1、本科毕业设计（20_届）鲈鱼PPAR启动子的克隆所在学院专业班级海洋生物资源与环境学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录引言11实验材料和仪器111实验材料112主要试剂和和试剂盒113主要仪器12实验方法221基因组DNA提取222PPAR启动子区域的获取2221特异性引物的设计223PPAR启动子的克隆22311STPCR反应22322NDPCR反应32333RDPCR反应324电泳检测与克隆使用引物325PCR产物的切胶纯化4251重组质粒的构建和检测4252感受态细胞的制备426重组质粒的转化527重组质粒的鉴定5271重组质粒的抽提5272重组质粒的PCR检测及测序63实验结果与分
2、析631鲈鱼PPAR启动子基因序列分析632鲈鱼PPAR启动子基因功能位点与结构的分析74讨论7致谢错误未定义书签。摘要PPAR（PEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTOR），即过氧化物酶体增殖剂激活受体，是一类由配体激活的核转录因子，是核受体家族的一员。目前在哺乳动物中发现PPAR存在三种亚型，即PPAR、PPAR也称PPAR和PPAR。它们是配体调节的转录因子，在脂类代谢过程中起非常重要的作用。PPAR的三种亚型参与脂肪细胞分化作用的时相及程度各有不同，通过转染具有分化成脂肪细胞潜能的多种细胞系进行评价，PPAR的成脂作用最强。PPAR具有脂肪组织特异性
3、,能被脂肪酸及外源性过氧化物酶体增殖剂激活,而调控某些参与脂质代谢的酶的表达。为研究PPAR在脂肪组织研究中的表达调节，我们克隆了PPAR起始密码子上游1411BP序列，并使用生物信息学对此序列展开分析，查找其潜在的转录因子识别位点，其中有C/EBPB、CDXA、SRY、AML1A、SOX5、S8、PBX1、GATA等22个潜在的转录结合因子。关键词鲈鱼；PPAR启动子；克隆ABSTRACTPPARPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTOR,THEPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTORITISACLASSOFLIGAN
4、DACTIVATEDNUCLEARTRANSCRIPTIONFACTORANDAMEMBEROFTHENUCLEARRECEPTORFAMILYTHEREARETHREESUBTYPESOFPPAR,NAMELYPPAR,PPARALSOKNOWNASPPARANDPPARTHEYARELIGANDREGULATEDTRANSCRIPTIONFACTORSPPARPLAYAVERYIMPORTANTROLEINLIPIDMETABOLISMPPARTHREESUBTYPESOFCELLSINVOLVEDINTHEROLEOFFATPHASEANDTOVARYINGDEGREES,BYTRANS
5、FECTIONWITHTHEPOTENTIALTODIFFERENTIATEINTOFATCELLSEVALUATEAVARIETYOFCELLLINES,PPARADIPOGENICROLEOFTHESTRONGESTPPARWITHADIPOSETISSUESPECIFIC,WHICHCANBEEXOGENOUSFATTYACIDSANDPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATED,ANDREGULATIONOFCERTAINENZYMESINVOLVEDINTHEEXPRESSIONOFLIPIDMETABOLISMPPARINADIPOSETISSUEFORTHEST
6、UDYOFTHEEXPRESSIONANDREGULATION,WECLONEDTHEPPAR1411BPSEQUENCEUPSTREAMOFTHESTARTCODON,ANDTHISSEQUENCEUSINGBIOINFORMATICSTOANALYZE,TOFINDPOTENTIALTRANSCRIPTIONFACTORRECOGNITIONSITES,OFWHICHC/EBPB,CDXA,SRY,AML1A,SOX5,S8,PBX1,GATAANDOTHER22POTENTIALTRANSCRIPTIONBINDINGFACTORKEYWORDSBASSPPARPROMOTERCLONI
