1、本科毕业设计（20_届）乳酸菌冻干保护剂研究所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言111乳酸菌的功能112乳酸菌冻干技术的研究历史113乳酸菌冻干损伤114乳酸菌冻干保护剂的选择115乳酸菌冻干保护机理22材料与方法221实验材料222仪器与设备33实验方法331工艺流程332实验操作3321灭菌3322冻干保护剂的制备33221单一冻干保护剂的制备及选择33222复合冻干保护剂的制备及选择333菌体的活化与培养434冻干前活菌计数535菌体的收集及保护剂的添加536预冻及冻干537复水及活菌计数5371菌种的复水5372冻干后活菌计数538存活率的计算5
2、4结果与分析541单一保护剂的选择542复合冻干保护剂的选择6421复合冻干保护剂的菌种存活率6422复合保护剂单因素间的相互作用743最佳复合保护剂配方的确定验证85讨论8摘要乳酸菌在真空冷冻干燥过程中会受到损伤，加保护剂可以提高其存活率，从而筛选出乳酸菌存活率较高的保护剂。通过单因素比较和响应面实验设计，确定实验菌株的最佳冻干保护剂配方。根据乳酸菌存活率冻干后1毫升样液的活菌数/冻干前1毫升菌液的活菌数，得出乳酸菌的存活率，最终得到冻干保护剂的最佳配方。对单一保护剂作用筛选试验中，乳酸菌存活率较高的依次是海藻糖，L半胱氨酸，山梨醇，乙酸钠。复合保护剂作用中，乳酸菌存活率最高的保护剂配方为海
3、藻糖1182，L半胱氨酸171MG/ML，山梨醇103，乙酸钠1715时，此时，乳酸菌的存活率最高，为98737。乳酸菌在低温、干燥、隔绝空气的环境下保藏，保护剂有利于乳酸菌菌种的保存，并且在工业生产中，对发酵剂的制备有实际的应用价值。关键词乳酸菌；冻干保护剂；存活率。ABSTRACTLACTICACIDBACTERIAINVACUUMFREEZEDRYINGPROCESSWILLBEDAMAGED,THESURVIVALRATECANBEIMPROVEDBYADDINGPROTECTIVEAGENT,HIGHERSURVIVALRATEOFLACTICACIDBACTERIASELECTED
4、PROTECTIVEAGENTCOMPAREDBYSINGLEFACTOREXPERIMENTALDESIGNANDRESPONSESURFACETODETERMINETHEBESTEXPERIMENTALSTRAINSFREEZEPROTECTIONAGENTFORMULATIONSBASEDONFREEZEDRIEDLACTICACIDBACTERIASURVIVALRATE1MLSAMPLESOLUTIONAFTERTHENUMBEROFLIVEBACTERIA/1MLOFBACTERIALSUSPENSIONPRIORTOFREEZETHENUMBEROFLIVEBACTERIA,TH
5、ESURVIVALRATEOFLACTICACIDBACTERIAREACHEDTHEFINALFREEZEDRYINGPROTECTIVEAGENTSWERETHEBESTFORMULAPROTECTIVEEFFECTOFASINGLEAGENTINTHESCREENINGTEST,FOLLOWEDBYLACTICACIDBACTERIASURVIVALRATEOFHIGHTREHALOSE,LCYSTEINE,SORBITOL,SODIUMACETATECOMBINEDEFFECTOFPROTECTIVEAGENTS,THEHIGHESTSURVIVALRATEOFLACTICACIDBA
6、CTERIAFORMULATREHALOSEPROTECTIVEAGENT1182,LCYSTEINE171MG/L,103SORBITOL,1715SODIUMACETATE,THETIME,THEHIGHESTSURVIVALRATEOFLACTICACIDBACTERIA,WAS98737LACTICACIDBACTERIAWHICHWASINCOLD,DRYAIRENVIRONMENTISOLATEDPRESERVATION,PROTECTIONAGENTWASCONDUCIVETOTHEPRESERVATIONOFLACTICACIDBACTERIA,ANDININDUSTRIALP
