1、本科毕业设计（20_届）糟醉带鱼中具抗氧化性乳酸菌的分离、筛选和鉴定所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月0目录1前言22材料与设备321原材料322试剂323仪器与设备324培养基33试验方法431糟醉带鱼的制作4311甜酒酿的制作4312糟醉带鱼的制作工艺432乳酸菌的分离、纯化4321分离5322纯化533具抗氧化性的乳酸菌的筛选534菌种的鉴定5341形态学观察5342生理生化特征5343分子生物学鉴定54结果与讨论841糟醉鱼样品中乳酸菌的分离与纯化842具抗氧化性乳酸菌的筛选843具抗氧化性乳酸菌的鉴定10431形态学鉴定10432理化鉴定10433分子
2、生物学鉴定115小结11致谢错误未定义书签。参考文献111摘要糟醉带鱼作为传统食品广为流传，但因其使用传统加工工艺，使产业发展受到制约。本试验从糟醉鱼中分离出乳酸菌，并以抗脂质过氧化率及与维生素E相比的抑制率为指标，用硫代巴比妥酸法筛选出具抗氧化性的菌株。结果表明从糟醉带鱼及其他糟醉鱼产品中共分离40个菌株，其中11株具抗氧化性，通过形态学观察、生理生化特征和分子生物学鉴定，证实这11个菌株均为耐久肠球菌（ENTEROCOCCUSDURANS）。这些菌株有可能应用于糟醉带鱼的生产中，将能到防止氧化、改善品质的效果。关键词乳酸菌；糟醉带鱼；筛选；抗氧化ABSTRACTSALTEDANDFERME
3、NTEDHAIRTAILWITHRICEISONEOFPOPULARTRADITIONALFOODS,BUTTHETRADITIONALPROCESSINGTECHNOLOGYHASRESTRICTEDTHEDEVELOPMENTTHELACTICACIDBACTERIASTAINSWASSEPARATED,ANDTHELACTICACIDBACTERIASTAINSWITHANTIOXIDATIVEACTIVITYWASSCREENINGED,SEDTHETBAMETHODTOTHERESISTANCEOFLIPIDPEROXIDATIONRATEANDTHEINHIBITIONRATIOW
4、ITHVITAMINEASTHEINDEXS40LACTICACIDBACTERIASTAINSWASSEPARATED,AND11LACTICACIDBACTERIASTAINSHAVETHEANTIOXIDATIVEACTIVITYFROMTHEIDENTIFICATIONOFMORPHOLOGY,PHYSIOLOGICALANDBIOCHEMICALCHARACTERISTICSANDMOLECULARBIOLOGY,ITSPROVEDTHATTHE11LACTICACIDBACTERIASTAINSAREENTEROCOCCUSDURANSIFTHESELACTICACIDBACTER
5、IASTAINSBEUSEDINTHEPROCESSINGTECHNOLOGY,THEMCANPREVENTOXIDATIONANDIMPROVEQUALITYKEYWORDSLACTICACIDBACTERIASALTEDANDFERMENTEDHAIRTAILWITHRICESCREENINGANTIOXIDATION21前言在我国，糟醉鱼作为一类传统食品在民间广为流行。在我国，糟醉鱼作为一类传统食品在民间广为流行，其有开肺之功、健脾之效。酒糟鱼产品中含有蛋白质、淀粉、粗纤维、脂肪、氨基酸、聚戊糖、灰分以及丰富的维生素、生长素等物质，还含有丰富的钙、磷、碘、锌、硒等多种矿物质及微量元素，以
6、及发酵过程中产生的酵母菌、多种清香醇甜因子等，且具有酒香味、米香味、腊香味，三味香气汇成一体，肉质紧密，富有弹性，有咬劲，色泽美丽，香气浓郁，久食不厌，经常食用可增强钙的吸收，促进身体强壮，营养价值大，含量稳定，开发利用价值高，一直受到人们的青睐1。其中，带鱼资源丰富，因此糟醉带鱼产品很是丰富。但是现有的方法仍为传统的糟制方法。传统的酒糟鱼以家庭作坊式生产为主，加工时间长，生产批量小，效率低下。受到生产条件和技术水平的限制，传统生产方式生产出来的酒糟鱼产品存在含盐量高、脂肪氧化过度等质量问题，且不同批次的产品在风味和品质上存在明显差异，难以形成统一的生产标准，亟需改进。糟醉鱼之所以具有独特的风
