1、本科毕业设计（20届）雨生红球藻色素分析所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录中英文摘要（ABSTRACT）1引言12实验部分221雨生红球藻的培养和处理222仪器与试剂223实验方法3231色谱和质谱条件3232标准溶液的配制3233样品处理33结果与讨论331类胡萝素及虾青素酯的分离332雨生红球藻色素鉴定3321游离类胡萝卜素3322虾青素酯4323叶绿素633雨生红球藻色素的定量6331定量标准曲线、方法检测限及回收率测定6332样品测定64结论7致谢7参考文献8摘要雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS是一种单细胞淡水绿藻，其在多种不适宜生长
2、的外界环境条件下都会在细胞核周围的细胞质基质中加速积累次生类胡萝卜素。本研究旨在建立一种分析鉴定雨生红球藻色素的方法。液相色谱能够将色素各组分在进入APCIMS/MS前进行有效的分离，一共鉴定得到5种游离类胡萝素，15种虾青素单酯以及2种叶绿素。同时，对提取物中虾青素各组分进行定量，定量曲线在010G/ML浓度范围内线性相关系数为09986，该方法的检测限为002G/ML，雨生红球藻虾青素回收率达9247985。通过建立的方法对培养的雨生红球藻色素提取物进行测定，得到虾青素各组分的相对含量。该方法灵敏、准确，能够满足国内外的限量要求，可用于虾青素含量检验，对研究雨生红球藻虾青素积累机理等意义重
3、大。关键词雨生红球藻；色素；种类组成；定量分析ABSTRACTHAEMATOCOCCUSPLUVIALISISAKINDOFSINGLECELLEDFRESHWATERALGAE,WHOSEGROWTHWILLACCELERATETHEACCUMULATIONOFSECONDARYCAROTENOIDSAROUNDTHENUCLEUSOFTHECELLMATRIXUNDERAVARIETYOFINAPPROPRIATEEXTERNALENVIRONMENTALCONDITIONSTHEAIMOFTHISSTUDYWASTOESTABLISHAMETHODFORANALYZINGANDIDENT
4、IFYINGPIGMENTINHAEMATOCOCCUSPLUVIALISAFTERFIRSTBEINGANALYZEDBYHPLC,5FREECAROTENOIDS,15ASTAXANTHINMONOESTERSAND2CHLOROPHYLLINHAEMATOCOCCUSPLUVIALISWEREIDENTIFIEDBYLIQUIDCHROMATOGRAPHYATMOSPHERICPRESSURECHEMICALIONIZATIONMASSSPECTROMETRYLCAPCIMSLINEARITYOFTHEMETHODWASGOODWITHCORRELATIONCOEFFICIENTSR2O
5、F09986INTHERANGEOF0TO10G/MLMORETHELOWDETECTIONLIMITWAS002G/MLTHEOBTAINEDRECOVERIESVARIEDBETWEEN9247TO985USINGTHISMETHOD,ASTAXANTHININEXTRAVTSOFHPLUVIALSWEREDETERMINEDITWASDEMONSTRATEDTOBEAPOWERFULTOOLFORANALYSISOFTHESTRUCTUREANDCOMPOSITIONOFASTAXANTHINESTERSINHPLUVIALISWHATSMORE,ITWASHELPFULTOSTUDYT
6、HEMECHANISMOFASTAXANTHINACCUMULATIONINHPLUVIALISKEYWORDSHAEMATOCOCCUSPLUVIALISPIGMENTSPECIFICCOMPOSITIONQUANTITATIVEANALYSIS31引言雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS是一种单细胞淡水绿藻，其在多种不适宜生长的外界环境条件下都会在细胞核周围的细胞质基质中加速积累次生类胡萝卜素，其中80以上为虾青素及其脂类1。虾青素是发现于某些水生动物体内的一种酮式类胡萝卜素，又名虾黄素，是一种具有极强抗氧化活性的类胡萝卜素，超强的抗氧化活性赋予了虾青素突出的生理功能，如
7、提高动物免疫力、抑制肿瘤、清除自由基和活性氧等。虾青素具有广泛的应用价值，不仅可以用作水产养殖的饵料添加剂、人的食品添加剂，在药品、化妆品和高级营养保健品等领域也有非常大的应用潜力。雨生红球藻中虾青素的积累量可高达细胞干质量的42，是其他生物虾青素合成积累量的一到几个数量级，是目前首选的天然虾青素合成生物。虾青素是一种酮式类胡萝卜素，又名虾黄素，化学名称为3，3二羟基4，4二酮基，胡萝卜素，分子式为C40H52O4，相对分子质量为596。虾青素的化学结构主要为立体异构体和几何异构体。在立体异构体中，因为虾青素有两个手性或不对称中心，他们是分子中两端环结构的C3和C3。一个手性中心可以有两种构象