7、RODUCTION,WHICHPREPARATIONOFTHEFERMENTHASPRACTICALVALUEKEYWORDSLACTICACIDBACTERIAFREEZEDRIEDPRESERVATIVESURVIVAL1引言11乳酸菌的功能随着我国乳制品产业的飞速发展，市场对乳酸菌产品的需求增大，尤其是乳酸菌发酵剂的质量方面，更是得到了广泛的关注。乳酸菌具有多种生理功能，包括治疗乳糖不耐症；促进蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收；分泌维维生素B；改善人体肠道功能，抑制腐败菌的繁殖，清除肠道垃圾；抑制胆固醇吸收，降血脂、降血压；以及免疫调节作用，增强人体免疫力和抵抗力；抗肿瘤、预防癌症作
8、用等，因此，乳酸菌的保藏和乳酸菌发酵剂的制备是乳酸菌诸多功能得到利用的前提条件和重要保证。保藏的微生物细胞在冻结状态及真空条件下升华，最后达到干燥的目的。而低温、干燥和隔绝空气是保藏菌种的几个重要因素，在这些条件下，微生物的生命活动将处于休眠状态，代谢相对静止，因此可以长期保存。12乳酸菌冻干技术的研究历史真空冷冻干燥简称冻干技术出现在18L1年左右，当时用于生物体的脱水。L8L3年美国人WOLLASTON发现水的饱和蒸气压与水的温度有关，在真空低温条件下，水容易汽化，水在汽化时将导致温度的降低。根据这一发现，1909年SHACKELL开始用冻干法干燥血清和细菌。1935年第一台商业用冻干机问
9、世，随后冻干技术扩展到医药、食品领域。现在冻干技术已经加入到高新技术领域的行列。西方乳业科学家早在19世纪末20世纪初，就已开始研制浓缩发酵剂，处于技术领先水平的丹麦HANSEN公司于1988年底研制的浓缩型冻干发酵剂活菌含量高101010L2CFU/ML，可直接应用于工业化生产。我国对浓缩发酵剂的研究起步较晚，目前国内已有直投式发酵剂的专利问世，但生产过程中尚存在许多问题需要解决。目前我国在生产浓缩发酵剂的企业与发达国家存在很大的差距，影响我国乳业的发展1。13乳酸菌冻干损伤乳酸菌菌株在冷冻干燥后，于贮藏过程中最大程度的保持了乳酸菌的活性，无论从经济角度还是技术角度来讲都是具有很高价值的。微
10、生物细胞的存活取决于许多因素，包括微生物起始浓度、培养基、非致死性处理、冻干保护剂和复水环境等2。保护剂可以减轻冷冻干燥或复水过程中外界因素对细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性。获得适宜的冻干保护剂配方对细胞在冻干和贮藏过程中的存活性至关重要3。乳酸菌细胞在冻干过程中会受到一定的损伤，包括机械损伤、溶质损伤、细胞膜损伤、细胞代谢调节作用损伤。机械损伤是由低温时细胞内外冰晶生长产生的机械力量引起的，一般冰晶越大，细胞膜越易破裂，从而造成细胞死亡。冰晶小，对细胞膜的机械损伤也较小4。溶质损伤又称“溶液损伤”，是由于水的冻结使细胞问隙内的液体逐渐浓缩，从而使电解质的浓度显著增加5
11、。冻干过程中，细胞膜脂肪酸的不饱和度、链的长度、链的分支状态或环绕状态存在动态变化，脂肪酸的动态变化与膜的流动性密切相关。微生物细胞的干燥损伤很大程度上是由于膜脂性质、结构的变化使膜的流动性或完整性改变，从而导致膜的功能失调6。当细胞内某一关键酶失活，会造成细胞代谢受阻，积累了影响正常生理功能的某种产物，从而整个细胞代谢紊乱，导致细胞死亡7。14乳酸菌冻干保护剂的选择对于冻干保护剂的研究有很多，主要有泡菜乳酸菌，干酪乳杆菌，瑞士乳干菌，保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌，双岐杆菌812。对于这些菌种的保护剂筛选，已有很多的研究。保护剂主要包括单一的保护剂和复合保护剂两种，单一保护剂基本上是从糖类、醇类
12、、氨基酸类、无机盐类中进行筛选，以获得最为适合实验菌株的原料，符合保护剂的种类以及含量也由于菌种的不同而有所区别。目前乳酸菌发酵剂可采用真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等不同的方法进行制备，许多研究者发现冷冻干燥具有其他方法无法比拟的优点，是制备和保存生物材料最有效的方法之一，并得到越来越广泛的应用。真空冷冻干燥发酵剂于70年代初期开始研制，现在已经开始商业化，这种发酵剂含活菌数高，发酵活力强，遗传性稳定，便于储藏，携带方便，使用安全，因而它被广泛地应用13。随着乳酸菌对人体健康有益作用机理的深入研究和揭示。乳酸菌产品逐渐受到人们的重视。乳酸菌菌粉是生产这些产品的重要原料，而常用于制备乳酸菌菌粉的
