1、本科毕业设计（20_届）雨生红球藻色素累积的生化调控所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言22材料与方法221藻种222雨生红球藻扩种培养条件223仪器和试剂224研究方法3241活体吸光方法的确定3242虾青素提取和含量检测3243光合参数的测定325添加硫酸亚铁促进雨生红球藻累积虾青素的调控3251光照在添加FE2促进虾青素累积过程中的作用3252添加FE2的时间差异对促进累积过程的作用3253添加FE2和光胁迫下，雨生红球藻累积虾青素的类型差异326添加过氧化氢对雨生红球藻累积虾青素的调控4261添加过氧化氢时，色素活体吸光值受光照强度影响的变化特征426
2、2添加过氧化氢对雨生红球藻797株光合参数的影响43结果与分析431添加硫酸亚铁促进雨生红球藻累积虾青素的调控4311光照在添加FE2促进虾青素累积过程中的作用4312添加FE2的时间差异对促进累积过程的作用7313添加FE2和光胁迫下，雨生红球藻累积虾青素的类型差异832添加过氧化氢对雨生红球藻累积虾青素的调控11321添加过氧化氢时，色素活体吸光值受光照强度影响的变化特征11322添加过氧化氢对雨生红球藻797株光合参数的影响134结论16致谢错误未定义书签。参考文献17摘要雨生红球藻作为一种能大量积累虾青素的生物被广泛研究，但是还存在诸如品系差异、累积产率、累积时间、返绿问题、胁迫调控时
3、对微藻的致害或生理活性的可能影响等问题，因此对雨生红球藻的生化调控及其研究是很有必要的。本实验在雨生红球藻培养液中添加FE2和H2O2两种生化因子，通过测定虾青素特定吸光值、虾青素含量和LCMS分析研究这两种生化因子对雨生红球藻生长和积累虾青素的影响。结果表明加入FE2的实验组含有的色素种类上与空白组一样，两组之间并无差别。但是，比较两组样品数据，发现相对对照组而言，实验组中各色素含量均有一定程度的增加，说明FE2有利于色素的积累，加入二价亚铁离子，虾青素的合成能力也会增加。在H2O2实验中，发现实验组细胞有死亡现象，这可能是由于H2O2的强氧化性所致，在本实验所设置的两个浓度下，H2O2并未
4、表现出对虾青素合成有促进作用（从OD值反映），也并未对雨生红球藻生理生化造成很大影响。关键词雨生红球藻；虾青素；调控；FE2；H2O2ABSTRACTASANORGANISMWHICHCANACCUMULATEASTAXANTHIN,HAEMATOCOCCUSPLUVIALISHASBEENWIDELYSTUDIEDBUTSOMEISSUES,SUCHASSTRAINDIFFERENCES,CUMULATIVEYIELD,CUMULATIVETIME,BACKTOGREENISSUES,ORWHENUNDERSTRESSCONTROLTHATMAYAFFECTPHYSICALACTIVITYO
5、FMICROALGAESTILLEXISTS,SOITISNECESSARYTOSTUDYTHEBIOCHEMICALREGULATIONOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISTHEEFFECTSOFTWOBIOCHEMICAFACTORFE2ANDH2O2ONTHEGROWTHANDTHEACCUMULATIONOFASTAXANTHINCONTENTWEREINVESTIGATEDTHERESULTSSHOWEDTHATEXPERIMENTALGROUPWHICHADDFE2CONTAINEDTHESAMEPIGMENTTYPEWITHTHECONTROLGROUPHOWEVER
6、,FROMTHETWOGOUPSSDATA,WEFOUNDTHATRELATIVETOTHETHECONTROLGROUP,THEPIGMENTCONTENTINTHEEXPERIMENTALGROUPINCREASED,WHICHINDICATEDTHATFE2ISCONDUCIVETOTHEACCUMULATIONOFPIGMENT,INADDITION,BYADDINGFERROUSION,THESYNTHESISOFASTAXANTHINCAPACITYINCREASEDINH2O2EXPERIMENT,ITSCAMETOTHERESULTTHATTHECELLSINTHEEXPERI
