤形。个体小、繁殖快、脂肪含量高，环境适应能力强。小硅藻还含有高度不饱和脂肪酸EPA，可作为理想的保健食品，也可以作为甲壳类、双壳类和仔鱼的饵料从而在海水养殖业中占有重要地位2。微藻的饵料价值与许多因素有关，包括细胞大小、细胞壁的可消化程度和细胞内的生化组成特别是脂类的组成和含量，尤以后者最为重要3,4。先前的研究认为不饱和脂肪酸的含量是影响微藻饵料价值的最主要因子，但脂类代谢物作为营养物质和供能物质，对养殖生物的生长发育同样起决定
8、作用5。植物细胞体内含中性脂和极性脂，极性脂一般为海洋微藻的主要脂类，大部分为磷脂和糖脂；中性脂主要为三酰基甘油，它作为脂肪酸的一种储存形式，在细胞分裂、能量代谢、维持膜的稳定性、生物合成及其他许多生理过程中起作用，为主要的储存脂类6,7。目前有研究结果表明，微藻不同生长阶段（对数期和稳定期），会造成细胞内总脂含量和脂肪酸组成的变化8,9。而海洋微藻的脂类含量和组成除了决定于藻种本身的遗传因素外10，还受其他环境条件，如温度11,12、光照13，盐度14等的影响。培养基的种类也会对微藻的脂肪酸组成产生影响15，特别是培养液中氮源的影响更为显著16。由于国内外学者关于环境因子对微藻脂类积累影响的
9、研究主要集中在营养盐成分、光强、温度等因素上，而生长周期内脂类的积累，特别是极性脂积累变化的研究较少。因此本文以小硅藻为研究对象，研究其生长周期不同阶段脂类代谢物的变化，从而科学确定出脂类、能源积累的阶段，为小硅藻的大规模培养和能源开发提供理论依据。2实验材料和方法21实验材料211实验藻种小硅藻（NITZSCHIACLOSTERIUMFMINUTISSIMA），由宁波大学海洋生物工程重点实验室微藻室提供。212培养基小硅藻的培养使用F/2培养液。其基本配方见表1。213仪器和试剂ACQUITY超高效液相色谱系统，色谱柱ACQUITYUPLCBEHC8（17M，100MM21MM），QTOFP
10、REMIER高分辨四极杆和飞行时间质谱仪，MASSLYNX41数据处理系统均为美国WATERS公司产品；超纯水系统（法国MILLIPORE公司）；GXZ智能型光照培养箱（宁波江南仪器厂）；LDZX50FB高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；TDLSO2B飞鸽低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TP300超声波清洗机（北京泰拓公司）；漩涡混合器（上海精科实业公司）；WO系列恒温水浴锅、旋转蒸发器均为上海中顺生物科技公司产品；SHZD（）循环水式真空泵（义乌平华仪器公司）等。抗氧化剂2,6二特丁基对甲酚（BHT，999）；色谱纯氯仿、甲醇、乙腈、甲酸均为美国SIGMAALDRICH公司产品；纯
11、水来源由超纯水系统制备。222实验方法221小硅藻的培养用于微藻培养的海水均经脱脂棉过滤、煮沸消毒，所有容器均高温灭菌。培养器皿为3000ML三角烧瓶，培养3个平行样。往瓶中加入2000ML培养液（11000），200ML藻液，用纸盖好瓶口，用棉绳扎紧。培养条件是在光照培养箱中，明暗周期为12H12H；光照方式日光灯；光照强度约2500LX；温度为202。表1F/2培养液配方营养盐成分工作液（MG/L）母液（G/L）NANO37575NAH2PO4H2O55NA2SIO39H2O2020NA2EDTA436436FECL36H2O316316CUSO45H2O001001ZNSO47H2O00
12、230023COCL26H2O00120012MNCL24H2O018018NA2MOO42H2O007007维生素B10110301103维生素B120510305103生物素0510305103222小硅藻细胞密度的测定每天振摇2次，每天定时取样一次，取500ML充分摇匀的藻液，加入12滴5（V/V）的福尔马林溶液固定，然后取一滴藻液置于血球计数板上，在光学显微镜下对藻细胞进行计数。每一批次做3个平行样，取其平均值，然后换算成相应的藻细胞密度（藻细胞密度藻数104个/CM3）。作培养时间（天）与藻细胞密度的关系图，得到小硅藻的生长曲线（图1）。223脂类代谢物的提取取不同生长阶段（对数期和
13、稳定期）一定体积的藻液，40004800R/MIN离心10MIN，再用消毒淡水清洗23次，经冷冻干燥，放入玻璃离心管中低温（4）保存。将干燥的藻泥采用氯仿甲醇（V/V，11）提取法得到藻中的脂类代谢物。通过旋转蒸发，干燥后充入氮气，于20贮存待用。所有溶液均加入BHT（50MG/L）。224色谱和质谱条件色谱条件流动相为85乙腈/甲醇（V/V，21）15异丙醇（V/V）溶液（A）和水（B），进样1L，流速025ML/MIN，柱后14分流进入质谱。流动相中加入01甲酸和005MOL/L的甲酸钠。采用梯度洗脱时洗脱梯度为B从在8MIN内从初始5升至70，在12MIN内从70升至90，在8MIN内从
