1、本科毕业设计（20_届）鳗弧菌卵黄抗体的制备所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录目录11引言12试验材料及仪器221试验材料及试剂2211母鸡2212鳗弧菌抗原2213卵黄抗体纯化用试剂2214SDSPAGE电泳试剂2215ELISA试剂2216透析液222试验仪器及耗材23试验方法331高免鸡蛋制备332卵黄分离333卵黄液稀释334抗体沉淀335抗体透析336抗体含量测定337抗体纯度检验338抗体效价检测34结果与分析441抗体纯度检测结果442抗体含量测定结果443卵黄抗体效价检测结果544分析与讨论55小结7致谢错误未定义书签。参考文献8摘要本实验的目的是
2、制备抗鳗弧菌（VIBRIOANGUILLARUM）鸡卵黄抗体IGY并进行效价检测。具体方法是将蛋鸡经鳗弧菌三次免疫接种后，收集高免鸡蛋，4下保存备用；经稀释去脂、盐沉淀抗体法提取卵黄中IGY卵黄液用005MOLL1，PH50的乙酸乙酸钠缓冲液作10倍稀释，充分搅拌20MIN后，4下静置10小时，10000G离心20MIN去除脂质，取上清液加入适量饱和（NH4）2SO4，使饱和度达到40，盐析沉淀抗体，10000G离心20MIN，除去上清液，将沉淀用PBS透析；采用紫外分光光度法测定蛋白含量，SDSPAGE电泳检测IGY纯度，ELISA法检测IGY效价。结果获得了较为纯净的IGY，ELISA效价
3、为110240。关键词鳗弧菌；卵黄抗体；制备；效价ABSTRACTTHEPURPOSEOFTHISSTUDYWASTOPRODUCEEGGYOLKIMMUNOGLOBULINIGYAGAINSTVIBRIOANGUILLARUMANDEVALUATETHETTITEROFITTHEMETHODSWEREASFOLLOWINGLAYINGHENSWEREVACCINATEDWITHFORMALDEHYDEKILLEDVANGUILLARUMFOR3TIMESANDTHEEGGSWERECOLLECTEDEGGYOLKWASDILUTED10TIMESBYACETICBUFFER005MOLL1,
4、PH50,STIRRED20MIN,EXTRACTED10HAT4THEEXTRACTINGSOLUTIONWASCENTRIFUGED10000GFOR20MINAT4THESUPERNATANTSOLUTIONWASPRECIPITATEDWITH40AMMONIUMSULFATETHEIGYPRECIPITATEWASRESOLVEDANDDIALYZEDWITHPBSBUFFERIGYPURITYWASDETECTEDWITHSDSPAGEELECTROPHORESISIGYTITERWASDETECTWITHELISARESULTRELATIVELYPUREIGYWASOBTAINE
5、D,THETITEROFANTIVANGUILLARUMIGYWAS110240KEYWORDSVIBRIOANGUILLARUMIGYPRODUCTIONTITER11引言卵黄抗体（EGGYOLKIMMUNOGLOBAULI简称IGY），是指从经特异性免疫的禽蛋卵黄中提取出的针对特定抗原的一种抗体。当用某种抗原免疫产蛋母鸡时，母鸡经免疫应答后，可从其不断产出的鸡卵黄中得到大量均一、高效的卵黄抗体IGY。卵黄抗体的研究始于19世纪末至20世纪初1，1893年KLEMPERER2首次报道了鸡蛋中存在抗体。WILLIANMS等1962年发现卵黄免疫球蛋白（EGGYOLKIMMUNOGLOBULIN