7、NG1引言核受体超家族是转录因子中最大的一个家族。过氧化物酶体增殖物激活受体PEROXISOMEPROLIFERATORSACTIVATEDRECEPTOR，PPAR是一类由配体激活的核转录因子，属于核内受体超家族成员。1990年，在啮齿类动物的肝脏中克隆出过氧化物酶体增值物激活受体PPAR后,紧接着又克隆出了其同源基因PPAR和PPAR，从此掀起了研究PPAR基因的热潮1。近年来，有关PPAR的多态性的研究十分活跃，提高了PPAR的生物学地位及其在人类疾病作用的认识2。过氧化物酶体增殖剂活化受体（PPAR是一个由配体激活的核转录因子属于核激素受体（NUCLEARHORMONERECEPTOR
8、）超家族。被激动剂激活以后,该受体可以促进葡萄糖的利用及胰岛素的增敏。激动剂成为一类全新的型糖尿病治疗药物。目前人们正致力于探讨如何干预PPAR基因转录和影响PPAR蛋白功能的药物及其作用的机制，若能全面地揭示PPAR功能，则将对肥胖、糖尿病、肿瘤等疾病的治疗大有益处。近年来有关PPAR多态性的研究成果层出不穷，提高了我们对PPAR生物学地位及其在人类疾病中作用的认识3。目前认为PPAR的常见多态性影响胰腺B细胞功能，导致胰岛素分泌周组织对胰岛素敏感性的改变。它与型糖尿病、肥胖、心血管疾病等发病风险相关联，其多态性的效应可被遗传和环境因素修饰，如肥胖、种族、遗传背景等。但是，各种突变在不同人群
9、的研究结果并不一致，可能是由基因互作及基因与环境的相互作用有关4。脂类在鱼体的营养代谢活动中担任着多种角色，作为鱼类的能量来源之一，有1020来自脂类的分解供能。另外,脂类还能提供鱼体所需的必需脂肪酸促进脂溶性维生素和类胡萝卜素等的吸收，改善动物的健康状况6。所以适当的脂肪储存是必须的。但是当脂肪含量过多时，就会在组织间转化为体脂沉积下来，将有可能影响鱼类的肉质。哺乳动物脂肪生成主要在肝脏组织中，而鱼类的脂肪合成主要在于肝脏、心脏、肠以及脂肪组织中。基因表达分析显示脂肪合成转录因子的表达模式在哺乳类与鱼类存在巨大的差异。这些分析表明哺乳类与鱼类的脂肪合成是不同的9。PPAR是动物脂肪组织发育的
10、重要调控因子，其信号通路影响细胞系统与脂肪代谢。PPAR在脂肪组织分化中的作用已在人体和小鼠胎盘试验中得到证实11。PPAR能够诱导肝细胞表达载脂蛋白、脂肪酸氧化酶系与脂蛋白脂酶等，从而促进脂质的氧化代谢，降低血脂浓度。PPAR的活化能够选择性诱导地与脂肪酸吸收相关的基因在脂肪组织的表达，如脂蛋白脂酶、脂肪酸转运蛋白与酰基COA合成酶基因等，但并不改变这些基因在肌肉组织中的表达，从而导致脂肪酸在肌肉组织中的相对缺失。对人PPAR的研究发现PPAR2在脂织中表达量很高，该基因PRO12ALA多态性与血清载脂蛋白B在不同基因型个体间的显著差异有关，证明PPAR2多态性可能与脂肪代谢异常有着密切关系
11、14。1实验材料和仪器11实验材料鲈鱼购买于宁波水产品大世界，活体取肌肉组织液氮速冻后备用。12主要试剂和和试剂盒氨苄青霉素上海生工，酵母提取物OXOID公司，胰蛋白胨OXOID公司，NACL，甘油上海生工，DNA凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒碧云天生物有限公司PMD18TVECTOR、UNIVERSALGENOMICDNAEXTRACTIONKITVER30、GENOMEWALKINGKIT、TAQDNA聚合酶TAKARA公司13主要仪器SORVALLFRESCO台式高速冷冻离心机（SORVAL公司），PCR仪（BIORAD公司），ND1000型微2量紫外分光光度计THERMO公司，YDS3
12、液氮罐四川亚西橡塑机器有限公司，电泳仪北京六一仪器厂，HVE50型高压灭菌锅HIRAYAMA公司，DK8D电热恒温水槽上海精宏实验设备有限公司2实验方法21基因组DNA提取使用研钵进行匀浆时（1）100MG的鲈鱼组织入冰浴预冷的研钵中，快速用力展研成匀浆。（2）650L的SOLUTIONA和09L的RNASEA1（使用时请混匀），温和研磨30秒钟。注）使用上述注）的实验材料时，请在加入SOLUTIONA及RNASEA1后，将研钵置65水浴上研磨1分钟。（3）650L研磨好的组织匀浆液移至COLLECTIONTUBE中。如果匀浆体积不足650L，请补充SOLUTIONA至650L，65保温5分钟
13、。22PPAR启动子区域的获取221特异性引物的设计根据本实验已经克隆到的PPAR基因CDNA全长，按计三条特异性引物，即SP1、SP2、SP3。图1特异性引物设计示意图FIG1SCHEMATICDESIGNOFSPECIFICPRIMERS根据经过验证的已知序列区（最好不少于500BP）设计三个特异性引物（见上图）设计方向为需要扩增的未知区域方向，SP2的位置应设计在SP1的内侧，SP3位于SP2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，一般以60100BP为宜。引物设计原则引物的长度为2226NT，GC含量4555，TM值6070，引物TM值计算公式TM693041（G/C）100650/
