1、本科毕业设计（20_届）增强型绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录摘要3IABSTRACT错误未定义书签。引言31材料与方法511材料5111菌株与质粒5112工具酶及试剂5113培养基512方法5121引物设计及合成5122目的基因EGFP编码序列的克隆5123PCR扩增产物的鉴定6124目的片段回收6125连接6126大肠杆菌DH5感受态细胞的制备6127转化7128阳性克隆的筛选与鉴定7129PMD19EGFP质粒的抽提81210重组质粒PET28AEGFP的构建及鉴定81211转EGFP基因大肠杆菌的获得及原核表达条件的研
2、究102结果与分析1121目的基因EGFP编码片段的克隆1122PMD19EGFP质粒的构建和鉴定1123重组质粒PET28AEGFP的构建和鉴定1224转EGFP基因的大肠杆菌原核表达条件的研究133讨论144结论15致谢错误未定义书签。参考文献错误未定义书签。1摘要绿色荧光蛋白GREENFLUORESCENTPROTEIN，GFP基因是在细胞内稳定表达，在蓝光或长紫外光的激发下，不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光的新型报告基因。增强型绿色荧光蛋白ENHANCEDGREENFLUORESCENTPROTEIN，EGFP是GFP的一个突变体，发出的荧光强度要比GFP大六倍以上，更
3、适合作为一种报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体定位和转运等。本实验旨在构建以EGFP为标记的原核表达载体，观察EGFP基因在大肠杆菌中的表达情况，探索其作为报告基因在以后研究中应用的可能性。根据已知的EGFP序列，设计一对引物FEGFP和REGFP，分别含有NDEI和ECORI酶切位点，通过PCR从PFGCEGFP质粒中克隆EGFP编码序列，并将其与PMD19TVECTOR连接，以此构建PMD19EGFP。将其双酶切后与PET28A连接，得到重组质粒PET28AEGFP。转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达，在诱导的不同时间收集菌体沉淀，并置于长波紫外线下照射，观察细胞
4、中绿色荧光蛋白的表达量。经IPTG诱导后，细菌培养物在紫外线的照射下，发出明亮的绿色荧光。本实验成功构建了原核表达载体PET28AEGFP，为应用EGFP作为报告基因和筛选标记奠定了实验基础。关键词增强型绿色荧光蛋白；重组质粒；大肠杆菌；原核表达2ABSTRACTTHEGREENFLUORESCENTPROTEINGFPGENEISANEWREPORTERGENEWHICHCANBEEXPRESSEDINLIVINGCELLS,UNDEREXCITATIONOFLONGUVLIGHTORBLUELIGHT,GREENFLUORESCENCECANBEEMITTEDWITHOUTOTHEREXT
5、ERNALSUBSTRATETHEENHANCEDGREENFLUORESCENTPROTEINEGFPISAMUTANTOFGFP，WHICHCANEMITSIXTIMEHIGHERFLUORESCENCEASAREPORTERGENE,ITISMORESUITABLEFORSTUDYINGGENEEXPRESSIONANDREGULATION,CELLDIFFERENTIATIONANDPROTEINLOCALIZATIONANDTRANSFERINLIVINGORGANISMSTHEPURPOSEOFTHISSTUDYWASTOCONSTRUCTTHEEGFPLABELLEDPROKAR
6、YOTICEXPRESSIONVECTORANDDETECTTHEEXPRESSIONOFEGFPINESCHERICHIACOLIACCORDINGTOTHEOPENREADINGFRAMEOFKNOWNEGFPGENE,APAIROFPRIMERS,WHICHCONTAINSTWORESTRICTIONENZYMESITESNDEANDECORRESPECTIVELY,WASDESIGNEDAFRAGMENTOFEGFPGENEWASOBTAINEDBYPCRAMPLIFICATIONFROMPFGCEGFPPLASIMDTHENTHEPCRPRODUCTSWERELINKEDTOPMD1