7、味，是多种微生物混合作用的结果，这些微生物多为常见的细菌、霉菌、酵母菌等。现在食品领域对微生物的研究日渐成熟，各种微生物的分离与筛选及鉴定的方法也越来越多。制备纯菌菌液制作发酵食品，不但可以达到规模化生产，使产品品质稳定，而且可缩短发酵食品加工时间，从而降低生产成本。其中的乳酸菌对糟醉鱼的品质有很大的影响。引起水产品变质的主要原因是脂肪的氧化，目前预防食品氧化主要通过添加一些抗氧化剂，如BHA、BHT、PG、TBHQ和VE等，但存在使用成本高，抗氧化性能弱以及近年来在毒理研究中确认的安全性问题等。此外，在实际生产应用中，加热等处理方法可导致抗氧化剂分解或挥发等损耗，故只能在加工后加入抗氧化剂。
8、然而许多产品的脂肪氧化在加工过程中就已经开始。因此，开发安全无毒、价格低廉并且可贯穿整个加工过程的优质天然抗氧化物成为研究热点。微生物资源丰富。生产周期短，原料低廉，微生物发酵法在将来很可能成为大规模获得食用抗氧化剂的一条有效途径。故而乳酸菌以其生产周期短，原料低廉，可通过发酵法大规模获得等显而易见的优势，成为更具竞争力和市场的新型抗氧化剂2。国外正在将具有抗氧化活性的乳酸菌应用于功能食品的开发和生产。乳酸菌是指一群通过发酵糖类产生大量乳酸的细菌总称。在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值较高，广泛应用于乳制品、蔬菜及肉制品的发酵与防腐中。许多乳酸菌除产生乳酸、乙酸、双乙酰和
9、过氧化氢外，还能产生多种具有抑菌或杀菌生物活性物质，在抑制各种病原菌和食物腐败等方面起重要作用，尤其是作为益生菌的重要成员之一倍受各界关注3。近年来，国内外对乳酸菌的生理活性有大量的研究报道。其中，乳酸菌的抗氧化活性也开始引起国内外大量专家学者的广泛关注。乳酸菌抗氧化机理现在还没有定论，有研究表明可能包括金属离子螯合能力、活性氧的清除、酶活性控制和乳酸菌的还原活性等。ATHIN4的实验表明，可以通过螯合离子防止高活性氧的生成，减少氧化反应不良效果；除此之外，也可以通过降低羟基自由基前体的含量来阻止羟基自由基毒性的产生。SULECOSKUN5等人用保加利亚乳杆菌菌悬液灌胃小鼠14天，提高了小鼠小
10、肠内非酶抗氧化能力。LIN等6研究中报道，在对19株乳酸菌包括嗜酸乳杆菌LACIDOPHILUS，保加利亚乳杆菌LBULGARICUS，嗜热链球菌STTHERMOPHILUS，长双歧杆菌B1ONGUM的一些菌株的无细胞提取物进行抗氧化实验发现，所有的被研究菌株对抗坏血酸的自动氧化具有抑制作用；活乳酸菌的无细胞提取物可螫合铁离子。在清除羟基自由基实3验中发现，活乳酸菌的无细胞提取物具有清除羟基自由基能力。LIN7等还在抗脂质过氧化实验中发现，嗜酸乳杆菌与长双歧杆菌的无细胞提取物对亚油酸过氧化反应、对荧光组织色素积累的抑制率、对造骨细胞膜脂质过氧化反应均具有抑制率；嗜酸乳杆菌与长双歧杆菌的无细胞提
11、取物都具有清除膜脂质过氧化反应产物丙二醛的能力，但对叔丁基过氧化氢并无清除能力。乳酸菌的抗氧化能力已经得到大量实验的证实，在其抗氧化活性的检测上面也有多种不同的方法，主要包括清除超氧阴离子自由基的能力、抗脂质过氧化法、清除羟自由基的能力、清除二苯基苦基苯肼自由基的能力等810。从糟醉带鱼中分离、筛选出具抗氧化性的乳酸菌，从而应用于制作糟醉带鱼的新工艺中具有现实的意义。2材料与设备21原材料带鱼新鲜带鱼，购自宁波水产批发市场，每尾重20050G；配料食盐、白酒、糯米均购自宁波大学农贸市场，用于自制糟醉带鱼；糟醉鲳鱼（三味可丰）、糟醉马鲛鱼（小岛人家）购于宁波鼓楼农产品展销中心。22试剂氯化钠，碳