14、L（引物碱基数）。其他要求和普通PCR反应用引物相同。232311STPCR反应以APPRIMER（四种中的任意一种，以下以AP1PRIMER为例）作为上游引物，SP1PRIMER为下游引物，进行1STPCR反应。按下列组份配制1STPCR反应液。TEMPLATE（基因组DNA）X500NG,DNTPMIXTURE（25MMEACH）8L,10LAPCRBUFFERI（MG2PLUS）5L,TAKARALATAQ（5U/L）05L,AP1PRIMER（100PMOL/L）1L,SP1PRIMER（10PMOL/L）1L,DH2OUPTO50L1STPCR反应条件如下941MIN981MIN39
15、430SEC651MIN5CYCLES722MIN9430SEC；253MIN；722MIN9430SEC；651MIN；722MIN9430SEC；651MIN；722MIN15CYCLES9430SEC；441MIN；722MIN7210MIN2322NDPCR反应将1STPCR反应液稀释11000倍后，取1L作为2NDPCR反应的模板，以AP1PRIMER为上游引物，SP2PRIMER为下游引物，进行2NDPCR反应。按下列组份配制2NDPCR反应液。TEMPLATE（1STPCR反应液）1L,DNTPMIXTURE（25MEACH8L,10LAPCRBUFFERII（MG2PLUS）5
16、L,TAKARALATAQ（5U/L）05L,AP1PRIMER（100PMOL/L）1L,SP2PRIMER（10PMOL/L）1L,DH2OUPTO50L2NDPCR反应条件如下9430SEC；651MIN；722MIN39430SEC；651MIN；722MIN315CYCLES9430SEC；441MIN；722MIN37210MIN2333RDPCR反应将2NDPCR反应液稀释11000倍后，取1L作为3RDPCR反应的模板，以AP1PRIMER为上游引物，SP3PRIMER为下游引物，进行3RDPCR反应。按下列组份配制3RDPCR反应液。TEMPLATE（2NDPCR反应液）1L
17、,DNTPMIXTURE（25MEACH8L,10LAPCRBUFFERII（MG2PLUS）5L,TAKARALATAQ（5U/L）05LAP1PRIMER（100PMOL/L）1L,SP3PRIMER（10PMOL/L）1L,DH2OUPTO50L3RDPCR反应条件如下9430SEC；606821MIN；7224MIN39430SEC；606821MIN；7224MIN315CYCLES9430SEC；441MIN；7224MIN37210MIN24电泳检测与克隆使用引物取1ST，2ND，3RDPCR反应液各5UL，使用1的琼脂糖凝胶进行电泳。由于第一次克隆到的片段过短，我们在第一次克隆
18、到的片段基础下上设计引物继续克隆PPAR启动子区域。4表1引物对克隆的花鲈的PPAR基因5侧翼区TABLE1PRIMERSFORCLONINGTHE5FLANKINGREGIONOFLATEOLABRAXJAPONICUSPPAR引物名称引物序列（5TO3）PRIMERNAME表PRIMERSEQUENCEPPGA1SP1TGTTGGTCAGGTGCTCTTCGCTCTPPGA1SP2TGAGGAGATGCAGGATACAAGCGGPPGA1SP3TGGAGGCGTAGTCTAACGTGGACAPPGA1SP4AGGTCCACGGCGTTCAGACTGAAAPPGA2SP1TAGACACGCA
19、CACACACTCAGCACPPGA2SP2TGAACTCTGGCACTGAGAAATGGGTPPGA2SP3TTCCTCTGTTGCTGTTTGGGTGGCPPGA2SP4CAAAAGCACACAGAGAGCAGGGACT25PCR产物的切胶纯化切胶回收清晰的电泳条带，以SP3PRIMER为引物对PCR产物进行DNA测序，具体实验步骤如下1琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其他DNA尽可能分开，然后在紫外分析仪上用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块，放入15ML离心管中。判定DNA片段的位置时尽可能使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能短。2按照100L/100MG琼脂糖凝胶的比例