7、MENTALGROUPHAVETHEPHENOMENONOFDEATHWHICHMAYBEDUETOSTRONGOXIDATIONCAUSEDBYH2O2INTHEEXPERIMENT,H2O2WITHTWOCONCENTRATIONSNEITHERSHOWEDSTIMULATIVEEFFECTTOTHEACCUMULATIONOFASTAXANTHINREFLECTFROMTHEODVALUE,NORHADAGREATIMPACTONTHEPHYSIOLOGICALANDBIOCHEMICALOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISKEYWORDSHAEMATOCOCCUSPLUVI
8、ALISASTAXANTBINCONTROLFE2H2O21引言雨生红球藻（HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS）是一种生活在淡水中的单细胞绿藻，在分类学上属于绿藻门、绿藻纲、团藻目、红球藻科、红球藻属。雨生红球藻在多种不适宜生长的外界环境条件下能积累大量次生类胡萝卜素，其中80以上为虾青素（ASTAXANTBIN）及其酯类。虾青素是一种近年来进入国际研发领域的红色类胡萝卜素，广泛存在于自然界，尤其是海洋生物体内，其抗氧化能力比其他类胡萝卜素强10倍，比维生素E强550倍，被誉为“超级维生素E”。虾青素的着色能力显著，并具有抗癌症、抗衰老、增强免疫力等一系列重要的生理功能，鉴于此，它被
9、广泛应用于保健品、医药、水产养殖等领域，具有广阔的应用前景。雨生红球藻中虾青素的积累量可强达细胞干重的24,，被认为是自然界中天然虾青素含量最强的生物，利用雨生红球藻来生产虾青素具有巨大的发展前景1。近年来，国内外从与虾青素合成有关的诱导条件、红球藻细胞的光合变化、细胞形态变化、微结构变化、生化指标以及合成酶表达的分子调控等方面进行了分析研究，目前已经有大量相关的实验报道。利用雨生红球藻生产虾青素在生产过程中还存在很多的问题，比如品系差异、累积产率、累积时间、返绿问题、胁迫调控时对微藻的致害或生理活性的可能影响等问题，因此对雨生红球藻的生化调控及其研究是很有必要的。影响雨生红球藻累积虾青素的因
10、子众多，现在有较多研究的有光照26，温度7,8，营养盐913，活性氧14,15，植物激素1621等。在微量元素中，铁是微藻所要求的最基本的元素之一，因为它参与硝酸盐和亚硝酸盐的同化、硫酸盐的还原、氮的固定、叶绿素的合成和许多其他生物的合成和降解反应。即便在营养丰富的环境中，铁缺乏也会限制微藻的生长，加入亚铁离子会促进虾青素的合成2。据报道，雨生红球藻中虾青素的合成也与其细胞内的活性氧有关，溶解氧和多种活性氧分子都可以有效诱导细胞内虾青素的合成和积累。虾青素在细胞内可能起着抗氧化的作用，清除环境胁迫和过度氧化产生的活性氧，防止活性氧对细胞产生伤害3,4。前期研究和文献都表明，添加FE2、H2O2
11、等可以明显促进雨生红球藻对虾青素的累积。但是，化学调控与其他因子的综合作用影响尚不明确，化学调控后对累积色素类型组成、生理活性等方面的影响尚待研究。本研究的目的是寻求实际应用中更合理的多因子调控组合以及因此形成藻类生理生化和产物特征的影响。2材料与方法21藻种雨生红球藻797株购自中科院海洋所，雨生红球藻363株为本研究室前期研究改良株。22雨生红球藻扩种培养条件选用NMB3培养液培养雨生红球藻于3000ML三角瓶中。NMB3培养液配方（母液）KNO3100GK2HPO410GMNSO4025GFESO47H2O25GNA2EDTA20GVB1205LGVB15LG,溶解于1000ML蒸馏水。
12、以1B1000淡水比例使用。培养淡水经045M醋酸纤维滤膜过滤后煮沸冷却得到。于6000LX光强，（222），12H/12H光暗周期下进行静止培养，每天手摇12次，直至培养到对数生长期。23仪器和试剂ACQUITY超强效液相色谱分析系统，配置ACQUITY自动进样器；QTOFPREMIER强分辨四极杆与飞行时间串联质谱仪（美国WATERS公司）；ACQUITYUPLCBEHC8色谱柱（100MM21MM，17M）（美国WATERS公司）；MASSLYNX41数据处理系统（美国WATERS公司）；超纯水系统（法国MILLIPORE公司）；GXZ智能型光照培养箱（宁波江南仪器厂）；LDZX50FB
13、强压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；TDLSO2B飞鸽低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TP300超声波清洗机（北京泰拓公司）；漩涡混合器（上海精科实业公司）；WO系列恒温水浴锅、旋转蒸发器均为上海中顺生物科技公司产品；SHZD（）循环水式真空泵（义乌平华仪器公司）等。色谱纯氯仿、甲醇、乙腈、甲酸（美国SIGMAALDRICH公司）；纯水由超纯水系统制备。24研究方法本研究分析培养藻液中添加FE2和H2O2对雨生红球藻虾青素累积和光合参数的影响，结合光照条件的变化，分析以人工调控方式促进雨生红球藻累积虾青素的作用大小、对生成的虾青素组分的变化影响、以及调控对微藻自身生理活性的部分影响。2