6、,IGY）主要存在于禽类的卵黄中3。卵黄抗体跟哺乳动物血清抗体相比，有许多独特的优点，主要表现在绿色环保且无残留；高产低耗、低价且容易获得；性质稳定；识别力及鉴别力强；便于贮存且不易失效4，在较长时间内可保持稳定。4下，IGY甚至可保存510年；室温条件下，可保持抗体活性6个月，甚至在37条件下，也可保持活性1个月5。卵黄抗体能预防和治疗多种细菌性和病毒性疾病，无任何毒副作用，在很大程度上可替代抗生素和化学合成药物，同时还具有促生长的作用。目前在动物细菌性疾病防治上使用抗生素过多，造成药物残留，破坏环境的同时极大的打击了消费者的信心。近年来卵黄抗体技术的发展为细菌性疾病的治疗提供了更佳选择，它
7、已成为特异性抗体最方便、最廉价的来源，是最佳抗生素替代物。目前它已被广泛地用于许多传染病的防治，尤其是近几年来在人、畜、禽疾病防治上取得了喜人成绩。例如SUGITA等（1996）用甲醛灭活的26种病原细菌免疫母鸡后，其产生的IGY，在抑制假单孢菌的生长以及肠炎沙门氏菌的粘附的同时，还可减少葡萄球菌肠毒素A的产生量，有效地预防了多种肠道疾病的发生6；目前，口服IGY已成功地用于细菌、病毒引起的胃肠道感染，如幽门螺旋杆菌（HP）、沙门氏菌、肠毒性大肠杆菌、耶尔森鼠疫杆菌、腺病毒、轮状病毒（HRV）、葡萄球菌等的检测和治疗中7,8；同时也用于紧急预防和治疗传染性法氏囊病、新城疫病等9。抗肠道细菌IG
8、Y的作用机理已初步阐明，特定病原菌的IGY能直接黏附在病原菌的细胞壁上，抑制其生长，针对细菌鞭毛或菌毛的IGY则可以黏附在细菌的鞭毛和菌毛上，使细菌失去黏附功能，妨碍其游动。此外，IGY在肠道中被消化后降解成可结合片段，经肠道吸收后进入血液与特定的病原菌黏附因子结合，使细菌失去致病性10。在水产动物方面，卵黄抗体的相关研究报道较少11。但也有成功的报道，例如GUTIERREZ等曾在1993年报道，通过口服特异性IGY，日本鳗鱼可明显降低死亡率，清除肠道病原菌，从而减少对肝和肾的侵害6。据报道，以灭活处理的爱德华氏菌体为抗原对产蛋鸡进行免疫，制备抗爱德华氏菌的IGY，然后将IGY混入喂鳗鱼的人工
9、饲料中，对人工感染发病的鳗鱼进行治疗试验，观察IGY对鳗鱼爱德华氏菌症的治疗效果。结果表明，用IGY治疗鳗鱼的爱德华氏菌症，效果显著12。鳗弧菌是一种对水产鱼类具有严重危害性的细菌病原。目前，鳗弧菌引起的水产养殖动物疾病在世界范围内广泛流行，可感染鱼、虾、鳖类，并常给水产养殖业造成巨大的经济损失。鳗弧菌在危及水产鱼类的同时，也会通过食物链危害人类健康。因此，研究由鳗弧菌等弧菌引起的细菌性疾病的相关治疗方法具有重要的意义。本实验拟借鉴陆生人、畜、禽相关研发的成功经验，探索鳗弧菌鸡卵黄抗体的制备及纯化技术，以期为病害防治奠定基础。2011届宁波大学本科毕业论文鳗弧菌卵黄抗体的制备22试验材料及仪器
10、21试验材料及试剂211母鸡SPF海兰蛋鸡，购自宁波慈溪益大养殖场。212鳗弧菌抗原鳗弧菌由本实验室从香鱼体内分离并保存（史雨红老师提供），挑取菌种接种LB平板于28需氧条件下，倒置培养18H，挑取单菌落于LB液体培养基28振荡培养7小时后稀释平板计数，调整菌量为2109CFUML1，离心去除培养基后用09生理盐水重悬，按05加入甲醛，放37水浴锅灭活2448H，取100UL涂LB平板28倒置培养18H检测灭活情况，经检测无活菌后放4备用。213卵黄抗体纯化用试剂005MOLL1，PH50的乙酸乙酸钠缓冲液，配制1L加286ML乙酸，乙酸钠2324G，以1000ML双蒸水溶解，用20NAOH调
11、PH至50。饱和NH42SO4配制60条件下向双蒸水中边搅拌边加入NH42SO4至不能溶解，冷却后有晶体析出，过滤除去杂质。214SDSPAGE电泳试剂电泳缓冲液TRIS碱（MR12114）302G、甘氨酸（MR7507）144G、SDSMR2883810G，加双蒸水至1000ML即为10电泳缓冲液，稀释10倍即为1电泳缓冲液。5浓缩胶4ML水27ML、30丙烯酰胺溶液067ML、10MOLL1TRISPH6805ML、10SDS004ML、10过硫酸铵004ML、TEMED0004ML。12分离胶10ML水33ML、30丙烯酰胺溶液40ML、15MOLL1TRISPH8825ML、10SDS