14、90升至95，保持14MIN，在1MIN升至100保持3MIN，最后在1MIN内降到5然后平衡11MIN。质谱条件使用电喷雾电离源（ESI）进行分析，脱溶剂的氮气流速为400L/H，脱溶剂的温度为250，离子源的温度为120，锥孔反吹氮气为0。TOF离子飞行的方式为V模式，四极杆的扫描范围为501200。3目标离子的精确质量数由外标物亮脑啡肽进行锁定。正离子模式下，毛细管电离电压30KV，负离子模式下，毛细管电离电压26KV；取样锥孔电压为3580V，碰撞室能量看分析目的不同采用560V不等。225数据处理原始数据由美国WATERS公司研发的MASSLYNX41数据处理系统采集，再通过MARK
15、ERLYNX管理系统进行处理，从而建立每一样品对应保留时间和质荷比的峰数量以及归一化的峰强度数据库，然后将这个数据库导入SIMCAP分析软件，对数据进行正交偏最小二乘法分析（OPLSDA）和主成分分析（PCA）。采用MASSFRAGMENT分析软件、HUMANMETABOLOMEDATABASE数据库检索等多种技术手段，对候选生物标记物进行结构解析。I020040060080010001200140013579111315171921232527天个/ML系列1II0200400600800100012001400160013579111315171921232527天个/ML系列1III02
16、00400600800100012001400160013579111315171921232527天个/ML系列1图13个平行样的小硅藻生长曲线3实验结果431小硅藻生长周期试验的指纹识别为了使实验结果可靠和统计正确，减小误差，每个小硅藻样品重复进样三次。为了得到每一个样品的信息，对样品在正负离子模式下进行液相色谱质谱（LCMS）分析。每个样品进样数为六次，分别是电喷雾正离子模式分析三次和负离子模式分析三次。利用UPLCQTOFMS分析系统，使小硅藻的脂类代谢物在液相色谱柱上发生分离（图2）。图2小硅藻样品的总离子流图。AESI扫描；BESI扫描经MARKERLYNX处理，小硅藻样品可以分别
17、得到8398（正离子模式）、3067个（负离子模式）信号峰，将这些信号峰通过归纳处理，进行主成分分析，得到组小硅藻样品在正负离子模式下的PCA得分图（图3）。图上每一个点代表一个样品，每组样品用圈隔开以方便观察，从图中可以直观在看到不同生长时期小硅藻样品的差异性17。根据统计学原理，通过SIMCAP分析软件对样品进行正交偏最小二乘法（OPLSDA）分析。图4是基于正交偏最小二乘法获得的第一组（7天后和9天后收集的为第一组）和第二组（17天后、24天后和27天后收集的为第二组）小硅藻样品数据分析结果的S载荷图（SLOADINGPLOT）。在S载荷图上，每一个点为一个数据对，其表示了该物质的质量数
18、和保留时间。中间的横轴表示可变量，数据对离0越远，说明样品的差异性越大。纵轴表示每个样品间的相关性，数据对离0越远，说明样品的相关性越好。所以，图中两端的数据对表示了样品中可信度最高的特征离子。然后根据变异权重参数（VIP）在正负离子模式下分别提取前20个特征离子（表2）作为潜在标志物进行定性分析。AB5图3小硅藻前二主成分的PCA得分图。A正离子扫描模式ESISCAN；B负离子扫描模式ESISCAN；17天后收集小硅藻样品，29天后收集，317天后收集，424天后收集，527天后收集。图4基于正偏交最小二乘法获得的第一组和第二组小硅藻样品的S载荷图。A正离子模式下S载荷图；B负离子模式下S载
19、荷图表2对第一组和第二组小硅藻样品进行正偏交最小二乘法分析后相对第二组比较获得的潜在生物标志物保留时间和质荷比TRMIN_M/Z变异权重参数VIP相关性CORRELATION协方差COVARIANCE变化倍数FACTOROFCHANGE定性结果IDENTIFICATIONRESULTESI2486_9175810198440764000425266UNKNOWN1241_50039421428007360001982472UNKNOWN3241_54747031335607870001682652823和818的碎片离子续表2AB6保留时间和质荷比TRMIN_M/Z变异权重参数VIP相关性CO
20、RRELATION协方差COVARIANCE变化倍数FACTOROFCHANGE定性结果IDENTIFICATIONRESULTESI3439_54948561256008450001812038825和820的碎片离子1865_7934827118970914000234438MGDG205/163,MNA3444_8256958117030948000252698TAG161/160/161,MNA3442_82074131143108850001781717TAG161/160/161,MNH43245_8236786108520955000216770TAG161/161/161,MN