20、加入BINDINGBUFFER，置于5060水浴中10MIN，使胶彻底融化。加热融胶时，每2MIN混匀一次。3将融化的胶溶液转移至套放在收集管内的纯化柱中，室温放置1MIN。12000RPM离心1MIN。4取下纯化柱，倒掉收集管中的废液，将纯化柱放入同一个收集管中，加入700LWASHSOLUTION，12000RPM室温离心1MIN。5重复步骤4一次。6取下纯化柱，倒掉收集管中的废液，将纯化柱放入同一个收集管中，12000RPM室温离心1MIN。7将纯化柱放入一根新的15ML离心管中，在柱子膜中央加1030L水（PH70），室温或37放置5MIN。812000RPM室温离心1MIN，离心管中
21、的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于20备用。251重组质粒的构建和检测PCR纯化产物与PMD18T载体的连接经回收纯化的PCR产物与PMD18T载体进行连接，10L反应体系如下产物7L，PMD18T载体3L，SOLUTIONI250L。将上述混合物混匀，置4连接过夜。252感受态细胞的制备材料、试剂和仪器设备大肠杆菌DH5。01MOL/LCACL2称取分子量为147的CACL22H2O（上海生工生物工程技术服务有限公司）147G加蒸馏水定容至100ML，高压灭菌后4保存备用，甘油（上海试剂四厂）。LB培养基950ML蒸馏水中加入5G酵母提取物（OXOID公司），10G胰蛋白胨（OX
22、OID公司），5GNACL。调整PH值至70定容至1000ML。如需要固体培养基则每1000ML液体培养基中加入15G琼脂，高压灭菌后备用。氨苄青霉素（上海生工生物工程技术服务有限公司）。主要仪器设备方法BIOFUGESTRATAS大型冷冻离心机（HERAEUS公司）。（1）从LB平板上挑取新活化的ECOLIDH5单菌落，接种于35MLLB液体培养基中，375振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1100150的比例接种于100MLLB液体培养基中，37振荡培养23小时至OD60005左右。（2）将培养液转入50ML离心管中，冰上放置10MIN，然后于4下4000RPM离心10M
23、IN。（3）弃去上清，用预冷的01MOL/L的CACL2溶液10ML轻轻悬浮细胞，冰上放置1530MIN后，4下4000RPM离心10MIN。（4）重复步骤（3）。（5）弃去上清，加入2ML预冷的01MOL/L的CACL2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，加入甘油至终浓度15即成感受态细胞悬液。（6）感受态细胞悬液分装成200L的小份，贮存于70备用。注意事项（1）细胞生长状态和密度不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好。（2）试剂的质量所用的试剂，如CACL2等均需是最高纯度的GR或AR，并用
24、超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。（3）防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，枪头等要高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。26重组质粒的转化（1）去5L连接产物加入100L感受态细胞悬液中，轻轻混匀，冰浴20MIN。（2）42水浴热激90S，急速冰上冷却，冰浴23MIN。（3）加800L37预热的LB液体培养基，37170RPM振荡培养4560MIN。（4）将100L菌液涂布于加有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37培养过夜。2
25、7重组质粒的鉴定重组质粒的鉴定一般有两种，即限制性内切酶酶切和PCR检测。271重组质粒的抽提碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为当菌体在NAOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。质粒抽提采用碱裂解法所用溶液配方如下溶液50MMO1L葡萄糖5MMO1L三羟甲基氨基甲烷TRISHCLPH8010MMO1L乙二胺四乙酸EDTAPH80溶液II04MO1LNA0H，2SDS十二烷基硫酸钠，用前等体积混合。溶液III5MO1L醋酸钾60M
