1、本科毕业设计（20_届）鲈鱼GK（GLUCOKINASE）基因CDNA克隆所在学院专业班级海洋生物资源与环境学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录1引言111鱼类对葡萄糖的利用情况112葡萄糖激酶（GLUCOKINASE，GK）113影响鱼类碳水化合物吸收利用的其他因素114研究现状及实验目的22鲈鱼GK基因CDNA克隆221实验材料和仪器2211实验材料2212实验中所用试剂盒2213其他主要试剂2214主要仪器322实验方法3221RNA的提取3222肝脏常规CDNA的合成3223鲈鱼GK核心片段的获取42231兼并引物的设计42232鲈鱼GK核心片段的PCR扩增4224PCR产物的纯
2、化4225重组质粒的构建和检测42251PCR纯化产物与PMD18T载体的连接42252感受态细胞的制备52253重组质粒的转化52254重组质粒的抽提52255重组质粒的PCR检测623实验结果和分析6231鲈鱼GK基因的序列分析6232RTPCR琼脂糖凝胶电泳6233GK核心序列及同源性检测72331氨基酸序列分析102332同源性比较和系统发育分析103小结1131实验目的1132实验结果分析1233展望12致谢12参考文献122摘要在哺乳动物中，高KM值的己糖激酶，即葡萄糖激酶主要是在肝脏和胰腺B细胞中表达的。它的功能是提高生物细胞对过剩的碳水化合物中的葡萄糖的利用效率。当食物中的碳水
3、化合物含量升高时，GK基因受到诱导，大量表达，细胞内的葡萄糖激酶含量迅速升高，调节体内血浆平衡。一些研究发现鱼类肝脏也有类似于人体葡萄糖激酶的酶，它也会受饵料中的高含量葡萄糖诱导，以维持血液平衡。而在胰腺中，此酶的表达受到胰岛素的调控。本实验通过RTPCR的方法克隆了鲈鱼（LATEOLABRAXJAPONICUS）的部分GK基因。这段序列长511BP，通过分析发现它和金头鲷（SPARUSAURATA），和虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）的GK基因有很高的同源性，其中和金头鲷（SPARUSAURATA）GK基因相似度为94，而和虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）GK基因的相
4、似度为86。通过RTPCR发现，GK基因MRNA主要在肝脏中表达和胰腺中表达，而且在肝脏中的表达量要高于在胰腺中的表达量关键词鲈鱼；GK；葡萄糖激酶ABSTRACTINMAMMALS,THEHIGHKMHEXOKINASE,ALSOCALLEDGLUCOKINASE,ISEXPRESSEDINLIVERANDPANCREATICBCELLSITSFUNCTIONINTHELIVERISTOINCREASETHEINTRACELLULARUTILIZATIONOFGLUCOSEINACARBOHYDRATESURPLUSSITUATIONTHISENZYMEISADAPTIVE,ITSINTRA
5、CELLULARCONCENTRATIONINCREASESWITHINCREASINGCONTENTOFCARBOHYDRATEINTHEDIETSOMESTUDIESFOUNDTHATAGLUCOKINASELIKEENZYMEISPRESENT,ANDADAPTIVE,ALSOINLIVEROFFISNINPANCREATICBCELLS,GLUCOKINASEISINVOLVEDINTHESTIMULATORYACTIONOFHIGHBLOODGLUCOSEONTHESECRETIONOFINSULINAPARTIALCDNAOFGKINLATEOLABRAXJAPONICUSWASA
6、MPLIFIEDBYRTPCRMETHODTHECDNAWAS511BPINSIZETHESEQUENCEANALYSISINDICATEDTHATITSHAREDHIGHIDENTITYWITHSPARUSAURATAANDONCORHYNCHUSMYKISSWHICHIS94WITHSPARUSAURATAAND86WITHONCORHYNCHUSMYKISSTHERTPCRANALYSISREVEALEDTHATGKMRNAWASMAINLYEXPRESSEDINLIVER,ANDPANCREASFURTHERMORE,THEEXPRESSIONLEVELOFGKWASHIGHERINL