21、A3692_82771021011209380001871002TAG160/161/160,MNA3246_8187259985108050001283136TAG161/161/161,MNH43405_7996789971109060001571386TAG140/161/160,MNA1044_520361189370615000072350UNKNOWN3216_7976613875208840001371187TAG161/140/161,MNA1858_307223684730954000173488793的碎片离子3066_871677284030908000136484TAG
22、161/161/205,MNA2038_804573382430805000155673UNKNOWN3732_8537232807008930001273056TAG161/160/181,MNA1937_795499780490971000173890MGDG205/162,MNA3442_5474603789708830001251709825和820的碎片离子3692_8227536774208170001072689TAG160/161/160,MNH4ESI1150_55528221872560851160007147926411204717LYSOSQDG160,MH1257_3
23、01211413749507464770003735113554258242UNKNOWN2060_76346151096120842630002973652286543704SQDG161/140,MH1054_553264910764907895270004061043789037065LYSOSQDG161,MH1866_81548831002208548240002264153685971551MGDG205/163,MHCOOHH2222_79149037986870647848000196484189099427SQDG161/160,MH2185_7654723767686069
24、31360002693041698555011SQDG140/160,MH1944_667400576596109645070003160425664915156LYSOSQDGHOC180,MH1326_25321257515506927960002297767315399099UNKNOWN2123_76546207422360880014000344893493343809PG205/161,MH2320_719480069704609521010003336665727478237PG161/160,MH1866_301213563945084195300013757531378073
25、96815的碎片离子1056_65135236262620833527000233476922522907LYSODGDG161,MH1051_39713185534708631090002294116467724979651的碎片离子1946_817510152847109394490001993129697889677MGDG205/162,MHCOOHH1865_24918495073208438810001096453121221255815的碎片离子1981_76249654902840931417000193674195511469PC205/161,MCH3128_1540156
26、4842670823186000159974156890462UNKNOWN124_112990346250506680910001613412136970579UNKNOWN1253_62542034596290681190001155953691747733UNKNOWN第一组为小硅藻7天和9天后取样样品；第二组为小硅藻17天，24天和27天取样样品。32小硅藻生长周期代谢指标物的定性分析7根据以上提取出的前20个变量离子的M/Z比值的精确质量数（质量相对误差小于5PPM）得到其可能的元素组成，在互联网上提供的免费LIPIDMAPS库（HTTP/WWWLIPIDMAPSORG），HMDB库
27、（HTTP/WWWHMDBCA）和METLINE库（HTTP/METLINSCRIPPSEDU）里进行搜索，与标准品的色谱行为和二级质谱数据进行比对进行最终定性。对于前20个变量离子中的绝大部分离子为三酰甘油（TAG）、二酰甘油硫代糖脂（SQDG）、硫代溶血硫代糖脂（LYSOSQDG）和单半乳糖甘油二酯（MGDG），由于无法买到所有的标准品，主要根据其M/Z比值的精确质量数和二级质谱数据，根据脂类物质的质谱裂解规律进行最终定性。比如图2中保留时间为3444MIN、ESI模式下M/Z为8256958代谢物离子，根据正离子扫描模式下的TIC图中对应保留时间处的质谱（图5），可确定出此分子对应的MH