12、酸钙，山梨酸钾，亚油酸，维生素E,硫酸亚铁，三氯乙酸，硫代巴比妥酸，氢氧化钠。23仪器与设备电子分析天平（901型）梅特勒托利多仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱（DHG9070A型）金瑞精密机械有限公司恒温培养箱（HWS128）尤尼柯（上海）仪器有限公司高压灭菌锅英国阿斯太欧ASTELL公司高速台式离心机TGL一161上海安亭科学仪器厂数显恒温水浴锅（HH6）国华电器有限公司分光光度仪（UV4802型）宁波江南仪器光学显微镜XSZG泰克仪器有限公司24培养基MRS琼脂培养基蛋白胨10G，牛肉膏10G，酵母粉5G，K2HPO42G，柠檬酸二铵2G，乙酸钠5G，葡萄糖20G，吐温801ML，MGSO
13、47H2O058G，MNSO44H2O025G，（琼脂1520G），蒸馏水1000ML。液体MRS培养基胰蛋白胨10G，牛肉膏10G，酵母粉5G，柠檬酸钠2G，葡萄糖20G，K2HPO42G，乙酸钠5G，吐温801ML，MGSO47H2O058G，MNSO44H2O025G，蒸馏水1000ML。分离纯化及保存用培养基MRS琼脂培养基加入2CACO3及02山梨酸钾。115，灭菌20MIN备用。扩大培养及活化用培养基液体MRS培养基120，灭菌20MIN备用。43试验方法31糟醉带鱼的制作311甜酒酿的制作3111工艺流程糯米去杂、清洗浸泡蒸煮淋水拌曲保温发酵甜酒酿3112操作要点去杂与清洗选择当
14、年生产的优质糯米为原料，经筛选除杂、碎米后用水淘洗23次直至淋出之水不带白浊为止。浸泡将淘洗干净的糯米置于水中,保持水面高于米面约10CM，根据温度控制浸米时间，一般夏季68H，冬季2024H。因此，在浸泡过程中可勤检查，用手指能将米粒捻搓成浆粉则说明米已浸透。蒸煮将已浸泡过的糯米，放入电磁炉内加热，待蒸汽全部透出饭面，浇热水于饭面，增加饭粒含水量，蒸煮米饭以松、软、透、不粘连，内心无白心而不糊、不烂为最佳。淋水将蒸煮好的米饭拿出，用清水淋，使其温度下降至35左右，饭温上下一致。淋饭速度要快，淋水量根据水温灵活掌握，使饭粒分离，且不糊为好。拌曲将适量的酒药均匀拌入冷却的饭粒内，将饭搭成U型窝。
15、保温发酵置于30的电热恒温培养箱中进行。312糟醉带鱼的制作工艺3121工艺流程甜酒酿带鱼（前处理）腌制干燥糟醉成品3122操作要点带鱼（前处理）首先在剖带鱼之前，要洗去覆盖在鱼体表面的一层粘液，以去除大量微生物减少对后续加工的污染。接着将带鱼去头、去尾和去内脏，去内脏时要仔细，不得将鱼胆搞破，流出胆汁会使鱼肉发苦。清洗后沥干表面水分，切成长约34CM的带鱼段。腌制采用优化后的湿腌工艺条件，在20下，20盐水中腌制3H，鱼水12的比例。干燥腌制鱼块45恒温干燥箱中进行脱水，干燥至合适水分。糟醉糟制工艺采用加酒量、加盐量和鱼糟比分别为71、47、122制作糟醉带鱼。成熟放30恒温箱中，待其发酵成
16、熟，大概15天左右。32乳酸菌的分离、纯化12称取10G糟醉带鱼样品，加入085的无菌生理盐水90ML，混匀配成稀释浓度分别为101、102、103、104的菌悬液。5321分离在无菌条件下，将制成的不同稀释度的菌悬液用无菌移液枪分别吸取1ML至培养皿中，后将MRS培养基倒入培养皿，轻轻混匀，静置20MIN，待凝固后倒置于35、37的恒温箱中培养48H。322纯化将培养好的平板取出，观察菌株生长的情况，计数。根据平板上菌落大小、形态、干湿、高度、透明度、颜色、边缘、透明圈等特征辨别出乳酸菌菌株，多次分离划线，进行纯培养。待菌株纯化后，接种于试管斜面，4下保存。33具抗氧化性的乳酸菌的筛选131
17、5采用硫代巴比妥酸法，以抗脂质过氧化率及与维生素E相比的抑制率为指标，筛选出具抗氧化性的乳酸菌。在05MLPBS溶液（浓度为002MOL/L，PH74）中加入1ML亚油酸的乳化液、1FESO41ML，再加入05ML样品，37水浴反应15H，混合液中加入02ML4TCA（三氯乙酸）、2ML08TBA（硫代巴比妥酸）。反应液100水浴反应30MIN，迅速冷却离心。纱布过滤，收集上清液，在波长532NM处测吸光值，即A532（样品）。以05ML维生素E代替样品，得到吸光值，即为A532（VE）。空白对照组以05ML活化培养基代替样品液，以PBS液加等体积的样品液离心过滤后调零，得到吸光值，即为A53