7、IVERTHANINPANCREASKEYWORDSLATEOLABRAXJAPONICUSGKGLUCOKINASE11引言11鱼类对葡萄糖的利用情况葡萄糖是鱼类的脑、鳃组织和红细胞等必需的代谢供能底物之一，与鱼体维持正常的生理功能和存活能力密切相关1。但鱼类主要的能量来源是蛋白质和脂肪，鱼类对葡萄糖的利用能力较差，适宜的饲料葡萄糖水平一般低于202，饲料中葡萄糖含量过高会抑制鱼体生长，导致免疫功能降低3，血糖水平持续偏高4。因此，鱼类曾被认为是天生的糖尿病患者。为阐明鱼类对碳水化合物利用率低的原因，众多的研究者从鱼类的食性、消化率、内分泌系统、饲料碳水化合物种类、含量、加工工艺和糖代谢酶系
8、等角度进行了大量研究。鱼体对葡萄糖的代谢方式包括转化储存和氧化分解两种。饲料中的葡萄糖经消化吸收后主要以血糖的形式转运到鱼体各组织器官，在天然状态下，直接通过尿或鳃排出体外的血糖仅占极少部分（通常低于15）。肝脏是鱼类葡萄糖代谢的主要场所。葡萄糖由葡萄糖转运子转运进入肝细胞，在糖代谢酶系的调控下进行糖原合成和分解、糖酵解和异生及磷酸戊糖途径等代谢。葡萄糖在己糖激酶的催化下转化为葡萄糖6磷酸（G6P）。G6P可经磷酸戊糖途径为脂肪酸的合成提供NADPH，或用于糖原合成，也可进一步无氧酵解成为丙酮酸，之后可经乙酰辅酶A进入三羧酸循环完全氧化供能，但鱼类以糖为底物氧化供能占总代谢耗能的比例较小6。鱼
9、体各种组织对葡萄糖的利用能力差异很大，研究发现，代谢活性高的组织对糖的利用能力较强。鱼类的心脏具有较强的葡萄糖转运和储存能力，而脑组织以葡萄糖为主要代谢能源，对糖的利用能力也很强。研究表明，尼罗罗非鱼（OREOCHROMISNILOTICA）的脑、心的葡萄糖转运子I（GLUT1）和糖原水平甚至比一些哺乳动物高10倍以上7。鱼类对葡萄糖的消化和代谢能力较差，缺乏调控血糖水平的能力。众多的研究资料表明，影响鱼类利用饲料葡萄糖的因素很多，包括鱼的生长发育、食性、消化及代谢酶、胰岛素水平、能量代谢水平等内因以及碳水化合物的含量、种类、环境温度等外因、摄食频率8。葡萄糖激酶（GLUCOKINASEGK）
10、是糖酵解过程中重要的限速酶，当哺乳动物血糖增高时，GK活性诱导性增强，从而增强糖酵解。早期的研究者认为，鱼体内可能缺乏GK，因而不能正常分解利用葡萄糖，导致鱼类摄食糖后血糖持续偏高，但近年的研究在鱼类（包括肉食性鱼类）的肝脏中发现了GK，饲料中的葡萄糖能够诱导鱼类肝脏GK的活性升高，表明鱼类利用葡萄糖差的原因不是缺乏GK。鲤CYPRINUSCARPIO利用碳水化合物要好于金鲷SPARUSAURATA和虹鳟ONCORHYNCHUSMYKISS，且其GK活性受碳水化合物的诱导比金鲷和虹鳟更快9。12葡萄糖激酶（GLUCOKINASE，GK）葡萄糖激酶GLUCOKINASE,GK是己糖激酶家族成员,
11、在糖代谢中起着重要的作用。己糖激酶HEXOKINASE，HK是糖代谢的关键酶，催化葡萄糖磷酸化生成6磷酸葡萄糖GLUCOSE6PHOPHATE，G6P10。哺乳动物己糖激酶有4种同工酶，其中型，其KM值为20130MOL/L，他们主要存在于肝外组织，受到6磷酸葡萄糖反馈抑制。型主要存在于肝脏和胰岛细胞，又被称之为葡萄糖激酶GLUCOKINASE，GK，其KM值为58MMOL/L，6磷酸葡萄糖对此酶无抑制作用，当血糖浓度升高时启动此酶，于是多余的葡萄糖最终被转化为糖原或脂肪贮存，胰岛素在转录水平上调控GK基因的表达，在鱼类，特别是肉食性鱼类，由于它们对饵料中消化葡萄糖用于能量供应的能力非常有限，
12、这些鱼类摄食富含葡萄糖的饵料后会出现高血糖症，饵料葡萄糖含量过高还有可能诱发养殖鱼类脂肪肝病,因此,人们开始关注鱼类GK基因,并已经进行了一些研究，克隆了虹鳟ONCORHYNCHUSMYKISS、金鲷SPARUSAURATA、翘嘴红鮊ERYTHROCULTERILISHAEFORMIS等鱼类的GK基因全长CDNA序列11，为进一步研究鱼类糖代谢途径奠定了基础。13影响鱼类碳水化合物吸收利用的其他因素在哺乳动物中,在进食之后血糖升高,血液中高含量的葡萄糖会诱导肝脏中的GK基因表达,以迅速的将葡萄糖转化为葡萄糖6磷酸,进而进行糖原的合成或经磷酸戊糖途径为脂肪酸的合成提供NADPH12，也可进一步无
13、氧酵解成为丙酮酸13。高的血糖含量还会抑制葡萄糖6磷酸激酶基因的表达，从而阻断糖异生的途径，防止其它大分子转变为葡萄糖。但是，在鱼类中，血液中的葡萄糖含量升高对葡萄糖6磷酸酶的影响似乎并不明显14。2影响鱼类糖代谢的激素包括高血糖素、胰岛素、高血糖样肽、甲状腺激素、生长素、胰岛素样生长因子、生长激素抑制素、儿茶酚胺和皮质醇等15。在哺乳动物的糖代谢中，胰岛素促进糖原合成及脂肪合成、糖酵解，并且抑制糖异生，从而降低血糖水平。早期的假说推测，鱼类（特别是肉食性鱼类）胰岛素水平低、缺乏调节作用，类似哺乳动物的胰岛素依赖型糖尿病症状（INSULINDEPENDENTDIABETES，IDDM16），胰