7、9TVECTORSOASTOCONSTRUCTPMD19EGFPITWASDIGESTEDANDLIGATEDWITHPET28A,TOCONSTRUCTTHERECOMBINANTPLASMIDPET28AEGFPTHEPET28AEGFPWASTRANSFORMEDINTOECOILBL21INDUCEDBYIPTG,THEBACTERIALDEPOSITONWASCOLLECTEDATDIFFERENTTIMEANDEXCITEDBYLONGWAVEULTRAVIOLETLIGHTTODETECTTHEEXPRESSIONOFEGFPECOILBL21SHOWEDBRIGHTLYGREE
8、NFLUORESCENTWHENEXCITEDBYLONGWAVEULTRAVIOLETLIGHTAFTERINDUCTIONTHEPROKARYOTICEXPRESSIONVECTORPET28AEGFPWASCONSTRUCTEDSUCCESSFULLYTHISWORKLAIDTHEEXPERIMENTALFOUNDATIONFORTHEUSEOFEGFPASAREPORTERANDSELECTIVEMARKERKEYWORDEGFPRECOMBINANTPLASMIDECOLIPROKARYOTICEXPRESSION3引言在水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内存在一类生物发光蛋白绿色荧光蛋白
9、GREENFLUORESCENTPROTEIN，GFP1。它在紫外或蓝色波长范围的光线激发下，依靠钙离子的帮助能够发出绿色荧光，并在活细胞内稳定表达。GFP的分子量为27KD，由238个氨基酸构成，由11个片层组成桶状构成疏水中心，第6567位氨基酸SERTYRGLY形成发光团，是主要发光的位置。发光的过程中还需要冷光蛋白AEQUORIN的帮助，且这个冷光蛋白与钙离子可产生交互作用，由此产生绿色荧光2。它在395NM处具有最大吸收高峰，在475NM处还有一个肩峰3。作为一种新型的标记分子，GFP具有诸多优点而备受关注1便于检测无需底物和辅助因子提供能源，可被光直接激发；2荧光特性稳定对高温60
10、、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂等大多具有较强抗性，对光漂白有较强的耐受性，3对细胞或组织无毒害GFP与目的基因融合后对目的基因的表达没有多大的影响，也不会损害宿主细胞；4通用性和共用性GFP的表达不受宿主范围的限制，也没有细胞种类和部位的限制；5分子量小，便于构建载体与其他序列一起构建载体之后不至于使载体过大影响转化频率；6可进行活细胞定时定位观察能够在细胞和生物体内对目标基因的表达产物进行实时示踪，对高等动物或植物进行转基因标记和体内观察；7不受假阳性干扰，灵敏度高其他生物本身不含有GFP，不会出现假阳性结果，比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分辨率；8易于得到突变体可通过不同的方法得到GF
11、P的突变体，如荧光强度增加或者颜色改变等；9能制成永久标本光漂白和福尔马林的固定都不容易破坏GFP的荧光，利用这个特点可以制成标本用于长期保存48。正是由于GFP具有上述优点，它在分子生物学和细胞生物学研究中有广阔的应用前景。不同种的蛋白质N端或C端能与GFP融合，但其天然蛋白的特性又不会受到影响，因此，GFP能用来研究蛋白质在细胞中的定位、转移、相互作用，作为一种“荧光标签”，它可用于研究。BAULCOMBE等将马铃薯X病毒和融合蛋白载体PVXGFP接种菸草NCLEVELANDII12D后，在紫外光下可以直接观察到病毒侵染的确切部位9。KHLER等用拟南芥叶绿体蛋白的RECA序列连接GFP，