18、2（空白）。计算公式如下抗脂质过氧化率1A532（样品）/A532（空白）100与维生素E相比的抑制率A532（空白）A532（样品）/A532（空白）A532（VE）10034菌种的鉴定341形态学观察在MRS琼脂培养基中，在37下培养48H，观察CACO3透明圈的产生，初步鉴定。通过肉眼观察并记录细菌的菌落形态、大小、湿润度、凹凸、颜色等16。342生理生化特征主要通过过氧化氢酶试验，糖发酵试验等方法进行16。343分子生物学鉴定1721引物的设计用细菌通用引物扩增16SRDNA，引物由上海英俊生物工程公司合成上游引物5AGATTTGATCCTGGCTCAG3,下游引物5CGGCTACCT
19、TGTTACGAC3。样品前处理6配制一定量的牛肉膏蛋白胨液体培养基，分装于试管中，在121下湿热灭菌20MIN，冷却后，在无菌条件下接种保存好的待测菌种，在转速125转/MIN，温度37的摇床中振荡培养48H。DNA的提取取15ML菌液于EP管中，在10,000RMP转速下离心3MIN，沉淀用STET液洗涤一次，再次离心3MIN，后将加入400LTE溶液，混匀；加入50MG/ML溶菌酶溶液8L，在37下保温20MIN；加入RNASE10L，至终浓度25G/ML，然后加入10SDS溶液005ML，在37下保温10MIN；加入蛋白酶K10L，终浓度为50G/ML，37保温20MIN；加入等体积苯
20、酚，混匀，10,000RMP转速下离心5MIN，取上清液于另一试管；重复该步骤一次，以减少杂质；离心好的上清液中加入等体积的氯仿，混匀，在10,000RMP转速下离心5MIN，取上清液于另一支试管中；加入1/10体积醋酸钠和2倍体积乙醇溶液，在10,000RMP转速下离心10MIN，去上清液，用70乙醇洗涤沉淀一次，在室温下晾干，注意勿使DNA完全干燥；将干燥好的DNA回溶于40LTE溶液中。PCR反应PCR使用的材料主要有4种作为模板的DNA分子、DNA引物、DNA聚合酶、4种三磷酸脱氧核苷酸。将4种材料放在合适的缓冲液体系中，每一扩增的循环是首先让所要扩增的DNA双链在高温下变性95为最适
21、的变性温度，双链解开成单链；第二步是迅速把缓冲液降到合适的温度，使DNA复性；然后把温度升到70左右，这是DNA延伸的最适温度，10秒钟的时间完成延伸，形成双链，然后重复此循环，即变性复性延伸，完成PCR过程。细菌样品PCR反应体系如下H2O165LBUFFER25LMG225LDNTP15L1492R05L27F05LTAQ02LDNA1LPCR扩增产物的电泳检测及鉴定取PCR产物5L，加2L上样缓冲液，上样于1的琼脂糖凝胶上，同时在一点样孔中加5LDNAMARKER作参照。恒压140V/CM，电泳30MIN，并在紫外透射仪上观察，照相。如果PCR产物为一条很亮的亮带，且扩增片段大小与设计相
22、符，并无其它杂带，即可以进行PCR产物的回收。PCR产物回收刷洗电泳槽及相应用具。避免其他DNA的污染。40V电泳半小时。紫外检测切下所需片断长度的胶，使它尽可能小。将切取的琼脂糖300MG捣碎按重量比13DNA片段溶液RJSOLUTION加入RJSOLUTION溶液。750水浴10MIN，使琼脂糖完全融化，每2MIN颠倒混匀1次。将融化后的琼脂糖液移入吸附柱，12,000RMP离心1MIN，倒掉收集管中的液体，再将吸附柱放入同一个收集管中。向吸附柱中加入500LWASHBUFFER，静置1MIN后，离心15S。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。如果室温低于20，离心前先静置1M