14、岛素受体数量少、亲和力弱，但近年来的研究发现，鱼类的胰岛素水平接近甚至高于哺乳类,有胰岛素受体，摄入葡萄糖后胰岛素水平及其受体数量能适应性上调17，这些研究结果均不支持关于鱼类缺乏胰岛素和胰岛素受体的假说。不过鱼类的胰岛素对血糖的反应通常比哺乳动物慢，这可能导致胰岛素调节能力在摄食葡萄糖后一段时间内相对不足18。还有的研究表明，葡萄糖对胰腺分泌胰岛素的诱导能力远远低于脂肪酸和氨基酸，推测鱼类胰岛素的主要作用是调控蛋白质代谢而不是糖代谢19。因此，胰岛素在鱼体的糖代谢调控中所起的作用有待进一步探讨。14研究现状及实验目的对于鱼类对碳水化合物的吸收和利用途径目前已经初步清楚，但是一些细节的地方还是
15、比较模糊，例如之前提到的血糖升高对葡萄糖6磷酸激酶的影响尚不清楚20。而且，前人的研究致力于分析鱼类整体的情况，具体到特别的某种鱼时，虽有指导意义，但也要具体情况具体分析。本实验的目的在于对鲈鱼GK基因CDNA的克隆21，为以后对鲈鱼体内碳水化合物代谢途径更深入的研究打下基础，以期能使鲈鱼养殖在一定程度上有所突破。2鲈鱼GK基因CDNA克隆21实验材料和仪器211实验材料（1）实验鲈鱼购买于宁波水产品大世界，经麻醉后迅速取出肝组织，放入液氮冷冻后备用。（2）本实验室保存的大肠杆菌ESCHENICHIACOLIDH5。212实验中所用试剂盒（1）PRIMESCRIPTTM1STSTRANDCDN
16、ASYNTHESISKITTAKARA公司。（2）DNA凝胶回收试剂盒（碧云天生物有限公司）。（3）PMD18T试剂盒（TAKARA公司）。（4）质粒抽提试剂盒（碧云天生物有限公司）。213其他主要试剂（1）TRIZOLREAGENTINVITROGEN公司（2）氯仿（常熟市杨园化工厂）。（3）异丙醇（上海试剂四厂）。（4）DEPC处理灭菌水（上海生工）。（5）琼脂糖（上海生工）。（6）甘油（上海生工）。（7）氨苄青霉素（上海生工）。（8）LB培养基在950ML蒸馏水中加入酵母提取物（OXOID公司）5G，胰蛋白胨（OXOID公司）10G，NACL5G。调整PH值至70后定容至1000ML。如
17、需要固体培养基则每1000ML液体培养基中加入琼脂15G，高压灭菌后备用。（9）01MOL/LCACL2称取分子量为147G的CACL22H2O（上海生工生物工程技术服务有限公司）147G加蒸馏水定容至100ML，高压灭菌后4保存备用。（10）75乙醇取75ML的无水乙醇（杭州长征化工厂）加以DEPC处理灭菌水定容到100ML，置4保存备用。（11）TAKARATAQ（5U/L）、10PCRBUFFER100MMTRISCL，PH83；500MMKCL；15MMMGCL2、DNTPMIXTURE各25MM（TAKARA公司）。3（12）MS222（SIGMA公司）。214主要仪器（1）YDS3
18、液氮罐（四川亚西橡塑机器有限公司）。（2）ND1000型微量紫外分光光度计（THERMO公司）。（3）PCR仪（BIORAD公司）。（4）WD9403D型紫外分析仪（北京六一仪器厂）。（5）SORVALLFRESCO台式高速冷冻离心机（SORVAL公司）。（6）REVCD13863V型超低温冰箱（REVCD公司）。（7）HVE50型高压灭菌锅（HIRAYAMA公司）。（8）DK8D电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）。（9）BIOFUGESTRATAS大型冷冻离心机（HERAEUS公司）。（10）电泳仪（北京六一仪器厂）。22实验方法221RNA的提取大黄鱼各组织RNA的提取方法参照TRI
19、ZOLREAGENT试剂说明书，实验步骤如下（1）取液氮冻存的鲈鱼肝脏50MG左右。（2）在盛有液氮的陶瓷研钵中将组织迅速研磨成粉状。（3）加入1MLTRIZOL，待溶解后转移到15MLDEPC水处理（01DEPC水浸泡过夜后高压灭菌）的离心管中。（4）手摇混匀15S，室温放置5MIN。（5）加入氯仿02ML，手摇混匀15S。（6）室温放置2MIN。（7）4OC，12000G离心15MIN。（8）取上清（约06ML），转移到15MLDEPC水处理的离心管中。（9）加异丙醇05ML，混匀，室温放置10MIN。（10）4OC，10000G离心10MIN。（11）弃上清，加1ML75乙醇洗涤。（12