8、，虾青素的两个手性碳原子C3、C3都能以R或S存在，这样就有3种立体异构体。在几何异构体中，因为与CC双键结合的原子的排列方式是可以完全不同的，因此原子不能绕双键扭曲或旋转，除非双键断裂重排。虾青素在其分子的线型部分有多个双键，每个双键都可以是Z式或E式，全E结构是最稳定的结构。现已发现，天然虾青素中9、13和15位有Z式结构，因此虾青素可能的几何异构体有全E、9Z、13Z、15Z、9Z、13Z、9Z、15Z、13Z、15Z和9Z、13Z、15Z等36。近年来，国内外从与虾青素合成有关的诱导条件、红球藻细胞的光合变化、以及合成酶表达的分子调控等方面进行了分析研究，目前已经有大量相关的实验报道证
9、实了虾青素在雨生红球藻内的积累机制，其主要受光照7、温度8、营养盐911、活性氧12、细胞分裂抑制剂13、干燥、机械胁迫14等因素的影响。此外，目前已有人从虾青素合成酶系基因的表达水平上分析影响虾青素合成的调控机制1521。在虾青素的提取研究中，根据雨生红球藻的生活周期，主要分为营养细胞和厚壁孢子422。一般认为当环境有利时，主要以绿色、能运动的藻体形式存在；当环境不利时，形成厚壁孢子并大量累积虾青素23。雨生红球藻的厚壁孢子具有坚韧的细胞壁，若直接利用，则其生物有效利用率低，且坚韧的细胞壁也可阻碍有机溶剂进入细胞内提取虾青素24。因此在虾青素提取前必须对孢子态细胞进行破壁处理，以破坏雨生红球
10、藻的细胞结构。常用的处理方式有高压均质条件处理和超声波破壁25以及冻融法。虾青素具备多种功能，主要包括抗氧化作用、抗癌作用、预防动脉硬化和相关疾病、维护眼睛和中枢神经系统的健康，除此之外，最近的研究也表明，虾青素具有最佳诱导细胞分裂的活性和重要的免疫调节作用，可以作为免疫增强剂，提高免疫力。使用虾青素作为水生动物必需的维生素，对其正常生长和健康养殖，提高存活率和繁殖率，具有极为重要的作用。虾青素作为蛋禽和家畜工业的饲料添加剂，可使禽及家畜的成活率提高，染病率下降，他还可提高禽类卵子的受精率、产蛋率2627。目前虾青素作为天然色素和生物活性物质受到了极大的重视，具有广阔的应用前景和巨大的市场潜力
11、。随着人们对雨生红球藻虾青素认识的逐步清晰以及对虾青素在雨生红球藻中积累的分子机制研究如虾青素合成酶基因应答环境胁迫的表达调控机制将会是新一轮研究的热点，也将是根本性地改变雨生红球藻虾青素生产限制问题的唯一途径。经过仪器分析后，明显检测出含有各种不同结构的虾青素，对这些不同结构的虾青素进行定量分析。2实验部分21雨生红球藻的培养和处理雨生红球藻由宁波大学海洋生物实验室藻种室提供，培养淡水经045M醋酸纤维滤膜过滤后煮沸冷却，培养液采用浙江水产学院BBM配方如表1。藻种在2500ML三角瓶中于光照度8000LX，222，12/12H光照培养，每天摇瓶23次，直到微藻全部转红后收集。收集的藻类细胞
12、冷冻干燥后备用。表1BBM配方TAB1COMPOSITIONOFBBMMEDIUM成分浓度（MMOL/L）NANO329MGSO47H2O03NACL043K2HPO4043KH2PO4129CACL2017ZNSO47H2O003075MNCL24H2O00073MOO300049CUSO45H2O00063CONO36H2O00017H3BO4018EDTA017KOH055FESO47H2O0017922仪器与试剂TSQQUANTUMACCESS液相色谱一三重四极杆质谱联用分析系统（美国THERMOFISHERSCIENTIFIC公司），SUNFIRETMC18色谱柱250MM46MM,
13、5M（美国WATERS公司），超纯水系统（法国MILLIPORE公司）。虾青素标准品（纯度95，德国DRE公司），氯仿、甲醇、异丙醇、乙腈（色谱纯，美国SIGMAALDRICH公司），纯水由超纯水系统制备。23实验方法231色谱和质谱条件色谱条件使用SUNFIRETMC18色谱柱（250MM46MM,5M），进样量10L，柱温20。紫外采用全波段扫描，波长为300650NM，通道A紫外波长为480NM，通道B紫外波长设为645NM。流动相为（A）水溶液和（B）甲醇乙腈异丙醇混合溶液（V/V/V,1/2/1），流速06ML/MIN，洗脱梯度为在5MIN内B从80升到100，保持70MIN后在1M
14、IN内降到80，保持19MIN。质谱条件QQQMS条件采用大气压化学电离源（APCI）正离子电离模式，放电电流4I，鞘气压力35PSI；辅助气流量5，去溶剂温度400，离子传输毛细管温度250，质谱扫描范围为2002000，碰撞气采用氩气，碰撞气压力15MTORR。Q1和Q3分辨率均设定为半峰宽07DA。232标准溶液的配制称取10MG游离虾青素，用氯仿溶解定容到10ML，充分摇匀，配制成1MGML1标准品储备液，置0冰箱中保存，制作工作曲线时再取此储备液用100甲醇配制成不同浓度的标准溶液。233样品处理取冷冻干燥的藻样01G液氮研磨充分后，用氯仿甲醇（11）提取，振荡均匀，于超声破碎仪中超