14、41活体吸光方法的确定以离体虾青素检测波长490NM为相对定量的活体吸光波长，检测雨生红球藻培养过程中虾青素的相对变化趋势。采用全波长扫描多功能酶标仪（美国THERMO公司）检测490NM下藻液OD值。242虾青素提取和含量检测取10ML藻液于离心管中，3000RPM离心10MIN，弃去上清液，用5KOH30甲醇破坏叶绿素5MIN后离心去上清液，再离心弃去上清液，收集到得藻体沉淀转入研钵中研磨后加入10MLDMSO（30下）抽提5MIN，超声波振荡，用UV7504紫外可见分光光度计在490NM下测定虾青素含量A490。用公式C（MGL1）45A490VA/VB计算单位体积雨生红球藻的虾青素含量
15、。式中A490表示虾青素提取液在490NM下的吸光度值；C表示虾青素含量；VA表示提取液的体积；VB表示用藻液体积单位为（GML1）。243光合参数的测定取藻液2ML，用AQUAPEN手持式荧光仪测定FT（光合有效辐射（光量子）产量）、F0暗处理、QY（FV/FM）、QY暗处理（FV/FM）、CHL光吸收OD680OD720这5个光合作用参数。25添加硫酸亚铁促进雨生红球藻累积虾青素的调控251光照在添加FE2促进虾青素累积过程中的作用实验设置了低光照、强光照两种实验条件，研究光照在添加FE2促进虾青素累积过程中的作用。取培养到对数期的藻液（797株和363株），在24孔板上每孔添加藻液2ML
16、。使用FESO4作为添加剂，最后使FESO4终浓度分别为0MGL1、075MGL1、125MGL1。每组设置3个平行，每天进行活体吸光测定。将上述处理过的藻液置于GXZ型智能光照培养箱（宁波江南仪器厂）中，每天手摇数次。低光照组，培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约为2000LX，温度为22。强光照组培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约为10000LX，温度为22。252添加FE2的时间差异对促进累积过程的作用实验在强光照（10000LX）条件下进行，设置了正常添加和延后添加（实验第4天添加FE2）两种实验条件，研究添加FE2的时间差异对促进累积过程
17、的作用。取培养到对数期的藻液（雨生红球藻797株），在24孔板上每孔添加藻液2ML。使用FESO4作为添加剂，最后使FESO4终浓度分别为0MGL1、075MGL1、125MGL1。每组设置3个平行，每天进行活体吸光测定。将上述处理过的藻液置于GXZ型智能光照培养箱（宁波江南仪器厂）中，每天手摇数次。培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约为10000LX，温度为22。253添加FE2和光胁迫下，雨生红球藻累积虾青素的类型差异为了研究添加FE2和光胁迫下，雨生红球藻累积虾青素的类型差异设置本实验。培养雨生红球藻797株于1000ML三角瓶中，藻液体积800ML，添加FESO4
18、，使终浓度为075MGL1。设置空白对照组，每组3个平行。将上述处理过的藻液置于GXZ型智能光照培养箱（宁波江南仪器厂）中。培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约为10000LX，温度为22，每天摇动数次。2531虾青素含量测定在实验第4天取10ML藻液测定虾青素含量，与490NM测定的OD值形成对比。2532LCMS分析待藻细胞转红后收集，冷冻干燥后备用。取冷冻干燥的藻样01G液氮研磨充分后，用氯仿甲醇（11）提取，振荡均匀，于超声破碎仪中超声5MIN后以4000R/MIN离心10MIN，移取上清液于旋转蒸发瓶中，重复提取多次至藻泥颜色变浅，基本上呈无色，将上述所有上清液
19、合并。所有提取液用旋转蒸发仪上以30蒸发至干。用15ML乙腈复溶后上仪器分析。注意所有的操作过程都要避光进行。使用SUNFIRETMC18色谱柱（250MM46MM，5M），进样量10L，柱温20。紫外采用全波段扫描，波长为300650NM，通道A紫外波长为480NM，通道B紫外波长设为645NM。流动相为（A）水溶液和（B）甲醇乙腈异丙醇混合溶液（V/V/V，1/2/1），流速06ML/MIN，洗脱梯度为在5MIN内B从80升到100，保持70MIN后在1MIN内降到80，保持19MIN。QQQMS条件采用大气压化学电离源（APCI）正离子电离模式，放电电流4I，鞘气压力35PSI；辅助气流