20、）4OC，7500G离心5MIN。（13）弃上清，室温干燥510MIN。（14）DEPC处理灭菌水20L溶解，70OC保存。222肝脏常规CDNA的合成（1）经微量紫外分光光度计测定RNA样品浓度。（2）在DEPC水处理的离心管中配制10L下列混合液RNA1GOLIGODTPRIMER50M1LDNTPMIXTURE各10MMOL/ML1LRNASEFREEDH2O补足到10L（3）上述混合液混匀后置PCR仪上655MIN，至于冰上。（4）在DEPC水处理的离心管中配制下列反转录混合液上述经变性、退火的反应液10L5PRIMESCRIPTTMBUFFER4LRNASEINHIBITOR40U/
21、L05LPRIMESCRIPTTMRTASE200U/L1LRNASEFREEDH2O45L（5）混匀，PCR仪上进行如下反应；4260MIN；7015MIN；4。4223鲈鱼GK核心片段的获取2231兼并引物的设计从NCBI基因库中读取欧鲽（PLEURONECTESPLATESSA）、虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）、金鲷（SPARUSAURATA）、鲤（CYPRINUSCARPIO）、及大西洋鲑（SALMOSALAR）GK的全长CDNA序列，通过软件CLUSTALX进行多重比对，在软件PRIMER50辅助下设计了一对用于扩增鲈鱼GK核心片段的上游引物GKF和下游引物GKR（表2
22、1）。表1鲈鱼GKPCR扩增核心片段的引物序列TAB1SEQUENCESOFPRIMERSUSEDINAMPLIFYINGGKPARTIALCDNASEQUENCESOFLATEOLABRAXJAPONICUS引物名称引物序列53（RAG，YCT）GKFTSGGHTTYACCTTCTCYTTYCGKRAACAGCARVTYYTCRTTCAC2232鲈鱼GK核心片段的PCR扩增（1）配置下列PCR反应液（50L）10PCRBUFFER5LDNTPMIXTURE4LTAKARATAQ05L上游引物GKF10MM1L下游引物GKR10MM1LCDNA模板1LPCRGRADEWATER375L（2）将
23、上述混合液混匀，离心后置于PCR仪上，进行PCR反应。鲈鱼GK核心片段PCR扩增条件如下预变性943MIN；9430S，565330S，721MIN，每个循环退火温度下降1，最终以退火温度为53进行32个循环；最后72延伸5MIN。224PCR产物的纯化（1）PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，在WD9403D型紫外分析仪上将目的片段切胶回收，称重，将胶切碎或在离心管内用1ML枪头搅碎。（2）加入等体积的溶液1，VORTER或颠倒混匀。（3）5060OC水浴加热约10分钟至胶全融，VORTER或颠倒混匀34次，以加速凝胶融解。（4）加入到DNA纯化柱内，室温放置1MIN。（5）最高速（16000G，约
24、1200014000RPM左右）离心1MIN，倒弃收集管内的液体。（6）在DNA纯化柱内加入700微升溶液2，室温放置1MIN。（7）最高速离心1MIN，洗去杂质。倒弃收集管内的液体。（8）再加入500微升溶液2，最高速离心1MIN，进一步洗去杂质。倒弃收集管内的液体。（9）最高速离心1MIN，除去残留液体并让残留的乙醇充分挥发。（10）将DNA纯化柱于15毫升离心管上，加入30微升溶液3至管内柱面上，放置1MIN。（11）最高速离心1MIN，所得液体即为高纯度DNA。225重组质粒的构建和检测2251PCR纯化产物与PMD18T载体的连接（1）经回收纯化的PCR产物与PMD18T质粒进行连接
25、，反应体系（10L）如下PCR纯化产物47LPMD18T载体03LSOLUTIONI250L5（2）将上述混合物轻轻混匀，置4连接过夜。2252感受态细胞的制备（1）从LB平板上挑取新活化的ESCHENICHIACOLIDH5单菌落，接种于35MLLB液体培养基中，37下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1100150的比例接种于100MLLB液体培养基中，37振荡培养23小时至OD60005左右。（2）将培养液转入50ML离心管中，冰上放置10MIN，然后于4下4000RPM离心10MIN。（3）弃去上清，用预冷的01MOL/L的CACL2溶液10ML轻轻悬浮细胞，冰上放置