12、01ML、10过硫酸铵01ML、TEMED0004ML。染色液01G250，40乙醇，10乙酸，其余为双蒸水。脱色液40乙醇，10乙酸，其余为双蒸水。215ELISA试剂包被缓冲液005MPH96碳酸盐缓冲液（CBS），NA2CO3159G，NAHCO3239G定容至1000ML；洗涤液（PH74PBST）NACL80G，KCL02G，KH2PO402G，NA2HPO412H2O29G，TWEEN2050L定容至1000ML；封闭液（1BSA）10G牛血清白蛋白加100ML洗涤液；磷酸盐柠檬酸缓冲液（PH50）柠檬酸192G，NA2HPO412H2O712G，定容至1000ML；底物邻苯二胺（
13、OPD）40MG加100ML磷酸盐柠檬酸缓冲液，用时加30H2O2150L；终止液2MH2SO4溶液。216透析液PBS母液配制A液称取NA2HPO412H2O312G加双蒸水至1000ML溶解；B液称取NA2HPO412H2O71632G加双蒸水至1000ML溶解。001MOLL1PBS（PH72）使用液配制取28MLA液和72MLB液，充分混合，用双蒸水稀释20倍。22试验仪器及耗材滤纸、烧杯、透析袋（MWCO10万，宽44MM，上海捷瑞生物公司，上海），透析袋在使用前应用2011届宁波大学本科毕业论文鳗弧菌卵黄抗体的制备3碳酸氢钠和EDTA煮沸处理并用蒸馏水清洗干净，洗净后放20乙醇中于
14、4下保存、透析袋夹（44MM）、酶标板、磁力搅拌器、移液器、电子天平、PH计、注射器（25ML）、核酸蛋白定量测定仪、酶标仪、UVP凝胶成像分析系统。3试验方法31高免鸡蛋制备将彻底灭活的抗原按11加入弗氏佐剂，振荡乳化。取SPF海兰蛋鸡3只，进行腿部肌肉多点注射，每只12ML，于15D和30D后进行加强免疫，剂量相同。初免用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂，进行常规饲养。于第3次免疫后10天开始收集鸡蛋，放4暂存。32卵黄分离用酒精棉擦拭鸡蛋表面污物，敲碎鸡蛋，将蛋清蛋黄释放于滤纸上，滚动蛋黄充分吸净蛋清。33卵黄液稀释用针头将卵黄刺一小口，取掉针头，直接用针筒吸取卵黄液盛于烧杯中（每
15、只鸡蛋取10ML卵黄液）。每10ML卵黄液加入100MLPH50乙酸乙酸钠缓冲液放磁力搅拌器上搅拌20MIN，放4冰箱中静置过夜后，分装于50ML离心管中离心4，10000G，20MIN，弃脂质沉淀，合并上清。34抗体沉淀向上述上清中加入适量饱和NH42SO4使终饱和度为40，搅拌均匀后放入4冰箱放置过夜。次日于4、10000G离心20MIN，沉淀用100MLPH72001MOLPBS重悬。在搅拌的同时，按140GL1加入NA2SO4，充分溶解后静置10H。35抗体透析将卵黄液于4、10000G离心20MIN，弃上清，合并沉淀并用15MLPBS缓冲液悬浮。将蛋白液装入透析袋，放入装有PBS缓冲
16、液的烧杯中透析过夜。开启磁力搅拌器增加透析速度，次日更换透析液2次。36抗体含量测定以PBS调零，将透析袋内样品（约20ML）取30L稀释10倍后，以核酸蛋白定量测定仪测蛋白含量。蛋白含量MGML1145OD280074OD260样品稀释度37抗体纯度检验以SDSPAGE测抗体纯度取20L透析后蛋白液，按11加入2LOADINGBUFFER，于100煮沸10MIN，置冰上冷却后取30L上样。浓缩胶浓度5，分离胶浓度12，在浓缩胶中电泳时电压100V，然后在分离胶中调整电压至120V。电泳结束后，以考马斯亮蓝染色，染色液量没过两块胶厚度，染色30MIN以上，至整个凝胶深蓝色，可轻易看到目的条带。