20、量5，去溶剂温度400，离子传输毛细管温度250，质谱扫描范围为2002000，碰撞气采用氩气，碰撞气压力15MTORR。Q1和Q3分辨率均设定为半峰宽07DA。26添加过氧化氢对雨生红球藻累积虾青素的调控261添加过氧化氢时，色素活体吸光值受光照强度影响的变化特征设置了低光照、强光照两种实验条件，研究光照在添加H2O2促进虾青素累积过程中的作用。取培养到对数期藻液（797株和363株），在24孔板上每孔添加藻液2ML。使用H2O2作为添加剂，最后使H2O2终浓度分别为0MOLL1、108MOLL1、106MOLL1。每组设置3个平行，每天进行活体吸光测定。将上述处理过的藻液置于GXZ型智能光
21、照培养箱（宁波江南仪器厂）中。低光照组，培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期,光照强度约为2000LX，温度为22。强光照组培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约为10000LX，温度为22。262添加过氧化氢对雨生红球藻797株光合参数的影响H2O2有强氧化性，为了研究H2O2是否会对雨生红球藻生理、生化产生影响，设置本实验，通过测定光合参数来表征。设置了低光照、强光照两种实验条件。培养雨生红球藻797株于250ML三角瓶中，藻液体积100ML，使用H2O2作为添加剂，最后使H2O2终浓度分别为0MOLL1、108MOLL1、106MOLL1。每组设置3个平行。
22、将上述处理过的藻液置于GXZ型智能光照培养箱（宁波江南仪器厂）中。低光照组，培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约为2000LX，温度为22。强光照组培养箱设置各实验参数如下12H/12H光暗周期，光照强度约为10000LX，温度为22。使用AQUAPEN手持式荧光仪测定FT、F0、QY、QY暗处理、OD值等光合作用参数。测定时间为分装前，分装后5小时，第2天，第3天，第4天。3结果与分析31添加硫酸亚铁促进雨生红球藻累积虾青素的调控311光照在添加FE2促进虾青素累积过程中的作用光照是红球藻诱导虾青素大量积累的重要因子，强强度光照下虾青素的合成会得到促进26。有研究发现强
23、光照射诱导雨生红球藻合成虾青素的机理在于其提强了1,5二磷酸核酮糖羧化酶和硝酸还原酶活性，导致硝酸盐浓度迅速降低而最终又抑制了这两种酶的活性，造成雨生红球藻碳代谢（光合作用）及氮代谢效率大幅度下降，即“碳饥饿”和“氮饥饿”。在此状态下，为了生存，细胞内合成虾青素的相关基因被激活，藻细胞开始并积累合成虾青素以抵御不良的环境条件2。3111雨生红球藻797株结果A强光照在FE2添加作用中的影响经过对7天测定的OD值进行整理，分析强光照在FE2添加作用中的影响。图1添加不同浓度FE2时，于强光胁迫条件下，雨生红球藻797株藻液490NM活体吸光值的变化FIG1THECHANGEOFLIVINGABS
24、ORBANCEIN490NMOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS797ALGAELIQUIDWITHDIFFERENTFE2CONCENTRATIONSINHIGHLIGHTINGSTRESSCONDITION从图1中我们可以看到13天，实验组与对照组OD值增长基本相当，差异不大。第4天开始，低浓度组增长速度比高浓度组和空白对照组明显加快，此后差异不断增大，高浓度组和空白对照组始终差异不大。实验进行到第7天，低浓度组OD值比空白组提高了51，差异明显（P005）。表1强光照实验条件下，雨生红球藻797株虾青素含量测定（490NM）TAB1DETERMININGTHEASTAXANT
25、HINCONTENTOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS797IN490NMUNDERHIGHLIGHTINGCONDITION实验组对照组123123A490009600680081002900350032虾青素含量C（UGML1）043203060364501305015750144平均值0367501438方差00026505000012154两组比较实验组增量是空白组增量的256倍图1反应的是在24孔板上，小体积，强光照培养雨生红球藻797，添加FESO4对其积累虾青素的影响。表1反应的是在强光照实验条件下，大体积（800ML藻液）培养雨生红球藻797，添加FESO4对其积