12、结果表明GFP标记的RECA序列存在于叶绿体的基质中10。GFP常常用于构建基因工程的表达载体。SUMMERS等用GFP作为报告基因构建两种转录型的穿梭报告载体并用于丝状蓝藻的研究11。GUPTA等利用GFP构建载体并使其在大肠杆菌重组突变体中的过量表达12。孙丽萍等构建了人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体并转染HEK293T细胞，为进一步深入探索NOD2启动子的始动原因及调控机制奠定基础13。姜伯乐等将增强型绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到不含启动子的载体PLAFR6上，构建报告质粒PLZY，为研究目的基因在不同宿主中的表达和研究植物病原细菌型效应物蛋白的植物亚细胞定位提供了材料14。
13、何淑雅等将携带人脆性X相关基因1FRAGILEXRELATEDGENEL，FXR1与EGFP的融合并构建表达载体，为研究FXR1基因在脆性X综合征中的作用机制奠定基础15。张鲲等构建了大肠杆菌双顺反子表达载体，并中研究绿色荧光蛋白的表达水平16。尽管GFP作为报告基因具有许多优点，但天然的GFP仍存在一些缺陷而使其无法更好地应用于科学研究，如发光较弱，耐光性差。为了解决上述问题，需要对GFP作出一些改进，主要包括以下两个方面1改变GFP的荧光强度，2改变GFP的颜色。通过点突变的方法将SER65THR，增强了荧光强度，另外，PHE64LEU点突变使GFP在哺乳动物细胞37的培养条件下能更有效地
14、进行构象折叠。向GFP引入遗传突变可以获得不同颜色的变种，改变GFP颜色的点突变主要针对其6567的发光位点及构象上接近发光位点的氨基酸1719。增强型GFPENHANCEDGFP是其中最具有代表性的一种，它的荧光强度显著提高。因此更适合作为报4告基因来研究基因的表达、信号转导、蛋白运输与定位等。在蛋白水平检测导入的外源基因是否表达的过程中，我们往往需要通过多次的蛋白纯化和电泳检测的步骤或者通过WESTERN杂交的方法，整个过程耗时长，步骤繁琐，无法迅速得知蛋白是否表达。本实验可以利用增强型绿色荧光蛋白为标记构建一个可以直观地观察蛋白表达情况的原核表达载体PET28AEGFP，试图在大肠杆菌中
15、克隆并高效表达该载体，以利进一步研究其生化特，并进一步探索其作为报告基因的优势，为其在以后的研究奠定基础。51材料与方法11材料111菌株与质粒大肠杆菌DH5、TOP10和BL21菌株均为本实验室保存。质粒PFGCEGFP，PET28A为本实验室保存，质粒PMD19T购自TAKARA公司。112工具酶及试剂小量胶回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒及IPTG均购自上海生物工程公司，限制性内切酶ECORI、NDEI、SOLUTIONI、DNAMARKER均购自TAKARA公司，其他所用试剂均为国产分析纯。113培养基采用LB培养基，其他试剂及培养基均由本实验室配制。12方法121引物设计及合成根据GE
16、NBANK中已知的EGFP编码序列，自行设计1对引物FEGFP、REGFP。上游引物FEGFP5CCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGA3，含有NDEI酶切位点，下游引物REGFP5GGAATTCCTAGGATCCCTTGTACAGCT3，含有ECORI酶切位点。引物由上海生物工程公司合成。122目的基因EGFP编码序列的克隆以实验室存有的质粒PFGCEGFP为模板，分别以引物FEGFP、REGFP进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下10EXTAQBUFFER25LDNTPS（25MMEACH）2LFEGFP1LREGFP1L质粒DNA1LTAKARAEXTAQ（5U/L）05LDD