17、弃去染色液，用双蒸水冲洗，加脱色液摇床脱色，视目标带清晰度更换脱色液。最后用UVP凝胶成像系统拍照并根据条带分析纯度。38抗体效价检测本实验采用ELISA方法13,14对卵黄抗体进行效价检测。抗原制备鳗弧菌于28振荡培养过夜后，用5000G离心5MIN沉淀，弃上清，沉淀用20MLPH74PBS重新悬浮，超声波处理。其中超声条件为间隔时间2S，超声时间1S，全程15MIN。超声波破碎液低温离心（4、8000G、20MIN）后取上清，得到鳗弧菌超声粉碎抗原，测定抗原蛋白浓度。抗原包被用包被液稀释抗原，按每孔100L加于聚苯乙烯96孔反应板中，4放置过夜，其中抗2011届宁波大学本科毕业论文鳗弧菌卵
18、黄抗体的制备4原蛋白量为10NG/孔。洗涤次日倾去凹孔内的液体，洗涤液洗3次。封闭每孔加入100L封闭液，室温放置05H。洗涤用洗涤液洗3次。加入IGY样品先将IGY在另一反应板板上用PBS按1640，11280，12560，15120，110240倍比稀释，分别加入包被板反应孔中，每个稀释度2孔，每孔100L。设未经鳗弧菌免疫的鸡蛋的IGY为阴性对照，以PBS为空白。加盖37温育1H。洗涤用洗涤液洗3次。加入酶标抗抗体用封闭液110000稀释羊抗鸡IGGHRP，每孔加入100L，37温育1H。洗涤用洗涤液洗5次。显色每孔加入OPD底物溶液100L，37显色15MIN，显棕黄色。终止反应每孔加
19、50L2MH2SO4终止反应，在酶标仪上读取波长为492NM的吸光度（A）值。结果判断测定孔A值阴性对照孔均值21倍以上者判为阳性，阳性反应的最大稀释度即为待测样品的效价。4结果与分析41抗体纯度检测结果用UVP凝胶成像系统拍照，获得SDSPAGE图，如图1。在电泳图中可以看出，在66KD和30KD附近有两条明显的色带，分别为卵黄抗体的重链和轻链。与相关文献报道15一致，证明本实验分离得到的蛋白质为目的特异性免疫抗体，也说明了在分离卵黄液时脂肪去除得较彻底。此外，在43KD附近略有杂带出现，说明该样品中还含有少量的蛋白杂质。图1分离纯化的IGYSDSPAGE图FIG1SDSPAGEELECTR
20、OPHORESISMAPOFPURIFIEDIGYLINE1ISMARKER,LINE2ISPURIFIEDIGY42抗体含量测定结果用核酸蛋白定量测定仪测样品的蛋白含量，结果如表1。2011届宁波大学本科毕业论文鳗弧菌卵黄抗体的制备5表1蛋白质浓度测定结果TAB1THERESULTSOFPROTEINCONCENTRATIONDETERMINATIONOD260OD280蛋白含量（MGML1）样品027304274171由上表可知，每个鸡蛋IGY含量约为80MG（204171），与文献报道5每只鸡蛋约含卵黄抗体40180MG相符，说明母鸡受到了足够的抗原刺激，产生了大量的卵黄抗体。43卵黄抗
21、体效价检测结果经间接ELISA检测鳗弧菌卵黄抗体效价见表2。表2ELISA检测效价值TAB2THEIGYTITERDETECTEDWITHELISA项目IGY（A492）阴性对照（A492）/PBS0144839015184701533740135825样品116401265501915471184180176306样品2112800849782015695409252580162275样品3125600833224013750307565080136383样品4151200589499014341706323890127622样品5110240039796501281690430927011