28、（M/Z8037138）、MNA（M/Z8256958）、MNH4（M/Z8206786），故此标志物的分子量为8027060，而其MH的精确M/Z为8037138。误差允许001DA范围内在HMDB库中进行检索，可得到8个可能的吻合物，其中有6个为三酰甘油。这些物质有着不同的酰基脂肪酸组成，在高能量下会产生不同的碎片离子，所以进一步考察目标代谢物的二级质谱行为（图6）正离子模式下产生M/Z221和M/Z219，M/Z237和M/Z239，M/Z549和M/Z547以及M/Z571和M/Z569碎片离子符合TAG在正离子模式下的裂解规律18，这些碎片离子表明这个三酰甘油的三个脂肪酰基分别为16
29、0、161和161，而正离子模式下M/Z5474727离子信号比M/Z5494859离子信号低，同时M/Z5694592离子信号比M/Z5714629离子信号低；根据一定碰撞能量下SN2位酰基比SN1和SN3位酰基不容易断裂的规律18，得出SN2是160而SN1和3位是161，最终可确定此代谢物为TAG（161/160/161）。M/Z10015020025030035040045050055060065070075080085090095010001050110011500100ES5494928547472252145651039518144981614902712372078413262
30、33112438453612082570398207446550497655149637996801575505957651515775165663461868544998267023827703285171388527209908818591081559617607102967611189900910977321图5保留时间3444MIN处的ESIMS图再举个例子，比如图2中保留时间为1946MIN、ESI模式下M/Z为7954997代谢物离子，根据正、负离子扫描模式下的TIC图中对应保留时间处的质谱（图7），可确定出此分子对应的MNAM/Z7954997、MHM/Z7715066和MHCO
31、OHHM/Z8175101，故此标志物的分子量为7725099。误差允许5PPM范围内在METLINE库中进行检索，可得到1个可能的吻合物（183/184MGDG）。进一步考察目标代谢物的二级质谱行为（图8）正离子模式下M/Z243的存在预示此物质有一个半乳糖头部，同时8并未找到405的离子，说明物质确实是MGDG19，负离子模式下丰度最强的为M/Z2511947和3012126，正离子模式下丰度最强的为M/Z4932767和5432953（为MGDG脂肪酰基基团作为羧酸的中性丢失而产生的离子），表明这个单半乳糖甘油二酯的两个脂肪酰基分别为162和205，而正离子模式下M/Z493276离子信
32、号比M/Z5432953离子信号强，根据在各碰撞能量（580V）碰撞下MNAR1COOH的强度总是高于MNAR2COOH的强度的规律19，得出SN1是205而SN2位是162，最终可确定此代谢物为MGDG（205/162）。图6MNAM/Z8256958的ESIMS2图图7保留时间1946MIN处的ESIMS图根据以上定性过程，剔除重复的信息（正负离子模式下均排在前20位的同一物质，同一离子模式不同9离子化状态的同一物质），在获得的潜在生物标志物中，最终鉴定出2种MGDG，1种LYSODGDG，1种PC，3种SQDG，3种LYSOSQDG、2种PG、7种TAG，另外9种化合物未鉴定出。（表2）
33、图8MNAM/Z7954997和MHCOOHHM/Z8175101的ESIMS2图33小硅藻周期试验过程中脂类代谢指标物的变化表2中相关系数均是相对2组的结果，正值表示与第二组样品正相关即生长过程中该代谢物呈现增加的趋势，而负值表示与第一组样品正相关即生长过程中该代谢物呈现减少的趋势。可见，从分布趋势看，随时间的增长，三酰甘油及溶血LYSODGDG、LYSOSQDG均呈现增加的趋势；而PC、MGDG、DGDG、SQDG、PG均呈现降低的趋势。4讨论比较各光合膜脂分子酰基可以发现，所有光合膜脂分子的SN2位均为C16的脂肪酸，此类由位于质体的原核生物合成途径合成。同时，TAG第三条链主要是C16
34、，也说明其主要是通过植物原核途径合成的。从对数期到稳定期，极性脂（主要是光合膜脂）含量均下降，而中性脂（TAG）的含量明显升高，说明在这个过程中光合作用效率降低，多余的能量转化成三酰甘油储存起来。细胞生长过程中，后期由于营养物质的消耗、代谢产物的生成使培养环境不利于自身生长，溶血LYSODGDG、LYSOSQDG的增长可能与清除体内自由基有关。5总结本实验以海洋微藻小硅藻（NITZSCHIACLOSTERIUMFMINUTISSIMA）为研究材料，以脂类代谢物为主要的研究对象，用以上建立的微藻光合作用膜脂的LCMS分析方法作为基本分析手段，在小硅藻生长周期过程中，对小硅藻的脂类代谢物的变化规律