17、H2O17LTOTAL25L反应程序设置如下6循环次数温度时间1943MIN34941MIN551MIN721MIN1728MIN14保存123PCR扩增产物的鉴定称取02G琼脂糖置于锥形瓶中，加入50TAE电泳缓冲液50ML，置于微波炉中加热至琼脂糖完全融化，一般煮沸三次，配制成1琼脂糖凝胶溶液。将EB加入锥形瓶中并混匀，之后倒入选定的胶膜中，插入相应的梳子。过20MIN后待凝胶完全凝固，小心拔出梳子，将凝胶放入装有50TAE电泳缓冲液的电泳槽中，使电泳液刚没过胶面（1MM），取5L待电泳的DNA样品与1L的6LOADINGBUFFER在封口膜上混匀，用移液枪将样品加到梳孔中，以100V电泳
18、20MIN左右，在紫外灯下观察结果和拍照。124目的片段回收1打开水浴锅，将温度设到5560，待温度上升后将ELUTIONBUFFER放在水浴锅里预热。2将空的EPPENDORF管置于电子天平上称重，记下重量之后将切下的胶块放入管中再称重量，两者相减，若两者之差小于300MG（针对1琼脂糖凝胶溶液），再加入300LBINDINGBUFFER，放入水浴锅10MIN。3将管内的溶液转移到带有离心柱的收集管内，放置2MIN，之后10000RPM离心1MIN，弃去外套管内的废液。4加入500L的WASHSOLUTION，10000RPM离心1MIN，弃去外套管内的废液。5重复上述步骤之后倒掉外套管内的
19、废液后离心10000RPM离心30S，打开盖子，在温室下晾干10MIN。6将离心柱放入EPPENDORF管中，加入40L的已经预热的ELUTIONBUFFER。7放置2MIN后，10000RPM离心1MIN后放置20冰箱中保存。125连接使用PMD19TVECTOR（TAKARA，日本）进行连接反应，4连接过夜。反应体系如下SOLUTION5L回收产物5LPMD19TVECTOR05LTOTAL105L126大肠杆菌DH5感受态细胞的制备1取70甘油保存的DH5菌种20L，接种于20MLLB液体培养基中，37下220250RPM振荡过夜。2取上述菌液20L，接种于20MLLB液体培养基中，37
20、下220250RPM振荡254H，至OD8000506。取上述菌液1ML于无菌EPPENDORF管中，盖上盖，4下5000RPM离心5MIN。3去上清，吸干管底残留的LB培养基，用4冰浴预冷的CACL2（01M）溶液400L重悬菌体，用移7液枪混匀。4置于4培养箱，冰浴30MIN。54下4000RPM离心10MIN，彻底去上清，用200LCACL2（01M，预冷）重悬菌体，用移液枪轻轻混匀。6置于冰浴27H可用于转化。127转化使用自制的大肠杆菌DH5感受态细胞进行转化。1无菌条件下，取10L连接产物，加入200L大肠杆菌DH5感受态细胞中，用枪头轻轻混匀（冰上操作）。24冰浴30MIN。34
21、2精确热激90S。4立即转入冰水中冰浴12MIN后，恢复到室温。5加入800L无抗生物LB培养基，混匀。6将EPPENDORF管置于三角瓶中，37恒温摇床180RPM振荡培养2H。7室温下5000RPM离心4MIN，吸去上清900L，余下100L液体重悬菌体。8将菌液加入37预热的LB固体培养基（40G/MLCAB），涂布至干。9将培养基倒置于37恒温培养箱中，培养1224H。128阳性克隆的筛选与鉴定1无菌条件下，随机挑取4个单菌落分别接种于4个装有1MLLB液体培养基（40G/MLCAB）的EPPENDORF管中。2置于37恒温摇床，180RPM振荡培养4H。3进行菌液PCR鉴定，扩增产物
22、使用1琼脂糖凝胶电泳检测。建立PCR反应体系如下10EXTAQBUFFER25LDNTPS（25MMEACH）2LFEGFP1LREGFP1L菌液1LTAKARAEXTAQ（5U/L）05LDDH2O17LTOTAL25L8反应程序如下循环次数温度时间1943MIN34941MIN551MIN721MIN1728MIN14保存129PMD19EGFP质粒的抽提1打开水浴锅，将ELUTIONBUFFER预热至60。2将SOLUTION放在冰上。3从每管中分别取1ML菌液，12，000RPM离心2MIN收集菌体，倒尽或吸干培养基。4在菌体沉淀中加入250LSOLUTION，吸打至彻底悬浮菌体。5加