23、IN。12,000RMP离心1MIN。吸附柱放入一个干净的15M1离心管中，在吸附膜中加入30L水，静置1MIN后，12,000RMP离心1MIN。将15M1离心管DNA于20保存。连接反应用纯化好的DNA片断与线状载体DNA建立以下连接反应体系PMDT18载体05LSOLUTION25LDNA45L16连接45分钟。感受态细胞的制备将宿主菌大肠杆菌DH5在琼脂培养基平板上划线，37培养20H。从平板中取出1个2MM3MM大小的单菌落，移至含50M1LB培养基的500M三角瓶中，37300RPM/MIN强烈振荡培养3H，使细胞的溶度达到5107个细胞/ML，此时，细菌的OD600一般在0204
24、之间，为对数生长前期。将培养物于冰上放置1H至少30MIN，然后转移到2个50ML的离心管中，4,000RPM，4离心10MIN。去上清，倒置离心管LMIN，流尽剩佘液体，然后加入10ML、用冰预冷的01MOI/LCACL2致敏液悬浮细胞，置于冰上L0MIN。4,000RPM,4下离心10MIN回收细胞，弃上清，每500M1的原培养物再加入2M1冰冷的01MOL/LCACL2溶液，悬浮细胞。按每份200L分装细胞，若未马上转化，可以加入终浓度为10的灭菌甘油。置于70冻贮。连接产物的转化将连接产物吸到100L感受态细胞中，混合均匀，置于冰上30分钟。42热休克90秒，迅速放回冰中，将细胞冷却2
25、分钟后，加入800LLB培养基，37，125RPM，摇床振荡培养细菌90MIN。取200L转化混合物铺于LB琼脂平板上（LB琼脂中含有适当浓度的抗生素），室温下放置30MIN，待溶液完全被琼脂吸收后，倒置平皿37培养16小时。随机挑选阳性重组体作PCR进行初步检测，并振荡培养。DNA序列测定分析通过上述方法制备的重组质粒DNA。送上海英俊生物工程有限公司测序。用DNAMAN软件进行序列同源性分析和比对。84结果与讨论41糟醉鱼样品中乳酸菌的分离与纯化对实验室自制的二种糟醉带鱼样品每隔3天进行乳酸菌分离筛选，同时也对市售的糟醉鱼产品及自制的糟醉鱼酒酿进行乳酸菌分离筛选，共分离出40个菌株，结果如
26、表1所示。表1分离得到的乳酸菌TABLE1THESEPARATEDLACTICACIDBACTERIASTAINS样品乳酸菌编号数量糟醉带鱼A（糟醉第64天）1164A，1164B，1164C，1164D，1164E，1164F，1164G，1164H，1164I，1164J10糟醉带鱼B（糟醉第50天）550A，550B，550C，550D，550E，550F，550G，550H，550I，550J，550K，550L，550M，550N14糟醉带鱼B（糟醉第82天）582A，582B，582C3糟醉鲳鱼（三味可丰）CA，CB，CC，CD，CE，CF，CG7糟醉马鲛鱼（小岛人家）MJA，MJ
27、B2糟醉鱼酒酿（发酵94天）JA，JC，JD，JE4从表1可见，在整个糟醉期间，糟醉带鱼A样品在第64天、糟醉带鱼B样品乳酸菌在50天和82天才分离得到乳酸菌，主要原因可能是，在发酵前期，由于乳酸菌与其他菌种（特别是霉菌和酵母菌）相竞争，尚未成为优势菌，发酵过程中霉菌和酵母菌生长较旺盛，随着发酵进一步进行，营养物质开始变的匮乏，空间的限制，导致霉菌和酵母的生长进入死亡期，糟醉2、3个月以上时，乳酸菌抑制住杂菌，开始成为环境中的优势菌。另外，从不同样品中分离得到乳酸菌时间有差别，原因可能与样品原始菌群分布有关，糟醉带鱼A酒糟发酵11天与糟醉带鱼B酒糟发酵5天，发酵时间不同导致糟醉过程中原始菌群在
28、数量组成上的差异，使分离得到的乳酸菌的时间不同，但是加上酒糟发酵时间，分离得到乳酸菌时间基本相似。而糟醉鲳鱼与马鲛鱼分离得到乳酸菌的时间距离生产日期分别为104天和134天，比自制糟醉带鱼分离时间久，主要原因是发酵温度的差异。在自制糟醉带鱼时发酵温度控制在37，而糟醉鲳鱼与马鲛鱼产品一般冷藏或室温保存，因此延长了分离时间。42具抗氧化性乳酸菌的筛选为筛选出具抗氧化性的乳酸菌，以抗脂质过氧化率及与维生素E相比的抑制率为指标，采用硫代巴比妥酸法，对分离出的40株菌株进行抗氧化活性筛选，结果如表2所示。从表2可知，40株菌株里具有抗脂质过氧化率的30株，但它们相差很大，最低的抗脂质过氧化率123，最