22、8102注空白为不加IGY的PBS，阴性对照为未经鳗弧菌免疫的鸡蛋的IGY，A值阴性对照孔均值21倍以上者判为阳性“”。由表2可知，待测样品的ELISA效价为110240，结果较为理想。44分析与讨论禽类的免疫系统主要包括细胞免疫和体液免疫，它们分别受到胸腺和法氏囊的控制。一般情况下，当外来抗原刺激机体后，会产生一系列相关的免疫应答反应，使得大量特异性抗体进入血液循环。当血液流经卵巢时，卵细胞中会逐渐蓄积大量的特异性抗体（主要是IGG），形成卵黄抗体16。因此，卵黄中含有较高浓度的特异性抗体（IGY）。由于鸡的品种不同，产生的鸡蛋大小也会有所不同，所以每个鸡蛋中所含的卵黄抗体量也是不一样的。据
23、相关研究报道5，蛋黄中IGG的含量一般为2025MGML1，一只产蛋母鸡年产蛋率约为300个，而一个鸡蛋的蛋黄体积约为15ML，因而一只母鸡的抗体年产率约为100克。目前，已有相关研究表明蛋黄的重量与产蛋母鸡的只日产量有关,并会对IGY的生产效率造成影响。对于商业生产卵黄抗体来讲，蛋黄中IGY的浓度是一个重要的评价指标。蛋黄中IGY的浓度会因生产线和产蛋母鸡个体的不同而表现出差异，这表明如果想要提高IGY的产量，应该尽可能地通过改进生产线来生产出高性能的产蛋母鸡，以提高产蛋率。另外，也可通过遗传选育来提高母鸡的产蛋性能，以得到足够的蛋黄。2011届宁波大学本科毕业论文鳗弧菌卵黄抗体的制备6本实
24、验选用的是SPF海兰蛋鸡。海兰蛋鸡具有产蛋量高、日均耗料少、死亡率低、抗应激和抗病能力强、适应性强等优点，是国内外普遍使用的蛋鸡品种。进入高峰期后，其周龄产蛋率可高达95，饲养日产蛋数299320枚，入舍鸡产蛋数287307枚，32周龄平均蛋重587克。卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为1217。由于卵黄中的蛋白质大都属于脂蛋白质，主要存在于卵黄颗粒中，且不溶于水。只有卵黄中的卵黄球蛋白（、）是水溶性的，而IGY恰好是属于卵黄球蛋白。因此IGY的分离纯化应从水溶性蛋白中分离出IGY，即有效地去除卵黄中的脂类物质。近十几年来，随着对卵黄抗体研究的不断深入，已建立了许多较为高效而经济的方法，
25、如盐析、乙醇和聚乙二醇沉淀法、疏水层析法、辛酸沉淀法（CA法）等18。根据相关文献报道19，在纯化卵黄抗体时，单采用一种方法往往是不够的，常需多种方法综合应用。本实验即先以乙酸乙酸钠缓冲液对卵黄液进行稀释，离心去除颗粒，再用硫酸盐沉淀法浓缩，并经盐沉淀进一步纯化、浓缩。卵黄抗体主要贮存于卵黄中，卵黄中主要的蛋白即抗体。卵黄抗体纯化应先进行卵黄分离。本实验经验表明卵黄分离时，应用滤纸充分吸去蛋清，留取蛋黄。尽量减少蛋清的剩余量，为后续实验的进行提高准确度。由于卵黄液较粘稠，过度用力搅拌会导致抗体损失，所以搅拌要温和。为了充分将抗体溶入缓冲液中，搅拌要充分。卵黄液易变质，不能在常温下放置过久，纯化
26、过程中应置于4冰箱。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。本实验以SDSPAGE测抗体纯度，并用UVP凝胶成像系统拍照获得SDS图，从结果看本研究获得了较纯净的IGY，纯度比大部分文献的稍好。蛋白质纯化时，根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等，本实验采用透析法对卵黄抗体进行过滤提纯，简单有效。卵黄效价检测方法有ELISA方法、琼脂扩散法19等，其中用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型双抗体夹心法测抗原、双抗原夹心法测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体、ABSE