35、进行研究。结果表明，从对数生长期到稳定期，三酰甘油及溶血10LYSODGDG、LYSOSQDG均呈现增加的趋势；而PC、MGDG、DGDG、SQDG、PG均呈现降低的趋势。参考文献1蒋霞敏,郑亦周14种微藻总脂含量和脂肪酸组成研究J水生生物学报,2003,27032432462曹春晖,孙世春,麦康森氮浓度对四株海洋绿藻总脂含量和脂肪酸组成的影响J海洋湖沼通报,20060379843REITANKI,RAINUZZOJRAREVIEWOFTHENUTRITIONALEFFECTSOFALGAEINMARINEFISHLARVAEJAQUACULTURE,1997,1552072214BROWNM
36、R,JEFFREYSWNUTRITIONALPROPERTIESOFMICROALGAEFORMARICULTUREJAQUACULTURE,1997,1513153315LEONARDOSN,LUCASANTHENUTRITIONALVALUEOFALGAEGROWNUNDERDIFFERENTCULTURECONDITIONSFORMYTILUSEDULISLLARVAEJAQUACULTURE,2000,1823013156俞建江,李荷芳,周汉秋10种海洋微藻总脂、中性脂和极性脂的脂肪酸组成J水生生物学报,1999,23054814877石娟,潘克厚不同培养条件对微藻总脂含量和脂肪酸组成
37、的影响J海洋水产研究,2004,250679838李文权,廖启斌,李芊等3种海洋微藻生长期脂肪酸组成研究J海洋环境科学,2002,21210139MAGEDPMANSOUR,JOHNKVOLKMAN,SUSANIBLACKBURNTHEEFFECTOFGROWTHPHASEONTHELIPIDCLASS,FATTYACIDANDSTEROLCOMPOSITIONINTHEMARINEDINOFLAGELLATE,GYMNODINIUMSPINBATCHCULTUREJPHYTOCHEMISTRY,2003,6314515310VAZHAPPILLYR,CHENFEICOSAPENTAENOIC
38、ACIDANDDOCOSAHEXAENOICACIDPRODUCTIONPOTENTIALOFMICROALGAEANDTHEIRHETEROTROPHICGROWTHJJAMOILCHEMSOC,1998,75339339711蒋霞敏温度、光照、氮含量对微绿球藻生长及脂肪酸组成的影响J海洋科学,2002,0891212CJZHU,YKLEE,TMCHAOEFFECTSOFTEMPERATUREANDGROWTHPHASEONLIPIDANDBIOCHEMICALCOMPOSITIONOFISOCHRYSISGALBANATK1JJOURNALOFAPPLIEDPHYCOLOGY,1997,9
39、45145713曹春晖,孙世春,麦康森等光照强度对四株海洋绿藻总脂含量和脂肪酸组成的影响J生态学报,2010,092347235314缪锦来,王波,阚光锋等环境因子对2种南极绿藻脂肪含量和脂肪酸组成的影响J海洋学,2005,0141015梁英,麦康森,孙世春等不同培养基对筒柱藻CYLINDROTHECAFUDIFORMIS生长及脂肪酸组成的影响J海洋湖沼通报,2000,311606716REITANKI,RAINUZZOJR,OLSENYEFFECTOFNUTRIENTLIMITATIONONFATTYACIDANDLIPIDCONTENTOFMARINEMICROALGAEJJPHYCOL1
40、9943097297917LUDDIA,STRAZZAM,CARBONEMETALGALACTOSYLCERAMIDASEDEFICIENCYCAUSESSPERMABNORMALITIESINTHEMOUSEMODELOFGLOBOIDCELLLEUKODYSTROPHYJEXPCELLRES,2005,3041596818FONGFUHSU,JOHNTURKSTRUCTURALCHARACTERIZATIONOFTRIACYLGLYCEROLSASLITHIATEDADDUCTSBYELECTROSPRAYIONIZATIONMASSSPECTROMETRYUSINGLOWENERGYCOLLISIONALLYACTIVATEDDISSOCIATIONONATRIPLESTAGEQUADRUPOLEINSTRUMENTJJAMSOCMASSSPECTROM,1999,10,58759919徐继林,陈德莹,严小军等超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱对混合光合作用糖脂的分析J分析化学,2009,374511516