23、入250LSOLUTION，并将EPPENDORF管横放在食指上，立即温和颠倒10次至充分混匀。6加入250LSOLUTION，立即温和颠倒混匀10次，方法与（5）一样。712，000RPM离心10MIN。8将上清全部小心移入吸附柱，8，000RPM离心30S，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。9向吸附柱中加入500LWASHSOLUTION，10，000RPM离心1MIN。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。10重复步骤8一次。11将空吸附柱和收集管放入离心机，12，000RPM离心2MIN。12将吸附柱放入干净的15MLEPPENDORF管中，在吸附膜中央加入50
24、LELUTIONBUFFER，室温静置2MIN，10，000RPM离心1MIN，将所得到的质粒DNA溶液置于20保存。1210重组质粒PET28AEGFP的构建及鉴定PMD19EGFP质粒经NDE和ECOR双酶切，酶切反应体系如下DDH2O28L10HBUFFER5LNDE1LECOR1LPMD19EGFP15LTOTAL50L9反应条件为37水浴6H，将PET28A质粒经NDE和ECOR双酶切，酶切反应体系如下DDH2O23L10HBUFFER5LNDE1LECOR1LPET28A20LTOTAL50L反应条件为37水浴6H。将所有酶切产物置于65C的水浴锅中30MIN之后使用1琼脂糖凝胶电
25、泳检测。紫外灯下切胶回收，在SOLUTION作用下，4连接过夜，连接体系如下，得到的重组质粒命名为PET28AEGFP。SOLUTION5L回收酶切之后的PET28A（大片段）1L回收酶切之后的PMD19EGFP（小片段）4LTOTAL10L连接产物转化入大肠杆菌DH5感受态细胞，在含有卡那霉素（40G/ML）的培养基上挑阳性克隆扩增，鉴定。扩大培养12H之后用质粒提取试剂盒提取质粒。再转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，在含有卡那霉素的培养基上挑阳性克隆扩增，经ECORI、NDEI双酶切鉴定和PCR鉴定，PCR反应体系和反应条件同目的基因EGFP克隆时的扩增条件重组质粒PET28AEGFP的构
26、建见图1。10图1重组质粒PET28AEGFP的构建图FIG1THECONSTRUCTIONOFRECOMBINANTPLASMIDPET28AEGFP1211转EGFP基因大肠杆菌的获得及原核表达条件的研究取10L重组质粒加入大肠杆菌BL21感受态细胞中，将转化菌液涂布含卡那霉素的平板上，37培养过夜。筛选大肠杆菌阳性转化子进行PCR扩增及鉴定。经1琼脂糖凝胶电泳检测之后，保存含有EGFP基因的阳性克隆。将转EGFP基因大肠杆菌接种于LB培养基中，37培养过夜。过夜培养物接入LB培养液中，37振荡培养，加入IPTG至终浓度为1MMOL/L，在诱导0，1，2，3，4，5H后离心收集菌体沉淀，并
27、置于长波紫外线下照射，观察细胞中绿色荧光的表达。112结果与分析21目的基因EGFP编码片段的克隆以质粒PFGCEGFP为模板，用引物扩增获得的PCR产物经过1琼脂糖凝胶电泳，在750BP处有单一的扩增条带（图2），与EGFP编码序列长度相符合，将其命名为EGFP。图2EGFP编码片段电泳图1DL2000MARKER2EGFP基因片段FIG2ELECTROPHORESISANALYSISOFPCRPRODUCTSOFEGFPGENE1DL2000MARKER2FRAGMENTSOFEGFPGENE22PMD19EGFP质粒的构建和鉴定将PCR扩增产物从琼脂糖凝胶中回收后，与PMD19T载体以S
28、OLUTIONI4连接过夜，转化入大肠杆菌菌株DH5，在含有羧苄青霉素的培养基上挑取白色菌落通过PCR验证，获得EGFP基因目的条带750BP（图31），扩大培养12H之后抽提质粒，通过限制性内切酶NDEI、ECORI进行双酶切验证，得到750BP的EGFP小片段（图32），成功构建PMD19EGFP质粒。12图31PCR鉴定PMD19EGFP质粒图32双酶切鉴定PMD19EGFP质粒1DL2000MARKER2,3EGFP基因片段1DL2000MARKER2EGFP基因片段FIG31IDENTIFICATIONOFPMD19EGFPPLASMIDBYPCRFIG32IDENTIFICATIO