15、声5MIN后以4000R/MIN离心10MIN，去上清液于旋转蒸发瓶中，重复提取多次至藻泥颜色变浅，基本上呈无色，将上述所有上清液合并。将所有提取液于旋转蒸发仪上以30蒸发至干。用25ML乙腈甲醇（7525）复溶后上仪器分析。注意所有的操作过程都要避光进行。63结果与讨论31类胡萝卜素及虾青素酯的分离如图1表明雨生红球藻色素提取物每种成分的不同保留时间。从图中，可以看出，游离类胡萝卜素在915MIN从色谱柱上洗脱下来，虾青素单酯在16MIN后洗脱下来。从紫外全扫中，我们发现大部分物质的最大吸收峰在480NM处，并且在645NM处有两个明显的吸收峰保留时间在1926MIN处。本试验中，同时开启质
16、谱仪检测得到480NM和645NM出峰处对应的各个质谱信号。由于无法买到所有的标准品，本实验中主要根据其M/Z比值和二级质谱数据，与所报道的研究对比进行最终定性28。32雨生红球藻色素鉴定321游离类胡萝卜素图1（A）中峰1在正离子模式下对应离子为M/Z59705MH和M/Z57902MH18,与标准品的保留时间和质荷比一致，故为游离态虾青素；峰2含有的M/Z60103、M/Z58307和M/Z56503离子对应为管藻黄素（SIPHONAXANTHIN）的MH、MHH2O和MH2H2O；峰3的M/Z55108和M/Z45902离子对应为海胆酮（ECHINENONE）的MH和MH92；峰4A、峰
17、4B的M/Z565和M/Z547离子对应为角黄素（CANTHAXANTHIN）的MH和MH18；还有，峰5处的M/Z56893、M/Z55105、M/Z45899和M/Z42896的离子对应为叶黄素（LUTEIN）的MH、MHH2O、MHH2O92、MH140。本实验一共检测到游离类胡萝卜素5种。7510152025303540TIMEMIN0100000200000300000400000500000600000700000800000900000100000011000001200000130000014000001500000UAU9A8A10A378B19D4A10C9C1210B51
18、34B268C9B11UAU1012141618202224262830323436384042TIMEMIN050000100000150000200000250000300000350000400000UAU1514205427334132406139053745359934413311315721283033234817651721156214211209UAUAB图1雨生红球藻色素提取物的紫外吸收图A480NM的图谱；B645NM的图谱FIGURE1HPLCCHROMATOGRAMOFINGREDIENTSINEXTRACTSOFHPLUVIALISA480NMB645NM322虾青素
19、酯对色素提取物中虾青素酯的鉴定，通过一个例子来说明。如图2所示，根据正离子扫描模式下的紫外图中对应保留时间处的质谱，可确定出此分子对应的MHM/Z85917、MHH2OM/Z84126，故此物质的分子量为858。进一步考察质谱行为，在正离子模式下8产生57901，从而我们确定得到此虾青素酯脂肪酰基为279（182），最终此物质为MEC182（ME，ASTAXANTHINMONOESTER）。在本实验中，通过分子离子峰和碎片离子的质荷比我们可以确定酰基链的类型，但无法确定具体双键的位置，故无法完全判定虾青素酯的同分异构体。在研究中发现，在正离子模式下，虾青素酯的特征碎片离子为579（脂肪酰基基团
20、作为羧酸的中性丢失而产生的离子）。表2中列出了通过质谱数据鉴定出的虾青素及其酯类，总共检测得到15种单酯。有学者检测到多种虾青素双酯29，而在本实验中并未观察到，具体原因还未知，有待以后的研究。200250300350400450500550600650700750800850900M/Z0102030405060708090100RELATIVEABUNDANCE5790185917634006620448695901918412676713221744268659296562952497637681278758072433284676145289974211RELATIVEABUNDANC
21、E图29AAPCIMS图FIGURE2MASSSPECTRUMAPCI,POSITIVEIONMODEOFANASTAXANTHINMONOESTERMEC182FIG1,9A表2雨生红球藻色素组成TAB2THECOMPOSITIONOFPIGMENTINHPLUVIALISNO（序号）M/Z（质荷比）COMPOUND（组分）MHMHFAMS215970257892ASTAXANTHIN26010358307SIPHONAXANTHIN5650335510845902ECHINENONE4A5650854708CANTHAXANTHIN4B5650854708CANTHAXANTHIN5568