26、累虾青素的影响。可以看到实验组（添加FESO4075MGL1）与空白对照组虾青素含量已有明显区别，这与图2所反应的情况一致。B弱光照在FE2添加作用中的影响强光照被大量报道会有力促进虾青素合成，但是在生产过程中，往往会面临是否可以不进行光胁迫就能通过生化调控促进虾青素累积的问题。本实验试图比较相同的化学调控处理时，强弱光照强度的影响。图2添加不同浓度FE2时，于弱光照条件下，雨生红球藻797株藻液490NM活体吸光值的变化FIG2THECHANGEOFLIVINGABSORBANCEIN490NMOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS797ALGAELIQUIDWITHDIFFERE
27、NTFE2CONCENTRATIONSINLOWLIGHTINGCONDITION在弱光照试验中，从图中我们可以看到实验组与空白对照组OD值变化差异不大，低浓度组与空白组对比增加了90，高浓度组反而下降了90，这可能与测量误差有关。看来在弱光实验条件下，低浓度或高浓度的FESO4并未表现出雨生红球藻797株积累虾青素有明显作用，这可能是因为在弱光条件下，雨生红球藻积累虾青素较慢，在7天的实验时间中，FE2对其造成的影响还未显现出来。3112雨生红球藻363株结果不同品系之间会存在差异，363是雨生红球藻改良株，本实验研究不同品系间对光照和FE2同时作用情况下差异。A强光照在FE2添加作用中的影
28、响研究强光照对363株在FE2添加作用中的影响，对OD值进行整理得到下图。图3添加不同浓度FE2时，于强光胁迫条件下，雨生红球藻363株藻液490NM活体吸光值的变化FIG3THECHANGEOFLIVINGABSORBANCEIN490NMOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS363ALGAELIQUIDWITHDIFFERENTFE2CONCENTRATIONSINHIGHLIGHTINGSTRESSCONDITION从图中可以看到，第1天到第2天，OD值有一个快速的增长，之后OD值略有下降，最后几天OD值基本保持不变。可以看到实验组与空白对照之间差异不大，FE2的添加并未对36
29、3品系表现出促进作用。B弱光照在FE2添加作用中的影响弱光环境中，添加FE2时，雨生红球藻活体吸光的变化如图4所示。图4添加不同浓度FE2时，于弱光照条件下，雨生红球藻363株藻液490NM活体吸光值的变化FIG4THECHANGEOFLIVINGABSORBANCEIN490NMOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS363ALGAELIQUIDWITHDIFFERENTFE2CONCENTRATIONSINLOWLIGHTINGCONDITION从图4中可以看到在弱光实验中，OD值变化情况与强光试验中基本一致，都是先有一个快速增长，后略有下降，最后几天又缓慢增长。只是弱光和强光实验
30、，OD值基数不一样。同样的，实验组与空白对照组之间差异不大。分析FE2的添加对363可能有促进作用，但是对比强光照对虾青素积累的明显作用效果不明显，所以在强光照试验中并未看出差异，而在弱光照试验中排除了光照因素的干扰，在第6天和第7天低浓度组与其它两组表现出差异，低浓度组分别比空白组提高了14。3113不同雨生红球藻品系差异比较在实验进行过程中，对雨生红球藻两个品系的转红情况做了定性观察。表2雨生红球藻797品系外观颜色变化TAB2THECHANGEOFTHECOLOROFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS797时间DAY品系1234567低光照组797高光照组797低光照组363高
31、光照组363注代表绿色代表红色越多颜色越深分析表2，分析不同品系（797和363）之间区别添加FE2因子后，低光照组，雨生红球藻363品系在第3天开始转红，797品系在第5天才开始转红，之后到第7天两个品系转红程度相当。高光照组363品系在第2天便开始转红，797品系在第3天开始转红，在第5天两个品系转红程度差不多，到第6、7天，797品系转红程度明显超过363品系。因此我们可以得出添加FE2因子后，363品系转红较797品系快，但是转红程度不如797品系。312添加FE2的时间差异对促进累积过程的作用3121强光条件下不同时间高浓度添加FE2的影响对利用微型藻类生产目标产物的调控中，调控的时