29、NOFPMD19EGFPPLASMIDBY1DL2000MARKER2,3FRAGMENTSOFEGFPGENERESTRICTIVEENZYMEDIGESTION1DL2000MARKER2FRAGMENTSOFEGFPGENE23重组质粒PET28AEGFP的构建和鉴定将PET28A和PMD19EGFP质粒同时进行双酶切，分别回收大小片段之后将其连接，构建得到的重组质粒命名PET28AEGFP，将其转化至大肠杆菌BL21，经过夜培养后，提取质粒，分别以PCR法和限制性内切酶NDEI、ECORI进行双酶切鉴定，经琼脂糖凝胶电泳，发现该片段约750BP，与预期值相符合（图4）。图4重组质粒PE
30、T28AEGFP的PCR和双酶切鉴定1DL2000MARKER2未酶切重组质粒PET28AEGFP133EGFP基因片段4NDE和ECOR双酶切重组质粒PET28AEGFPFIG4IDENTIFICATIONOFRECOMBINANTPLASMIDBYPCRANDRESTRICTIVEENZYMEDIGESTION1DL2000MARKER2PET28AEGFPPLASMID3FRAGMENTSOFEGFPGENE4PET28AEGFPPLASMIDDIGESTEDWITHNDEANDECOR24转EGFP基因的大肠杆菌原核表达条件的研究转EGFP基因大肠杆菌经IPTG诱导表达后，分别在0，1
31、，2，3，4，5H时离心取菌液沉淀，经长波紫外线照射后，肉眼可见明亮的绿色荧光。结果表明（图5），随着诱导时间的增加，菌体发出的荧光量度也逐渐增加，说明IPTG诱导EGFP的表达量是随着时间的延长而增加。图5经IPTG诱导后EGFP基因在大肠杆菌BL21中表达FIG5EXPRESSIONOFEGFPPROTEININESCHERICHIACOLICELLSINTHEINDUCTIONOFIPTG143讨论绿色荧光蛋白的表达不受宿主范围的限制，也没有细胞种类和部位的限制，因此我们采用技术较为成熟的大肠杆菌作为EGFP的宿主细胞。大肠杆菌是最为常见的表达蛋白的实验系统，它有繁殖速度快，操作简单，容
32、易培养等优点，大肠杆菌系统表达外源基因产物的水平远高于其它的基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白的50。因此，它非常适合作为表达EGFP的宿主。将EGFP编码序列克隆至原核表达载体PET28A上，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导不同时间后，经紫外照射，菌体呈明亮的绿色荧光，且不同的诱导时间下菌体发出的荧光强度有所区别，说明本实验成功构建了重组质粒PET28AEGFP，并且EGFP在大肠杆菌中得到高效的表达。实验中发现，对PMD19EGFP和PET28A质粒分别进行双酶切时，酶切体系中各成分的含量也会影响酶切的效率。同时，在大小片段的连接过程中我们也发现，体系中各成分含量的不同也
33、有一定的影响。本实验中酶切和连接体系中各成分的含量只能作为参考，并不是最佳的浓度。另外，从大肠杆菌BL21中提取质粒时发现，增加菌液用量对提取结果影响几乎没有影响，提取的质粒用于双酶切之后条带较暗，亮度较低，这可能是由于大肠杆菌BL21是表达宿主，不适合用于保存以及提取质粒。氯霉素乙酰转移酶（CAT）、半乳糖苷酶基因（LACZ）、荧光素酶基因是目前最为常用的报告基因，但实验室最为常用的是半乳糖苷酶基因，它检测的时候需要加入一些外源底物，当其与外源基因融合后一般需要多次纯化蛋白的步骤才能检测外源基因的表达20。同以往常用的报告基因相比，GFP优势非常明显，它的检测不需要任何外源性底物和辅助因子，
34、无毒、稳定、无污染，而且可以在紫外或蓝光激发下直接观察21,22。新的研究表明，它是一个良好的细胞间信号传递的动态荧光标记分子，既具有敏感的标记检测率，又没有放射性的危害，可以跟踪观测第二信使；作为报告基因，它是能在活细胞中表达的发光蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的23,24。在检测时经紫外照射，肉眼便可见菌体沉淀发出绿色荧光，能够直观，及时地反映蛋白的表达。经IPTG诱导之后，表达EGFP的大肠杆菌生长情况良好，说明EGFP对宿主细胞没有毒性，诱导之后的大肠杆菌能长时间表达绿色荧光，说明EGFP的荧光性质稳定，不容易猝灭。在构建原核表达载体的研究中，陆惠萍等利用GFP基因GFPS