26、L冰乙酸115ML水285ML步骤如下（1）取15ML培养物入微量离心管中，室温离心8000G1MIN，弃上清，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。（2）将细菌沉淀重悬于100L预冷的溶液中，剧烈振荡，使菌体分散混匀。6（3）加200L新鲜配制的溶液，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），冰上放置5MIN。（4）加入150L预冷的溶液，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置5MIN。（5）12000G离心7MIN。（6）移上清于一新离心管中，加入1ML预冷的无水乙醇，混匀，室温放置25MIN，12000G离心5MIN。（7）1ML预冷的70乙醇洗涤沉淀12次，弃上清，将沉淀在室温下晾干。（8）20
27、L灭菌蒸馏水溶解沉淀。20保存备用。272重组质粒的PCR检测及测序以PMD18T载体通用引物M13F和M13R为上、下游引物，进行PCR检测，PCR反应体系同21342，引物序列见表2，PCR反应条件如下预变性945MIN；9430S，5230S，722MIN，32个循环；最后72延伸4MIN。表2PMD18T载体的通用引物TABLE2PMD18TVECTORPRIMERS引物名称引物序列53M13FGGTAACGCCAGGGTTTTCCM13RCAGGAAACAGCTATGACC3实验结果与分析31鲈鱼PPAR启动子基因序列分析应用基因组步行技术，经过第1次WALKING扩增得到约600B
28、P的PCR条带，将该条带回收、克隆、测序后得到605BPDNA片段，除去已知序列62BP,获得未知序列543BP；之后在第一次WALKING的基础上设计四条特异性，经过四轮不对称PCR获得片段大小约1000BP条带，将该条带回收、克隆、测序后得到935BPDNA片段，两次WALKING之后拼接获得PPAR启动子片段大小1411BP,序列如下ATGTGGCCCTAGTGGCCCCCTATACATATAAACTATTTTTGTCCTAGACTGTATCAGATTCAAACAAGTAACTTGTAGCTTTAAAGCCTGTAGTTTAGAAAAAACACTTTAACAATTAAATGCATCACA
29、TAAACAAGATATTGTACTCATTTCTGCATCATCAAACAACGTTGTACAAACGTACCCTTGATTATATAGCCCTGAATGTGGTTTGCTTTTGTGTGGACCGTAGTAACCTCCGATGACTGGACTTTGACCATCTCGGCTGACTTCTCTCCTCCAATGTGTGATCTGAGTTAGATATTGGAATGACTGAAGAGCCTTCATTCATTTGTATCAACAAAGAGCTGAATATCTAGAGGGAGCCGTGTGGTAGCAATCTGTTTCCAAGACTTTCTCAATGTTGGTTAAGCTAATTTTTCATACATT
30、ACTCAGGTAAATGTATTAATTTTTTTCCCAGTAGCAGAGTTTATTAAAGGATACTGCTGGTGATATACTATATTTTTCTCAGTGTAAATTAATTGATCCTACTAACAAGGATTGACAGTGTAACCGAAGTTTGATGTTACTTATTCTTCTGTGCCGTGCAGCTCCATTGTTGTTCAAAGAAATGCATTTTTGGTATTTGTCTGTTTTTTTGTTTTTTTTTAAGTAGGATTTGTTGTCAATAATGGGTTAGGGAAAATATAGAATAGCCATATCCTCTAATAACGCTGACCACAACATAGT
31、CTATTCAGGAATTAAGAATAAAATCTCGAGGTTGAAAAGGGCTAATTACAGCAGTTTTCAATGCCAACCCAGTTCTTAATTAACAATCGGTAACACATTTCAACACTCAGAAGGTGCTCTCCGTTCCACTCCAAAAGCTAGAATCTTATATCCTTGGCCTCAGACAGACTGAGGCTCAGACAGTCCCTGCTCTCTGTGTGCTTTTGTTGGGCAATCACACAGCCAGCCACCCAAACAGCAACAGAGGAAGATGGTGTTTTGAGCAGAAGACCCATTTCTCAGTGCCAGAGTTCATCTTGT