26、1530MIN后，4下4000RPM离心10MIN。（4）重复步骤（3）。（5）弃去上清，加入2ML预冷的01MOL/L的CACL2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，加入甘油至终浓度15即成感受态细胞悬液。（6）感受态细胞悬液分装成100L的小份，贮存于70备用。在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的MOB基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。目前常用的感受态细胞制备方法有CACL2和RBCLKCL法，RBCLKCL法制备
27、的感受态细胞转化效率较高，但CACL2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于70保存半年，因此CACL2法为使用更广泛。实验中应该注意（1）细胞生长状态和密度不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好。（2）试剂的质量所用的试剂，如CACL2等均需是最高纯度的GR或AR，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。（3）防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，枪头等要高压灭菌处理，所有的试剂
28、都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。2253重组质粒的转化（1）取5L连接产物加入100L感受态细胞悬液中，轻轻混匀，冰浴20MIN。（2）42水浴90S，快速转移至冰上，冰浴25MIN。（3加800L37预热的LB液体培养基。37200RPM振荡培养45MIN。（4）100L菌液铺于加有氨卞青霉素的LB固体培养基平板上，37培养过夜。2254重组质粒的抽提（1）取过夜菌15毫升，6000G离心1MIN收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3毫升过夜菌液沉淀。（2）每管加入250微升溶液1，重
29、悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。（3）每管加入250微升溶液2，轻轻颠倒离心管46次，使细菌完全裂解，溶液透明。（4）每管加入350微升溶液3，随即颠倒离心管46次混匀，可见白色絮状物产生。（5）最高速（13000RPM左右）室温离心10分钟。（6）将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心3060S，倒弃收集管内液体。（7）在质粒纯化柱内加入750微升溶液，最高速离心3060S，洗去杂质，倒弃收集管内液体。（8）最高速再离心1MIN，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。6（9）将质粒纯化柱置于15毫升离心管上，加入50微升溶液5至管内柱面上，放置1MIN。（10）
30、最高速离心1MIN，所得液体即为高纯度质粒。2255重组质粒的PCR检测以PMD18T载体通用引物M13F和M13R作为上、下游引物，进行PCR检测，引物序列见表22，PCR反应体系（25L）如下10PCRBUFFER25LDNTPMIXTURE2LTAKARATAQ05L上游引物M13F10MM05L下游引物M13R10MM05L质粒DNA03LPCRGRADEWATER187LPCR反应条件如下预变性943MIN；9430S，5130S，721MIN，30个循环；最后72延伸4MIN。表2PMD18T载体的通用引物TAB2SEQUENCESOFUNIVERSALPRIMERSOFTHEPM
31、D18TVECTOR引物名称引物序列53M13FGGTAACGCCAGGGTTTTCCM13RCAGGAAACAGCTATGACC23实验结果和分析231鲈鱼GK基因的序列分析通过TRIZOL法提取了鲈鱼肝脏组织总RNA，经1琼脂糖凝胶电泳后结果见图21，图中5S、18S和28S三条条带清晰可见，说明RNA样品具有良好完整性。以该RNA为模板，按照PRIMESCRIPT1STSTRANDCDNASYNTHESISKIT试剂盒说明书合成大黄鱼肝脏常规CDNA。图1鲈鱼肝脏总RNA琼脂糖凝胶电泳结果FIG1ELECTROPHORESISPATTERNOFTOTALRNAOFLATEOLABRAXJ