35、65T构建载体，通过SDSPAGE电泳检测其在大肠杆菌中的表达25，段斯亮等利用EGFP构建原核表达载体，也是先通过SDSPAGE电泳检测蛋白的分子量再通过紫外照射检测EGFP在大肠杆菌中的表达26。本实验省去了SDSPAGE电泳检测EGFP蛋白的分子量，大大地提高了蛋白检测的效率。利用EGFP作为筛选标记可用于载体的构建及鉴定27。EGFP的相对分子质量较小，其活性形式为单体，是一种十分理想的报告蛋白与标记物，且EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子28,29。因此，EGFP在原核表达系统中可以作为一个很好的报告基因。虽然绿色荧光蛋白基因有着许多其他报告基因无法具有的优点，但在目前看
36、来仍有不足。由于它的荧光反应不是酶反应，当细胞本身还存在一些可以受蓝光激发和产生绿色荧光的物质，或者GFP表达频率不高的情况下，GFP必须在宿主细胞中大量地表达，才有可能使检测的结果不会产生较大的偏差，否则会使检测产生一些假相，不易对荧光进行定量的测量。本实验成功地构建了重组质粒PET28AEGFP，并使其在大肠杆菌细胞中得到了高效的表达，但对其作为报告基因还有哪些好处则需进一步的研究。154结论（1）通过PCR扩增EGFP目的片段，并将其与PMD19TVECTOR连接，转化大肠杆菌DH5，筛选阳性克隆，PCR和双酶切法验证，成功构建PMD19EGFP质粒。（2）将PMD19EGFP与PET2
37、8A质粒用NDEI、ECOR同时进行双酶切，回收大、小片段之后连接，转化大肠杆菌DH5，筛选阳性克隆并鉴定，扩大培养后抽提质粒，转化大肠杆菌BL21，筛选阳性克隆，通过PCR和双酶切法验证，成功构建PET28AEGFP质粒。（3）将转EGFP基因的大肠杆菌接种于LB液体培养基中，经IPTG诱导表达，在诱导的0H，1H，2H，3H，4H，5H收集诱导表达的菌体，并置于长波紫外线下照射，观察细胞中绿色荧光蛋白的表达量。经IPTG诱导后，细菌培养物在长波紫外线照射下发出明亮的绿色荧光。161唐孝青,李斌,伍小兵,等绿色荧光蛋白及其应用的研究进展J陕西农业科学,2007,11231242段青,王倩,祁
38、庆生绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用J生命的化学,2007,27148513余林辉,姚伟,段真珍,等绿色荧光蛋白及其在农作物研究中的应用J安徽农业科学,2008,36361578815790,158014汪恒英,周守标,常志州,等绿色荧光蛋白GFP研究进展J生物技术,2004,14370735吴瑞,张树珍绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学中的应用J分子植物育种,2005,322402446ALKAABIKM,YAFEAA,ASHRAFSSEFFECTOFPHONTHERMALANDCHEMICALINDUCEDDENATURATIONOFGFPJAPPLIEDBIOCHEMISTRYANDBIO
39、TECHNOLOGY,2005,12621491567MAREKH,SLAVOMR,VLADISLAVCGREENFLUORESCENTPROTEINASAVITALMARKERFORNONDESTRUCTIVEDETECTIONOFTRANSFORMATIONEVENTSINTRANSGENICPLANTSJPLANTCELLTISSUEANDORGANCULTURE,2006,8633033188刘艳丽,鲁澄宇绿色荧光蛋白的特性及其在药学研究中的应用J药物生物技术,2009,1621701749BAULCOMBEDC,CHAPMANS,CRUZSSJELLYFISHGREENFLUORES