29、高的达到7706；其中抗脂质过氧化率有13株达50以上，6株30以上，8株10以上，3株10以下。同时，40株菌株里与VE相比具抑制率的有30株，最高抑制率为6774，最低为079；其中11株与维生素E相比的抑制率达50以上，6株30以上，10株10以上，3株10以下。9表2不同菌株的抗氧化性检测结果TABLE2THERESULTSOFDETECTIONWITHANTIOXIDATIVEACTIVITY菌株抗脂质过氧化率与VE相比抑制率菌株抗脂质过氧化率与VE相比抑制率菌株抗脂质过氧化率与VE相比抑制率550AJA43003413CA29732582550BJC77066774CB323229
30、91550C746649JD29172276CC550DJE34002764CD26322033550E1164A41543776CE47374286550F605658111164B66415986CF123079550G528650681164C17051528CG63065600550H722269331164D27072500582A66065854550I1164E582B50004132550J1164F34883147582C18521653550K625056601164GMJA58975425550L8387511164H11941103MJB58885370550M2552
31、23001164I550N525847891164J57255137注“”表示无抗氧化性。而且，从抗脂质过氧化率及与维生素E相比抑制率两个指标而言，二者具有很好相关性，即抗脂质过氧化率高的，其与维生素E相比抑制率也高。因此，本试验以抗脂质过氧化率及与维生素E相比抑制率都达到50以上为具有相对较高抗氧化性标准，共筛选出11个菌株，分别为1164B，1164J，550F，550G，550H，550K，582A，CG，JC，MJA，MJB。在11个菌株中自制糟醉带鱼A中分离出的菌株有2株具较高的抗氧化效果，8株抗氧化效果很差甚至不具抗氧化性；糟醉带鱼B中分离出的菌株中，5株具较高的抗氧化效果，9株抗
32、氧化效果很差甚至不具抗氧化性；糟醉带鱼B继续发酵得到糟醉带鱼C中，虽然分离出的乳酸菌菌株较少，只有3株，但是2株抗氧化性较好。产生这种现象与乳酸菌的菌株性能有关，部分乳酸菌的主要性能是产酸，部分乳酸菌主要性能在于抗氧化，同时，也与样品的氧化程度相关，当时糟醉带鱼氧化程度不严重，有抗氧化性和不具抗氧化性的乳酸菌都存在；随着糟醉的进行，样品氧化已较严重，基本只有具抗氧化性的乳酸菌能够存活。这一点在市售糟醉产品中也可以验证在糟醉马鲛鱼样品中分离出的两个菌株皆具有较高的抗氧化性，主要原因是产品购来的生产日期较早，已经氧化比较严重，在同时因为马鲛鱼的脂肪含量很高，脂质易氧化，此条件下生存的乳酸菌会具有很
33、高的抗氧化效果。糟醉鲳鱼因氧化没有这么严重，有抗氧化性和不具抗氧化性的乳酸菌都存在。1043具抗氧化性乳酸菌的鉴定对1164B，1164J，550F，550G，550H，550K，582A，CG，JC，MJA，MJB这11株抗氧化效果较好的菌株进行形态学观察和生理生化鉴定。431形态学鉴定通过在MRS琼脂培养基中，观察菌株的菌落形态、大小、湿润度、凹凸、透明度、颜色、透明圈等，观察菌体形态。乳酸菌的菌落很小，大约13MM，圆形凸出，表面光滑，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在周围还能产生CACO3的透明圈。11株菌株菌落形态基本相同，选取550H和1164B的菌落形态，如图1。550H1164B图1