32、APONICUSLIVER利用兼并引物GKF和GKR从鲈鱼肝脏常规CDNA中扩增得到长度为511BP的片段（图22），与预期大小相符，PCR产物经切胶回收、连接转化、挑克隆检测，送上海INVITROGEN生物有限公司测序。测序结果经BLAST同源性检索，确认为鲈鱼GK的核心序列。232RTPCR琼脂糖凝胶电泳RTPCR琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。从图中可以看出，RTPCR得到的产物约500KB长度左右，这和引物设计时预计可以得到的片段长度相符，PCR产物经切胶回收、连接转化、挑克隆检测，送上海INVITROGEN生测序后得到的核心序列如下7图2鲈鱼GK基因核心序列克隆结果FIG2PCRAMP
33、LIFYINGGKPARTIALCDNASEQUENCESOFLATEOLABRAXJAPONICUS233GK核心序列及同源性检测1TCGGCTTCACCTTCTCTTTCCCTGTACGACATGAGGACATTGACAGGGGTATCCTGCTTAACTGGACCAAAGGCTTCAAG8081GCTTCTGGGGCAGAAGGGAACAATGTTGTGGGTTTACTCAGAGATGCTATCAAGAGACGAGGGGACTTTGAGATGGATGT160161GGTTGCAATGGTGAATGACACGGTAGCCACCATGATTTCCTGCTATTATGAGGATCGCAGCTG
34、TGAAGTTGGGATGATTG240241TTGGAACTGGGTGTAATGCCTGTTACATGGAGGAGATGAGGACTGTGGAGCTGGTAGAAGGGGAGGAGGGCCGGATGTGT320321GTGAACACAGAGTGGGGGGCATTCGGAGACAACGGGGAGCTGGACGAGTTCAGACTGGAGTACGACAGAGTGGTGGACGA400401GACCTCGATTAACCCCGGACAGCAGCTTTATGAGAAGCTGATCAGTGGGAAGTACATGGGTGAGCTGGTCAGGCTTCTTC480481TGATGAAGCTGGTGAATGA
35、GGAGCTGCTGTT511得到的核心片段共长511BP，经BLAST同源性检索，确认是鲈鱼GK基因，BLAST结果如下8图3鲈鱼与金鲷GK基因比对结果FIG3GKCOMPARINGBETWEENLATEOLABRAXJAPONICUSANDSPARUSAURATA9图4鲈鱼与虹鳟GK基因比对结果FIG4GKCOMPARINGBETWEENLATEOLABRAXJAPONICUSANDONCORHYNCHUSMYKISS可以看出PCR产物与金头鲷和虹鳟鱼的GK的部分片段相似度非常高（分别为94和86），由此说明PCR的产物是鲈鱼GK基因中的保守核心片段，确为本实验所要的结果。10表3BLAS
36、T同源性检索结果TAB3THEHOMOLOGYANALYSEOFGKNUCLEOTIDESEQUENCESOFLATEOLABRAXJAPONICUS基因编号基因来源基因长度和鲈鱼GK基因相似度AF053330SPARUSAURATA207094EZ7703141ONCORHYNCHUSMYKISS2355862331氨基酸序列分析由于得到的序列只是一部分，无法直接用软件得到其编码的氨基酸序列，但根据三个碱基编码一个氨基酸残基的规则，依次去掉核苷酸序列的前两个碱基后，发现剩下的序列可以编码出一个有169个氨基酸残基组成的多肽序列。结果见图5。图5鲈鱼GK基因PCR产物推测氨基酸残基序列FIG5
37、THEPARTIALCDNAOFLATEOLABRAXJAPONICUSGKANDTHEDEDUCEDAMINOACIDSEQUENCES2332同源性比较和系统发育分析将鲈鱼GK基因的氨基酸序列与金头鲷（SPARUSAURATA）等十八个物种的GK进行氨基酸序列比对后发现，GK基因在不同的物种中同源性非常高，基本都在90左右，而和鲈鱼同属鲈形目的虹鳟和金头鲷同鲈鱼GK基因的相似度最高，达到了96。使用软件MEGA40根据临位相联法（NEIGHBORJOINING，NJ）构建GK氨基酸序列的系统进化树（图7）。11图7鲈鱼与其他物种GK基因氨基酸序列进化树FIG7PHYLOGENETICTRE