32、ACTCCCTGTTTACTAGATAACAGTGTAGGAATGAGCTGGGGGGGGGGTCATCATGGTGCTGAGTGTGTGTGCGTGTCTACGCATTGTTTATGTGTTGGGCTTTTCTGAACAGACATATTTAATCATTAACACTATGTACAATGCAGCATGTGGGTTTGTCTATATATGTTTTCACTGTCTTCTTTCTTTCTCCCTTCTTCTGTTTTTCTACTCTCTTTTATCTCATTGTCCATTTCTCTGTCTGGCTCTCTAACTTGTCTTCTCCCTCCCCTCCTTTCTC7CAGTTCTTCTAGTAATGTT
33、ATCTTTTAACAAGGCCACATACAGTCAACAAAGGATGTTGCATCAGCTATCGCATCACTGCTTCATCTCTCTCCACAGCAGACATGGTGGACACCCAGCAGCTCCTGGCCTGGCCTGTCGGTTTCAGTCTGAACGCCGTGGACCT32鲈鱼PPAR启动子基因功能位点与结构的分析基因侧翼序列的生物信息学分析是研究特定基因转录调控机制的重要手段，可以通过对基因侧翼序列中存在顺式作用元件的分析，初步判定影响该基因转录的各种因素。我们将该序列在HTTP/WWWCBRCJP/RESEARCH/DB/TFSEARCHHTML上进行潜在的真核转录因子
34、识别位点搜索。SCORE值等于或大于920的转录因子结合位点共22个，其中有C/EBPB、CDXA、SRY、AML1A、SOX5、S8、PBX1、GATA等潜在的转录结合因子图2。图2鲈鱼PPAR基因5侧翼序列的分析。FIG2SEQUENCEANALYSISOFTHE5FLANKINGREGIONOFTHELATEOLABRAXJAPONICUSPPARANARROWINDICATESTHESTARTSITE注箭头表示转录起始位点；下划线表示启动子；加框表示推测的转录因子结合位点。THETRANSLATIONSTARTCODONATGISUNDERLINEDPUTATIVEBINDINGSIT
35、ESFORTRANSCRIPTIONFACTORSAREBOXED4讨论脂类在鱼体营养代谢活动中担任多种角色，作为鱼类的能量来源之一，有1020来自脂类的分解供能。另外，脂类还能提供鱼体所需的脂肪酸，促进脂溶性维生素和类胡萝卜素等8的吸收，改善动物的健康状况17。因此适当的脂肪储存是必须的。但是当脂肪含量过多时，就会在组织间转化为体脂并沉积下来，将有可能影响鱼类肉质。哺乳动物脂肪生成主要在脂肪和肝脏组织中，而鱼类的脂肪合成主要在于肝脏、心脏、肠和脂肪组织中。基因表达分析显示脂肪合成转录因子表达模式在哺乳类和鱼类存在着巨大的差异。这些分析表明哺乳类和鱼类的脂肪合成是不同的。PPAR是脊椎动物脂肪
36、组织发育的重要调控因子，其信号通路影响细胞和系统脂肪代谢。PPAR在脂肪组织分化的作用已在人体及小鼠胎盘试验中得到证实18。PPAR能够诱导肝细胞表达载脂蛋白、脂肪酸氧化酶系与脂蛋白脂酶等，从而促进脂质的氧化代谢，降低血脂浓度。PPAR的活化能够选择性诱导与脂肪酸吸收相关的基因在脂肪组织的表达，如脂蛋白脂酶、脂肪酸转运蛋白与酰基COA合成酶基因等，但并不改变这些基因在肌肉组织中表达，从而导致脂肪酸在肌肉组织中的相对缺失。对人PPAR的研究发现PPAR2在脂织中表达量很高，该基因PRO12ALA多态性与血清载脂蛋白B在不同基因型个体间的显著差异有关，证明PPAR2多态性可能与脂肪代谢异常有密切关
37、系19。在哺乳动物及鱼类脂肪合成中，PPAR起了关键的作用。但是，现有的证据显示哺乳动物与鱼类的PPAR调节机制是不同的。基因结构显示人与小鼠的PPAR有两个独立的启动子能生产三种不同的MRNA亚型。但是，鱼类PPAR的启动子研究目前还处于空白阶段，因此对鲈鱼PPAR的启动子区域开展研究是对鱼类脂肪代谢十分重要的20。本研究利用基因步移技术克隆了鲈鱼PPAR启动子序列，此序列长1411BP表二，并利用生物信息学分析此序列21。将该序列在HTTP/WWWCBRCJP/RESEARCH/DB/TFSEARCHHTML上进行潜在的真核转录因子识别位点搜索。SCORE值等于或大于920的转录因子结合位