22、9355105LUTEIN458994289668291957903MEC16378551157902MEC18498A8571857901MEC1838B8572057900MEC1838C8571857904MEC1839A8591757901MEC1829B8591657899MEC1829C8591657900MEC1829D8591457900MEC18210A8611757900MEC181118351957901MEC16010B8612357899MEC18110C8611857898MEC181128631157898MEC180138492757900MEC170注ME为虾
23、青素单酯323叶绿素如图1（B）所示，在645NM处有两个明显的紫外吸收峰，对应质谱图发现，14处为叶绿素B，15处为叶绿素A，分别为M/Z90708和M/Z89309。33雨生红球藻色素的定量331定量标准曲线、方法检测限及回收率测定分别配制含虾青素001、01、05、1、5、10G/ML的标准样，在上述条件下（231）进行LCMS分析。在010G/ML浓度范围内线性方程式为Y172006X，相关系数R2为09986，线性良好。由于雨生红球藻中游离态虾青素的含量不是很高，均在相应的线性范围内，故采用此标准曲线对雨生红球藻虾青素进行定量分析。另外，因为无法买到虾青素酯标准品，故采用相对定量法来
24、确定其余色素的含量，即通过对比各组分与游离态虾青素的峰面积比来对其余色素进行定量。进样10L含虾青素01G/ML的标准样品，在紫外图上测得虾青素紫外吸收峰按照检出限信噪比为31，定量限信噪比为101，计算得到虾青素的检出限和定量限分别为002G/ML和007G/ML。向已被甲醇和氯仿混合液提取过的雨生红球藻细胞藻渣中加入1G/ML虾青素标准品后重复233过程进行回收率实验，测得方法的平均绝对回收率在9247985范围内，相对标准偏差小于435。332样品测定对收集得到的雨生红球藻进行分析，样品平行测定3次，各组分含量平均值见表3。表3雨生红球藻提取物中虾青素各组分含量（G/100MG干藻粉）C
25、ONTENTSOFASTAXANTHINESTERSG/100MGOFDRYBROKENALAGEINHPLUVIALIS10NO（序号）COMPOUND（组分）CONTENT（含量）1ASTAXANTHIN20860216MEC1632920067MEC18453542078AMEC183159326978BMEC18324210978CMEC18318500649AMEC182251409989BMEC18215291299CMEC18233570319DMEC182604220210AMEC1811844923211MEC1601262681210BMEC181208410310CMEC
26、181550610712MEC180335135713MEC170236026注ME为虾青素单酯从表中可以发现，虾青素C181、182、183和160是雨生红球藻中主要的单酯形式。4结论建立了一种分析鉴定雨生红球藻色素的方法。液相色谱可以将色素各组分在进入APCIMS/MS前进行有效的分离。另外，本方法的定量曲线在010G/ML浓度范围内线性相关系数为09986。方法的检测限为002G/ML，雨生红球藻虾青素回收率达9247985。对培养的雨生红球藻色素提取物进行测定，得到虾青素各组分的相对含量。该方法灵敏、准确，能够满足国内外的限量要求，可用于虾青素含量检验，对研究雨生红球藻虾青素积累机理等
27、意义重大。参考文献1SANTOSMF,MESQUITAJFULTRASTRUCTURALSTUDYOFHAEMATOCOCCUSLACUSTRISGIROD,ROSTAFINSKIVOLVOCALESSOMEASPECTSOFCAROTENOGENESISJCYTOLOGIA,1984,492152282LEEYK,SOHCWACCUMULATIONOFASTAXANTHININHAEMATOCOCCUSLACUSTRISCHLOROPHYTAJJPHYCOL,1991,275755773LEEYK,DINGSYEFFECTOFDISSOLVEDOXYGENPARTIALPRESSUREONT
28、HEACCUMULATIONOFASTAXANTHININCHEMOSTATCULTURESOFHAEMATOCOCCUSLACUSTRISCHLOROPHYTAJJPHYCOL,1995,319229244BOUSSIBAS,VONSHAKAASTAXANTHINACCUMULATIONINTHEGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJPLANTCELL11PHYSIO,1991,32107710825KOBAYASHIM,KAKIZONOTGROWTHANDASTAXANTHINFORMATIONOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISINHETEROTRO
29、PHICANDMIXOTROPHICCONDITIONSJJFERMENTBIOENG,1992,7417206KOBAYASHIM,KAKIZONOT,NAGAISENHANCEDCAROTENOIDBIOSYNTHESISBYOXIDATIVESTRESSINACETATEINDUCEDCYSTCELLSOFAGREENUNICELLULARALGA,HAEMATOCOCCUSPLUVIALISJAPPLENVIRONMICROBIOL,1993,598678737BOROWITZKAMA,HUISMANJM,OSBORNACULTUREOFTHEASTAXANTHINPRODUCINGG
30、REENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJ,JAPPLPHYCOL,1991,32953048TJAHJONOAE,HAYAMAYHYPERACCUMULATIONOFASTAXANTHININAGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISATELEVATEDTEMPERATURESJBIOTECHNOLLETT,1994,161331389OROSAM,FRANQUEIRAD,CIDA,ETALANALYSISANDENHANCEMENTOFASTAXANTHINACCUMULATIONINHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJBIORESOUR
31、TECHNOL,2005,96337337810KOBAYASHIM,HIRAINABSCISICACIDDEPENDENTALGALMORPHOGENESISINTHEUNICELLULARGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJPLANTGROWTHREGUL,1997,22798511LUF,VONSHAKA,BOUSSIBASEFFECTOFTEMPERATUREANDIRRADIANCEONGROWTHOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISCHLOROPHEAEJJPHYCOL,1994,3082983312KOBAYASHIM,KURIMURAYL
32、IGHTINDEPENDENTASTAXANTHINPRODUCTIONBYTHEGREENMICROALGAEHAEMATOCOCCUSPLUVIALISUNDERSALTSTRESSJBIOTECHNOLLETT,1997,1950750913KOBAYASHIM,SAKAMOTOYSINGLETOXYGENQUENCHINGABILITYOFASTAXANTHINESTERSFROMTHEGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJBIOTECHNOLLETT,1999,2126526914GUDINC,CHAUMONTDCELLFRAGILITYTHEKEYPROB
33、LEMOFMICROALGAEMASSPRODUCTIONINCLOSEDPHOTOBIOREACTORSJBIORESOURCETECHNOLOGY,1991,3814515115SUNZ,CUNNINGHAMFX,GANTTEDIFFERENTIALEXPRESSIONOFTWOISOPENTENYLPYROPHOSPHATEISOMERASESANDENHANCEDCAROTENOIDACCUMULATIONINAUNICELLULARCHLOROPHYTEJPROCNATLACADSCI,1998,95114821148816STEINBRENNERJ,LINDENHREGULATIO
34、NOFTWOCAROTENOIDBIOSYNTHESISGENESCODINGFORPHYTOENESYNTHASEANDCAROTENOIDHYDROXYLASEDURINGSTRESSINDUCEASTAXANTHINFORMATIONINTHEALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJ,PLANTPHYSIOL,2001,12581081717GRUNEWALDK,ECKERTM,HIRSCHBERGJ,ETALPHYTOENEDESATURASEISLOCALIZEDEXCLUSIVELYINTHECHLOROPLASTANDUPREGULATEDATTHEMRNALEVE