27、LISA法，间接法是最常用的方法。本次实验采用的是ELISA间接法。由于酶联免疫试验具有在方法上的特异性和灵敏性、操作上的简便性以及试剂的稳定性、对环境无污染等优点，已得到了越来越广泛的应用。本研究运用ELISA法检测自制的IGY，重复性好，结果稳定、规律，IGY效价高。鳗弧菌广泛存在于沿岸海水、沉积物和海洋动物体中，是海水鱼、虾、贝类的一种常见的细菌性病原。它是我国海水养殖动物重要的条件致病菌，具有较强的致病性。由鳗弧菌所引起的细菌性疾病已在水产养殖类动物中广泛流行，它可感染鲑鱼、香鱼、鲈鱼、鳕鱼、黄鱼等，具有传播速度快、影响泛围广、发病率高、死亡率高等特点20。在水产养殖动物疾病的防治方面
28、，抗生素等药物的使用对水产动物疾病的防治具有一定效果。但长期滥用药物或抗生素，在引起水环境污染的同时，也导致了养殖环境的恶化，进而引起生态平衡失调。并且在一定程度上妨碍了水产动物的正常生长，降低了整个群体的抗病能力，增加了发病的可能性。另外，长期使用药物也会导致大量耐药性微生物的出现，增加了疾病防治工作的难度。再者，药物残留还会对食用者构成潜在的威胁。因此，发展绿色药物应对水产养殖动物鳗弧菌病是当前的一项重要任务。目前，关于卵黄抗体应用于陆生动物疾病诊断、预防、治疗方面的研究越来越多，如李沁光21、房祥军、邹晓庭等22都曾报道，仔猪出生后口服猪大肠杆菌高免卵黄液，可明显降低仔猪腹泻率。何月英等
29、制备的抗小鹅瘟强毒卵黄抗体，对23日龄的雏鹅的保护率高达10023。据报道9，中国农科院哈尔滨兽医研究所已启动了用免疫鸡卵黄抗体治疗SARS冠状病毒的研究。目前，它已成功应用于预防因SARS冠状病2011届宁波大学本科毕业论文鳗弧菌卵黄抗体的制备7毒引起的严重急性呼吸综合症等疾病。为人们防治SARS提供了一种廉价、高效、方便的治疗手段。而对于卵黄抗体应用于水生生物，特别是水产养殖方面的报道相对较少。其中，闫东春24等曾报道，轮虫细胞膜可与白斑综合症病毒特异性结合，为探讨WSSV的治疗方法提供的一定依据。朱香萍、张再生25等通过口服途径使对虾体内保持一定的抗体水平，可以大大提高人工感染弧菌后对虾
30、的存活率，表明卵黄抗体对人工感染鳗弧菌病有明显的保护作用。李槿年26等利用从病鳖体内分离的4种病原菌制备诊断抗原，以病原菌的IGY做微量凝集试验，成功监测了鳖群中病原菌的感染情况。本实验通过借鉴陆生人、畜、禽相关研究的成功经验，应用卵黄抗体的新型无害、稳定性高、成本低、对环境无污染等优势，以纯培养的鳗弧菌作为抗原，探讨鳗弧菌卵黄抗体的制备技术及其效价的检测。希望通过卵黄抗体来治疗水产养殖动物病原引起的病害，为水产鱼类的养殖生产提供指导意义。5小结目前卵黄抗体已成为特异性抗体最方便、最廉价的来源，在动物疾病防治上取得了喜人成绩。它可减少药物残留量，是一种安全的绿色添加剂。卵黄抗体已得到了越来越广
31、泛的应用，具有广阔的开发前景，对于减少水产养殖业的经济损失具有重要的现实意义。本文成功制备高滴度抗鳗弧菌卵黄抗体，为将来作为水产饲料添加剂、水产疾病的检测及防控材料等运用奠定了技术和物质基础。2011届宁波大学本科毕业论文鳗弧菌卵黄抗体的制备8参考文献1杨菲菲卵黄抗体研究进展及应用J现代农业科技,2008,202312322KLEMPERERFUEBERNATRLICHEIMMUNITATUNDIHREVERWERTHUNGFRDIEIMMUNISIRUNGSTHERAPIEJARCHIVFREXPERIMENTELLEPATHOLOGIEUNDPHARMAKOLOGIE,1893,31356
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