34、乳酸菌菌落形态FIGURE1COLONYMORPHOLOGYOFTHELACTICACIDBACTERIA432理化鉴定通过过氧化氢酶试验，糖发酵试验等方法进行鉴定，11株菌株的理化鉴定结果见表3。表3理化鉴定结果TABLE3THERESULTSOFPHYSICALANDCHEMICALIDENTIFICATION菌株过氧化氢酶试验糖发酵试验产酸糖发酵试验产气菌株过氧化氢酶试验糖发酵试验产酸糖发酵试验产气1164B582A1164JCG550FJC550GMJA550HMJB550K注“”表明结果呈阳性，“”表明结果呈阴性。11从表2可见，11株菌株均为过氧化氢酶试验呈阴性，糖发酵结果产酸不产
35、气，符合乳酸菌的理化特征。433分子生物学鉴定用16SRDNA方法进行PCR扩增，经测序得到有效序列，11个菌株部分序列结果如下AATGGGGGGGTGCTATACATGCAAGTCGTACGCTTCTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAGGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTG
36、GTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGT
37、CCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAG
38、TGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAAGCTTACCAGGGTCTTGACATCCTGTGACCACTCTAGAGATAGAGCTTCCCCTTCGGGGGCAAAGTGACACGGTGGTTGCATGGCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTACGTCCCGCACGAGCGCAGCCCTGATGTAGTGCCATCATCAGTTGGCACTCTAGCAGGA
39、CTGCCGGTGACAAACCGAGAG结果显示菌株与耐久肠球菌（ENTEROCOCCUSDURANS）的同源性为998，表明菌株为耐久肠球菌（ENTEROCOCCUSDURANS）。5小结从自制糟醉带鱼A糟醉64、糟醉带鱼B糟醉50天和82天的样品中以及三味可丰糟醉鲳鱼、小岛人家糟醉马鲛鱼和糟醉鱼酒酿中共分离40个菌株，但它们分离得到时间都较晚，在2、3个月以后；采用硫代巴比妥酸法，以抗脂质过氧化率及与维生素E相比的抑制率都达到50以上为指标，筛选具抗氧化活性的菌株，共筛选出11个菌株；对这11个菌株通过形态学观察、生理生化特征和分子生物学鉴定，证实这11个菌株均为耐久肠球菌（ENTERO
40、COCCUSDURANS）。参考文献1张桂珍,余爱国,佘晓格酒糟鱼营养成份分析J江西大学学报自然科学版19891342郭松年,田淑梅,白洪涛乳酸菌及乳酸菌发酵食品J粮食与粮食工业,2005,120139453余焕玲,晏萍乳酸菌的生理功能及在食品中的应用J饮料工业,2000,30410134ATHINAA,EDDYJS,MARJONHJB,ETALANTIOXIDATIVEPROPERTIESOFLACTOBACILLUSSAKEUPONEXPOSURETOELEVATEDOXYGENCONCENTRATIONSJFEMSMICROBIOLOGYLETTERS,2001,20387945SULE
41、CEFFECTOFTWOSTRAINSOFLACTOBACILLUSDELBRUCKIISUBSPBULGARICUSONNITRICOXIDEGENERATIONANDANTIOXIDANTSTATUSOFRATSMALLINTESTINEMMEDICINALCHEMISTRYRESEARCH，20096LINMY,YENCLANTIOXIDATIVEABILITYOFLACTICACIDBACTERIAJAGRICFOODCHEM,1999,47146014667LINMY,YENCLREACTIVEOXYGENSPECIESANDLIPIDPEROXIDATIONPRODUCTSCAVE
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