38、EOFGKAMINOACIDSEQUENCESOFLATEOLABRAXJAPONICUSANDOTHERSPECIES结果表明鱼类和哺乳类GK分别成簇，进而进一步分支。从图中可以看出鱼类分出两支，斑马鱼和建鲤同属一支，虹鳟，金头鲷，鲈鱼同属一支，其中鲈形目的鲈鱼和金头鲷又与虹鳟分别各为一支。可见鲈鱼与金头鲷同源性高。表4鲈鱼GK氨基酸序列同源性分析TAB4THEHOMOLOGYANALYSEOFGKAMINOACIDSEQUENCESOFLATEOLABRAXJAPONICUS物种（拉丁名）氨基酸序列登录号同源性金头鲷（SPARUSAURATA）AF169368_196建鲤（CYPRINUS
39、CARPIO）ACD37722192虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）NP_001117721196斑马鱼（DANIORERIO）NP_001038850292大鼠（RATTUSNORVEGICUS）NP_036697190人（HOMOSAPIENS）BAH0228288牛（BOSTAURUS）NP_00109577291野猪（SUSSCROFA）XP_003134932191小鼠（MUSMUSCULUS）NP_034422290爪蟾（XENOPUSLAEVIS）NP_0010792981903小结31实验目的GK酶是糖代谢途径中的限速酶，在哺乳动物中，此酶对于糖代谢调控，维持血糖的
40、平衡起着关键的作用。在饮食之后，动物体内由于吸收了由消化而来的葡萄糖，导致血糖升高，从而会诱导肝脏中GK基因表达，大量的GK酶在肝脏中催化血液中的葡萄糖转化为葡萄糖6磷酸，进而进入糖酵解或是合成肝糖原，从而达到降低血糖的目的。但是在鱼类中，研究发现鱼类对碳水化合物利用能力较差，饵料中碳水化合物含量过高会抑制鱼类生长，血糖水平持续偏高，免疫功能降低。之前有人认为鱼类是缺乏GK基因或是GK基因表达量不高而导致鱼类对糖利用率很低。但是随后的研究发现，在给鱼类饵料中加入葡萄糖后，会明显刺激鱼类GK基因的表达，肝脏中的GK酶含量也会有明显的升高，这有力的反驳了之前的推测。12但是鱼类对饵料中的碳水化合物
41、利用率低的问题依旧没有解决。对于这个问题，很多人已经开始了研究，并且已经得到克隆了虹鳟ONCORHYNCHUSMYKISS、金鲷SPARUSAURATA、翘嘴红鮊ERYTHROCULTERILISHAEFORMIS等鱼类的GK基因全长CDNA序列，但是鲈鱼却是未曾涉足。本文通过RTPCR的技术手段，希望获得鲈鱼GK基因CDNA的核心片段，为获得鲈鱼GK基因全长，进而对鲈鱼GK基因进行进一步分析做好铺垫。32实验结果分析通过RTPCR我们得到了鲈鱼GK基因的部分序列，共511KB，通过BLAST同源性分析发现，这个片段同金鲷SPARUSAURATA，虹鳟ONCORHYNCHUSMYKISSGK基
42、因的同源性很高，从而确定此片段是所要的结果。通过氨基酸分析可以看出GK基因相当保守，同源性很高，这为我们进一步研究此基因做好了铺垫。通过系统发育分析，我们可以清楚的看到，鲈鱼和金头鲷同源性高，同属于鲈鱼目，而和斑马鱼、建鲤同源性高。33展望对鲈鱼GK基因的研究目的在于研究鱼类体内糖代谢途径和其调控机制，从而指导生产，提高鲈鱼养殖产量，降低成本。鱼类对日粮中的葡萄糖利用率低使得鱼类的饵料受到了极大的限制，日粮中的葡萄糖含量过高，会抑制鱼类生长，血糖水平持续偏高，免疫功能降低。如此一来，严重影响养殖鲈鱼的产量。参考文献1NAKANOK,TAGAWAM,TAKEMURAA,ETALTEMPORALC
43、HANGESINLIVERCARBOHYDRATEMETABOLISMASSOCIATEDWITHSEAWATERTRANSFERINOREOCHROMISMOSSAMBICUSJCOMPBIOCHEMPHYSIOL,1998,1197217282TUNGPH,SHIAUSYEFFECTSOFMEALFREQUENCYONGROWTHPERFORMANCEOFHYBRIDTILAPIAOREOCHROMISNILOTICUSOAUREUS,FEDDIFFERENTCARBOHYDRATEDIETSJAQUACULTURE,1991,923433503HEMREGI,MOMMSENTP,KROG