32、机（即调控时间点）是构成人工调控的环节之一。本研究初步分析强光胁迫下不同时间添加FE2会在这种调控中产生怎样的影响。图5强光胁迫条件下，不同时间以高浓度添加FE2，雨生红球藻797株藻液490NM活体吸光值的变化FIG5THECHANGEOFLIVINGABSORBANCEIN490NMOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS797ALGAELIQUIDWITHADDINGHIGHCONCENTRATIONSFE2INDIFFERENTTIMEUNDERHIGHLIGHTINGSTRESSCONDITION在强光实验条件下，强光照组高浓度在第7天与其它两组表现出明显差异。分别比低浓度组
33、和空白组提高了32和36，与其他两组表现出显著差异（P005）。3122强光条件下不同时间低浓度添加FE2的影响强光照能有力促进虾青素积累，但是在强光照下不同时间添加FE2，是否会对雨生红球藻积累虾青素产生影响还未知，本实验设置就是为了研究此问题。图6强光胁迫条件下，797不同时间低浓度添加FE2490NM活体吸光值的变化FIG6THECHANGEOFLIVINGABSORBANCEIN490NMOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS797ALGAELIQUIDWITHADDINGLOWCONCENTRATIONSFE2INDIFFERENTTIMEUNDERHIGHLIGHTING
34、STRESSCONDITION强光照条件下低浓度正常添加在第6天显示出差异，第7天差异变大。与图5比较，两图反映出的情况略有差异，高浓度情况下，第3天添加实验组后续OD值增长加快，低浓度情况下，正常添加实验组后续OD值增长加快，综合来看，第7天低浓度正常添加组OD值为109，高浓度延后添加组OD值为098，低浓度正常添加组促进虾青素效果最好，具体实验条件为添加FESO4终浓度为075MGL1，培养于10000LX光强下，每天手摇数次。313添加FE2和光胁迫下，雨生红球藻累积虾青素的类型差异3131类胡萝素及虾青素酯的分离图7表示雨生红球藻色素提取物每种成分的不同保留时间。从图中，可以看出，游
35、离类胡萝卜素在915分钟从色谱柱上洗脱下来，虾青素单酯在16分钟后洗脱下来。从紫外全扫中，我们发现大部分物质的最大吸收峰在480NM处，并且在640NM处有两个明显的吸收峰（保留时间在1926分钟处）。本试验中，同时开启质谱仪检测得到480NM出峰处对应的各个质谱信号。由于无法买到所有的标准品，本实验中主要根据其M/Z比值和二级质谱数据，与所报道的研究对比进行最终定性22。8101214161820222426283032343638404244TIMEMIN01000002000003000004000005000006000007000008000009000001000000110000
36、0120000013000001400000150000016000001700000UAU3A9A8A1110A28B1B4A71A9D10C3B131244021C4B58C9B9C10B6UAU101520253035404550556065TIMEMIN050000100000150000200000250000300000350000400000450000500000550000600000650000700000UAU1514201526546360622059545698377954465188493746824426407037183360309322151796143712
37、67UAU图7雨生红球藻色素提取物的紫外吸收图A480NM的图谱；B645NM的图谱FIG7HPLCCHROMATOGRAMOFINGREDIENTSINEXTRACTSOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISA480NMB645NM3132雨生红球藻色素含量的变化利用实验室已建立的雨生红球藻色素定性定量方法对实验组和对照组的色素提取物进行分析，结果共得到游离类胡萝卜素4种，分别为游离态虾青素（ASTAXANTHIN）、管藻黄素（SIPHONAXANTHIN）、海胆酮（ECHINENONE）、角黄素（CANTHAXANTHIN）；得到8种虾青素单酯，脂肪酰基链分别为C160、C163、