35、LDURINGACCUMULATIONOFSECONDARYCAROTENOIDSINHAEMATOCOCCUSPLUVIALISVOLVOLCALES,CHLOROPHYCEAEJPLANTPHYSIOL,2000,1221261126818LOTANT,HIRSCHBERGJCLONINGANDEXPRESSIONINESCHERICHIACOLIOFTHEKETOCAROTENOIDCANTHAXANTHININHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJFEBSLETT,1995,36412512819GRUNEWALDK,HIRSCHBERGJ,HAGENCKETOCAROTENO
36、IDBIOSYNTHESISOUTSIDEOFPLASTIDSINTHEUNICELLULARGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJJBIOLCHEM,2001,27686023602920HUANGJC,CHENGF,SANDMANNBGSTRESSRELATEDDIFFERENTIALEXPRESSIONOFMULTIPLECAROTENEKETOLASEGENESINTHEUNICELLULARGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJJOURNALOFBIOTECHNOLOGY,2006,12217618521STEINBRENNERJ,
37、LINDENHLIGHTINDUCTIONOFCAROTENOIDBIOSYNTHESISGENESINTHEGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISREGULATIONBYPHOTOSYNTHETICREDOXCONTROLJPLANTMOLBIOL,2003,52234335622刘建国,孙艳妮,殷明焱等无机碳与雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS细胞调节物质J海洋与湖沼,2004,545946623庄惠如,卢海声雨生红球藻营养细胞的虾青素累积J水生生物学报,2001,25437637824MKOBAYASHI,YKURIMURA,YSAKAMOTO
38、,ETALSELECTIVEEXTRACTIONOFASTAXANTHINANDCHLOROPHYLLFROMTHEGREENALGAEHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJBIOTECHNOLOGYTECHNIQUES,1997,11965766025金传荫,宋立荣红球藻水生748株HAEMATOCOCCUSSPHB748培养基的选择与对维生素B12的需求12J应用与环境生物学报,1997,3217717926MOROSA,ETORRES,PFIDALGO,ETALPRODUCTIONANDANALYSISOFSECONDARYCAROTENOIDSINGREENALGAEJJOUR
39、NALOFAPPLIEDPHYCOLOGY,2000,1255355627RSARADA,RVIDHYAVATHI,DUSHA,ETALANEFFICIENTMETHODFOREXTRACTIONOFSTAXANTHINFROMGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJAGRICULTURALANDFOODCHEMISTRY,2006,54,75857588758528FENGPINGMIAO,DAYANLU,YEGUANGLI,ETALCHARACTERIZATIONOFASTAXANTHINESTERSINHAEMATOCOCCUSPLUVIALISBYLIQUIDC
40、HROMATOGRAPHYATMOSPHERICPRESSURECHEMICALIONIZATIONMASSSPECTROMETRYJANALYTICALBIOCHEMISTRY,2006,35217618129KARSTENHOLTIN,MAXIMILIANKUEHNLE,JENSREHBEIN,ETALDETERMINATIONOFASTAXANTHINANDASTAXANTHINESTERSINTHEMICROALGAEHAEMATOCOCCUSPLUVIALISBYLCAPCIMSANDCHARACTERIZATIONOFPREDOMINANTCAROTENOIDISOMERSBYNMRSPECTROSCOPYJANALBIOANALCHEM,2009,39516131622