38、点共22个，其中有C/EBPB、CDXA、SRY、AML1A、SOX5、S8、PBX1、GATA等潜在的转录结合因子。其中C/EBPCCAAT/ENHANCERBINDINGPROTEIN与PPAR在哺乳动物脂肪合成是最重要的调节因子，它能促进PPAR的表达，因此我们推测C/EBPBCCAAT/ENHANCERBINDINGPROTEINB也能增强PPAR的表达，该结果与哺乳动物、鸟类、川鲽等研究结果相似。但是这些转录因子对PPAR的转录调控还需进一步实验验证26参考文献1陈刚,罗敏,丁伟,等瘦素受体基因变异与中国人肥胖的关系J中华内分泌代谢杂志,2001,1752983002陈志武,章家胜复
39、方银杏叶对大鼠心肌缺血损伤的保护作用叫中成药J1998,202030313刘仿,王文涓,金呈强PPAR激动剂吡格列酮对JURKATT细胞分化的调节作用J中华微生物学和免疫学杂志,2009,2911LL54勇王,继文PPAR基因在脊椎动物发育过程中的功能研究J生物信息学,2004,2151555利平,付方明PPAR研究进展J国外医学内分泌学分册,2003,23129326乾勇PPAR的结构与功能及其生物学作用J国外医学卫生学分册,2000,752842887刘晓海,董志PPAR的结构及其与疾病的关系J国外医学药学分册国外医学药学分册,2007,3432002058郑以漫,项坤三上海地区汉人瘦素受
40、体基因GLN223ARG变异的研究J上海第二医科大学学报,1999,1954354379李晓燕银杏叶提取物药理作用研究进展刚J药物流行病学杂志,2004,131111310称莉,李齐发,乔永等湖羊肌肉组织HFABP和PPAR基因表达水平与肌内脂肪含量的相关研J中国农业科学2008,413776378311吴江维,杨公社PPAR在八眉猪不同组织中的表达差异J畜牧兽医学报,2008,39327327712俊萍,朱丹妮等银杏叶的化学成分及其抗氧化活性J,中国天然药物2008,612613胡怡秀,藏雪冰银杏茶调节血脂和抗氧化作用实验研究J实用预防医学,2000,72135136914郑以漫,项坤三上海
41、地区汉人瘦素受体基因GLN223ARG变异的研究J上海第二医科大学学报,1999,19543543715乔永湖羊肌肉组织HFABP和PPAR基因表达水平与肌内脂肪含量的相关研J中国农业科学,2008,41113776378316吴江维,杨公社PPAR在八眉猪不同组织中的表达差异J畜牧兽医学报,2008,39327327717田丽霞,刘永坚,刘栋辉,等葡萄糖和玉米淀粉对草鱼生长和肠系膜脂肪沉积的影响J水产学报,2000，24543844118张文炜,徐列明转录因MEF2对多种信号通路的调节及其生物学作用J生物化学与生物物理学报,2004,20442342719王博,吴江维PPAR在八眉猪不同组织
42、中的表达差异J畜牧兽医学报,2008,39327327720金平,孔北华多聚乙烯基亚胺介导的卵巢特异性启动子调控下的自杀基因抑制卵巢癌细胞生长的体外研究J癌症,200578068L121庞卫君,李影脂肪细胞分化过程中的分子事件J细胞生物学杂志,2005,2749750022TANIGUCHIM,GUANLL,ZHANGADIPOGENESISOFBOVINEPERIMUSEULARPREADIPOCYTESJBIOCHEMBIOPHYSRES023KASONO,NISHIDA,TAMEMOTOHTHIAZOLIDINEDIONESINCREASETHENUMTOFPIATCLETSINILIL
43、OLLLNETHMMOEYTOPENICPURPURAMICEVIAINHIBITIONOFPHAGOCYTICACTIVITYOFTHERETIEULOENDOTHELIALSYSTEM2009,2611LL824KLIEWERS,XUHE,LAMBERTMHPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTORSFROMGENESTOPHYSIOLOGYJRECENTPROGHORMRES,20015623926325KELLERJM,COLLETP,BIANCHIA,ETALIMPLICATIONSOFPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECEPTORSPPARSINDEVELOPMENTCELLLIFESTATUSANDDISEASEJINTJDEVBIOL,2000,4442944226DJOUADIF,WEINHEIMERCJ,SAFFITZJE,ETALANDERRELATEDDEFECTINLIPIDMETABOLISMANDGLUCOSEHOMEOTASISINPEROXISOMEPROLIFERATORACTIVATEDRECAPTORDEFICIENTMICEJJCLININVEST,1998,10210831091