38、C164、C172、C181、C182、C183、C184；在波长为645NM处，还得到叶绿素A以及叶绿素B。由于不能全部买到这些色素标准品，故采用相对游离虾青素含量的方法来确定其它色素的含量。定量所得的数据见下表。表3雨生红球藻实验组及对照组提取物中色素各组分含量（G100MG干藻粉）TAB3CONTENTSOFPIGMENTINHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS（G100MGDRYALGAE）NO（序号）COMPOUND（组分）CONTENT（含量）（G100MG干粉）实验组对照组1ASIPHONAXANTHIN6300364120651BSIPHONAXANTHIN157601
39、111620552ASTAXANTHIN220100718570421CSIPHONAXANTHIN11090158420383AECHINENONE1011235388603234ACANTHAXANTHIN196003515400623BECHINENONE951669160074BCANTHAXANTHIN1970111570135MEC1642250142120126MEC1631660041550137MEC184193105217190508AMEC183814524672862308BMEC183330613722941578CMEC1837320346440649AMEC182
40、16718572144761349BMEC18212592419920959CMEC182135715112380469DMEC1822194189161803710AMEC1812341136187004111MEC1602398051260505710BMEC181106207089203810CMEC1811994144154900312MEC17222400522701013ASTACINC1832701041241309014CHLOROPHYLLB3411052242221715CHLOROPHYLLA63260304773600从上述表格中可以发现，海胆酮（ECHINENONE）
41、、虾青素C182和C183是雨生红球藻的主要色素形式。同时，加入FE2的实验组含有的色素种类上与空白组一样，两组之间并无差别。但是，比较两组样品数据，发现相对对照组而言，实验组中各色素含量均有一定程度的增加。具体可见含量变化表（表4）。表4雨生红球藻实验组相对于对照组的色素含量变化TAB4CONTENTCHANGESOFINGREDIENTSINEXTRACTOFHPLUVIALISBETWEENEXPERIMENTALGROUPANDCONTROLGROUPCOMPOUND（组分）CONTENT（含量，G100MG干粉）FACTOROFCHANGE（变化倍数）实验组对照组SIPHONAXAN
42、THIN33141574211ASTAXANTHIN22011934114ECHINENONE110629775113CANTHAXANTHIN21571697127MEC164225212106MEC163166155107MEC18419311719112MEC1831218410223119MEC1822152818324117MEC18153974312125MEC16023982605092MEC172224227099ASTACINC18327012413112CHLOROPHYLLB34112422141CHLOROPHYLLA63264773133在本实验中，实验组中大部分种类
43、的色素其含量均高于对照组中相应的色素含量，说明FE2有利于色素的积累，加入二价亚铁离子，虾青素的合成能力也会增加。HARKER等人的实验称FE2在生长率方面可使得类胡萝卜素每单位养殖体积提升，添加FE2能使雨生红球藻由营养细胞转为胞囊细胞，并促进虾青素的形成23。蒋霞敏等人的实验表明磷、FE2对雨生红球藻中虾青素的积累有明显促进作用。他们推测是由于化学因子胁迫阻碍了细胞的分裂繁殖，使得游动细胞向不动孢子转化，形成胞囊，有利于类胡萝素等的积累。本实验的结果与这些报道也是相符的12。32添加过氧化氢对雨生红球藻累积虾青素的调控雨生红球藻中虾青素的合成也与其细胞内的活性氧有关，溶解氧和多种活性氧分子
44、都可以有效诱导细胞内虾青素的合成和积累。虾青素在细胞内可能起着抗氧化的作用，清除环境胁迫和过度氧化产生的活性氧，防止活性氧对细胞产生伤害。本实验研究添加过氧化氢对雨生红球藻累积虾青素的调控作用。321添加过氧化氢时，色素活体吸光值受光照强度影响的变化特征3211雨生红球藻797品系结果A强光照在H2O2添加作用中的影响强光环境中，添加H2O2时，雨生红球藻活体吸光的变化如图8所示。图8添加不同浓度H2O2时，于强光胁迫条件下，雨生红球藻797株藻液490NM活体吸光值的变化FIG8THECHANGEOFLIVINGABSORBANCEIN490NMOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALI
45、S797ALGAELIQUIDWITHDIFFERENTCONCENTRATIONSH2O2INHIGHLIGHTINGSTRESSCONDITION强光照实验条件下，高浓度组在前3天与其它两组表现出差异，后续4天差异不明显，并没有表现出明显的促进作用。在试验过程中，我们发现实验组细胞有死亡现象，这可能是由于H2O2的强氧化性所致。B弱光照在H2O2添加作用中的影响弱光环境中，添加H2O2时，雨生红球藻活体吸光的变化如图9所示。图9添加不同浓度H2O2时，于弱光照条件下，雨生红球藻797株藻液490NM活体吸光值的变化FIG9THECHANGEOFLIVINGABSORBANCEIN490NM
46、OFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS797ALGAELIQUIDWITHDIFFERENTCONCENTRATIONSH2O2INLOWLIGHTINGCONDITION同样的，在弱光实验条件下，第6天实验组OD值还略低于空白组，第7天便都高于空白组，因为没有继续试验，还不能明确是否有促进作用，可能是测量误差所致。3212雨生红球藻363品系结果A强光照在H2O2添加作用中的影响强光环境中，添加H2O2时，雨生红球藻活体吸光的变化如图10所示。图10添加不同浓度H2O2时，于强光胁迫条件下，雨生红球藻363株藻液490NM活体吸光值的变化FIG10THECHANGEOFLIVING
47、ABSORBANCEIN490NMOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS363ALGAELIQUIDWITHDIFFERENTCONCENTRATIONSH2O2INHIGHLIGHTINGSTRESSCONDITION在实验的第7天，空白对照组OD值比实验组OD值明显要大，这可能是由于H2O2的强氧化性所致，导致细胞死亡，虾青素积累受到影响，从而在OD值中体现。B弱光照在H2O2添加作用中的影响弱光环境中，添加H2O2时，雨生红球藻活体吸光的变化如图11所示。图11添加不同浓度H2O2时，于弱光照条件下，雨生红球藻363株藻液490NM活体吸光值的变化FIG11THECHANGEO
48、FLIVINGABSORBANCEIN490NMOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS363ALGAELIQUIDWITHDIFFERENTCONCENTRATIONSH2O2INLOWLIGHTINGCONDITION在实验的第7天，空白对照组OD值比实验组OD值明显要大，这可能是由于H2O2的强氧化性所致，导致细胞死亡，虾青素积累受到影响，从而在OD值中体现。322添加过氧化氢对雨生红球藻797株光合参数的影响表5给出了藻液在分装前的各个光合参数。表5分装前光合参数TAB5THEPHOTOSYNTHETICPARAMETERSBEFOREREPACKING分装前FT（光合有效辐射
49、（光量子）产量）（MOLM2S1）2766450F0暗处理（MOLM2S1）1921150QY（FV/FM）071QY暗处理（FV/FM）074CHL光吸收OD680OD7200073221强光照下光合参数变化强光照下，H2O2的添加是否会对雨生红球藻的光合参数产生影响，考虑到H2O2的强氧化性，本实验选择的H2O2的浓度较低。参数变化见下表。000100000020000003000000400000050000006000000分装前5小时第2天第3天第4天时间FTMOLM2S1高浓度低浓度空白图12强光照条件下雨生红球藻797株FT（光合有效辐射产量）变化FIG12THECHANGEOFFT（PHOTOSYNTHETICAVAILABLERADIATION）OFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISUNDERHIGHLIGHTINGCONDITION00050000010000001500000200000025000003000000350000040000004500000分装前5小时第2天第3天第4天时间F0MOLM2S1高浓度低浓度空白图