40、CENTPROTEINASAREPORTERFORVIRUSINFECTIONSJTHEPLANTJOURNAL,1995,71045105310KHLERRH,CAOJ,ZIPFELWR,ETALEXCHANGEOFPROTEINMOLECULESTHROUGHCONNECTIONSBETWEENHIGHERPLANTPLASTIDSJSCIENCE,1997,2762039204211ARGUETAC,YUKSEKK,SUMMERSMCONSTRUCTIONANDUSEOFGFPREPORTERVECTORSFORANALYSISOFCELLTYPESPECIFICGENEEXPRESSI
41、ONINNOSTOCPUNCTIFORMEJJOURNALOFMICROBIOLOGICALMETHODS,2004,5918118812JAINS,TEOTIAS,GUPTAMNPURIFICATIONOFGREENFLUORESCENTPROTEINOVEREXPRESSEDBYAMUTANTRECOMBINANTESCHERICHIACOLIJPROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION,2004,36768113孙丽萍,胡巢凤,周羽竝人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建J现代免疫学,2008,28321922314姜伯乐,赵宇,刘建元,等含有增强型绿色荧
42、光蛋白报告子的载体系统的构建J广西农业生物科学,2008,27434334815何淑雅，马云，杨阳，等FXR1基因与增强型绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达J现代生物医学进展，2009，971265126716张鲲,马媛媛,邹少兰大肠杆菌双顺反子表达载体中绿色荧光蛋白表达水平的研究J生物技术通报,2009,5606317蒋芳玲,杨国顺,刘志敏,等绿色荧光蛋白研究进展J作物研究,2003,17210610918黄国存,朱生伟,董越梅,等绿色荧光蛋白及其在植物研究中的应用J植物学报,1998,155243019朱学良,单永立,李艳绿色荧光蛋白照亮生命科学的一盏明灯J生命科学,2008,2068508
43、5520PARKHK,ZENGCCONSTRUCTIONOFANXCMIGENERATEDTVECTORBEARINGGREENFLUORESCENTPROTEINMARKERFORDIRECTCLONINGOFPCRPRODUCTSJANALBIOCHEM,2007,360114421张敏,任慧霞报告基因的应用研究进展J食品与药品,2007,99454822杨慧敏,李文刚,吴高锋,等绿色荧光蛋白的研究进展J中国畜牧兽医生理生化,2008,358293223王晓丽,邵卫星,单虎绿色荧光蛋白研究进展J动物医学进展,2008,291565924SPAINKHP,SCHLAMANHRM,BRASCP
44、,ETALUSEOFGFPTOSTUDYFACTORSINVOLVEDINTHELOTUSJAPONICUSSYMBIOSISJCURRENTPLANTSCIENCEANDBIOTECHNOLOGYINAGRICULTURE,2006,3821922225陆惠萍,周凤娟,孙树汉绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆及高效表达J第二军医大学学报,1997,18540640826段斯亮,于声,苏晓庆增强型绿色荧光蛋白原核表达载体的构建及表达J广西医学,2008,3010147514771727唐金宝,陈永,梁淑娟,等利用增强型绿色荧光蛋白基因作筛选标记克隆载体的构建及鉴定J中国海洋药物杂志,2009,282283128ZHANGJZ,GUOXB,XIESY,ETALPRODUCTIONOFTRANSGENICMICECARRYINGGREENFLUORESCENCEPROTEINGENEBYALENTIVIRALVECTORMEDIATEDAPPROACHJPROGNATSCI,2006,16882783329薛丽香,童坦君,张宗玉报告基因的选择及其研究趋向J生理科学进展,2002,334364366