44、DAHLACARBOHYDRATESINFISHNUTRITIONEFFECTSONGROWTH,GLUCOSEMETABOLISMANDHEPATICENZYMESJAQUACULTNUTR,2002,81751944MOONTWGLUCOSEINTOLERANCEINTELEOSTFISHFACTORFICTIONJCOMPBIOCHEMPHYSIOLB,2001,1292432495DENGDF,REFSTIES,HUNGSSOGLYCEMICANDGLYCOSURICRESPONSESINWHITESTURGEONACIPENSERTRANSMONTANUSAFTERORALADMIN
45、ISTRATIONOFSIMPLEANDCOMPLEXCARBOHYDRATESJAQUACULTURE,2001,1991071176MAULEAG,TRIPPRA,KAATTTARISL,ETALSTRESSALTERSIMMUNEFUNCTIONANDDISEASERESISTANCEINCHINOOKSALMONONCORHTNCHUSTSHAWYTSCHAJJENDOCRINOL,1989,1201351427罗毅平,谢小军鱼类利用碳水化合物的研究进展J中国水产科学,2010,23813908LEGATENJ,BONENA,MOONTWGLUCOSETOLERANCEANDPERIP
46、HERALGLUCOSEUTILIZATIONINRAINBOWTROUTONCORHYNCHUSMYKISS,AMERICANEELANGUILLAROSTRATA,ANDBLACKBULLHEADCATFISHAMEIURUSMELASJGENCOMPENDOCR,2001,12248599TRANULISMA,CHRISTOPHERNB,BORREBAEKBGLUCOKINASEINATLANTICHALIBUTHIPPOGLOSSUSHIPPOGLOSSUSBROCKMANNBODIESCOMPBIOCHEMIPHYSIOLBJ1997,116336737010PANSERATS,CA
47、PILLAE,GUTIERREZJ,ETALGLUCOKINASEISHIGHLYINDUCEDANDGLUCOSE6PHOSPHATASEPOORLYREPRESSEDINLIVEROFRAINBOWTROUTONCORHYNCHUSMYKISSBYASINGLEMEALWITHGLUCOSEJCOMPBIOCHEMPHYSIOLB,2001,128227528311戈贤平,俞菊华,吴婷婷翘嘴红鮊GK基因的克隆和序列分析J水产学报,2006,30341041512CHRISTIANSENDC,KLUNGSYRLMETABOLICUTILISATIONOFNUTRIENTSANDTHEEFFE
48、CTSOFINSULININFISHAREVIEWJCOMPBIOCHEMPHYSIOLB,1987,8870171113刘波,唐永凯,俞菊华等饲料脂肪对翘嘴红鲌生长、葡萄糖激酶和葡萄糖6磷酸酶活性与基因表达的影响J中国水产科学,2008,61024103314SPANSEAT,ECAPILA,JGUTIERREZ,ETALGLUCOKINASEISHIGHLYINDUCEDANDGLUCOSE6PHOSPHATASEPOORLYREPRESSEDINLIVEROFRAINBOWTROUTONCORHYNCHUSMYKISSBYASINGLEMEALWITHGLUCOSEJCOMBIOCHEM
49、ANDPHYSIOLOGYPARTB,2001,12827528315WILSONRP,POEWEAPPARENTINABILITYOFCHANNELCATFISHTOUTILIZEDIETARYMONEANDDISACCHARIDESASENERGYSOURCESJJNUTR,1987,11728028516HILTONJW,PLISETSKAYAEM,LEATHERLANDJFDOESORAL1,5,3TRIIODOLTHYRONINEAFFECTDIETARYGLUCOSEUTILIZATIONANDPLASMAINSULINLEVELSINRAINBOWTROUTSALMOGAIRDNERIJFISHPHYSIOLBIOCHEM,1987,411312017MOONTWGLUCOSEINTOLERANCEINTELEOSTFISHFACTORFICTIONJCOMPBIOCHEMPHYSIOLB,2001,12924324918HEMREGI,MOMMSENTP,KROGDAHLACARBOHYDRATESINFISHNUTRITIONEFFECTSONGROWTH,GLUCOSE