13、方法是真空冷冻干燥法简称冻干8。而为了提高冻干后的存活率，则需要研究乳酸菌的冻干保护剂。在研究过程中，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌可以从扫描电镜观察样品的结够与形态14。15乳酸菌冻干保护机理保护剂从以下方面对乳酸菌进行保护，保护剂对膜相变温度TM的影响，冻干过程中，膜质经历了从液晶态到凝胶态的相的变化。在室温下复水时，处于凝胶态的干燥质膜又经历了从凝胶态到液晶态的转变，由于膜经历了状态的转变，某些区域产生缺陷，使得膜渗漏。若在冻干前加入二糖如海藻糖可降低干燥膜的膜相转变温度，当磷脂干燥脱水时，海藻糖在失水部位以氢键和磷脂的极性端相连，防止状态的转变和复水时的渗漏，从而提高细胞的存活率15；保护
14、剂对体系玻璃化转变温度的影响，玻璃化是指物质以非晶态形式存在的一种状态，其粘度极大，具有液体的性质。由于这种非晶体结构的扩散系数很低，故在这种结构中分子运动和分子变性反应非常微弱，不利的化学反应能够被抑制，从而提高被保存物质的稳定性16；保护剂对蛋白结构的影响，一些亲水且能透过细胞膜的小分子保护剂能渗入细胞内抑制冰晶生成、减缓冰晶生长，冷冻时可减少对细胞的损伤；而不能穿透细胞膜的大分子保护剂有很强的亲水特性和氢键形成能力。保护剂利用它们的氢键和亲水基形成稳定的水分子层阻碍膜内结合水向外转移，保护了细胞结构17。冻干保护剂的加入能保护乳酸菌的存活率，保护介质在干燥后起支撑作用，在冻干过程中起保护
15、作用。冻干的样品不失原有的固体骨架结构，保持原有的形态。冻干使保护介质具有多孔结构，该结构使冻干菌粉具有理想的速溶性和速复水性。冻干后菌体附着在保护介质上，大大减少了菌体暴露于外部的区域，减少了外界环境因素对菌体的影响，降低了菌体死亡的可能性，从而提高了其冻干存活率。另一方面保护剂与菌体细胞壁结合，有助于稳定细胞内部成分，有助于菌体细胞冻干存活率的提高。本实验拟以糖类、氨基酸类、醇类、无机盐类作为单因素保护剂，分别在这四类保护剂中选择出乳酸菌存活率较高的保护剂，再根据响应面设计复合保护剂。得到各种组合下复合保护剂的存活率，得到存活率最高的保护剂，并且进行验证。2材料与方法21实验材料菌种实验室
16、保藏菌株试剂海藻糖上海展云化工试剂有限公司分析纯，蔗糖国药集团化学试剂有限公司，分析纯，乳糖上海展云化工试剂有限公司，分析纯，葡萄糖上海展云化工试剂有限公司，分析纯，谷氨酸钠上海展云化工试剂有限公司，分析纯，L半胱氨酸上海展云化工试剂有限公司，分析纯，甘油国药集团化学试剂有限公司，分析纯，甘露醇上海展云化工试剂有限公司，分析纯，山梨醇国药集团化学试剂有限公司，分析纯，乙酸钠天津市博迪化工有限公司，分析纯，硫酸锰国药集团化学试剂有限公司，分析纯，氯化钙国药集团化学试剂有限公司，分析纯，蒸馏水，脱脂乳黑龙江省完达山乳业股份有限公司，分析纯，氯化钠江苏强盛化工有限公司，分析纯，蛋白胨杭州微生物试剂有
17、限公司，分析纯，牛肉膏杭州微生物试剂有限公司，分析纯，酵母提取物杭州微生物试剂有限公司，分析纯，柠檬酸氢二铵国药集团化学试剂有限公司，分析纯，磷酸氢二钾天津市博迪化工有限公司，分析纯，琼脂上海展云化工试剂有限公司，分析纯。MRS培养基用于菌种的活化，制备种子液和活菌计数葡萄糖20G，蛋白胨10G，牛肉膏10G，酵母提取物5G，吐温801ML，柠檬酸氢二铵2G，乙酸钠5G，硫酸锰0189G，七水硫酸镁058G，磷酸氢二钾2G，琼脂15G固体，蒸馏水1000ML，调PH6264。分装后于115灭菌20MIN。22仪器与设备锥形瓶，玻璃棒，电炉，烧杯，药匙，大离心管，移液枪EPPENDORF5ML，
18、1ML，100UL，枪头5ML，1ML，100UL，试管架，离心管，培养皿，涂玻棒，；立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂LDZX50KBS，净化台控制器苏州华科净化设备有限公司，冷冻干燥机北京博医康实验仪器有限公司，FD1D80型，超低温保存箱，恒温恒湿培养箱宁波江南仪器厂，HWS智能型，组合式全温度振荡培养箱太仓市华美生化仪器厂，QHZ12A型，离心机长沙湘仪离心机仪器有限公司，H2005R2型电热恒温鼓风干燥箱上海精宏实验有限公司，DHG9108A型。3实验方法31工艺流程乳酸菌菌种的培养16H稀释、接种、培养48H计活菌数乳酸菌菌种的培养16H离心加入冻干保护剂单一/复合分装预冻24H
19、真空冷冻干燥24H复水16H,同前面的培养时间一致计活菌数计算存活率1832实验操作321灭菌灭菌实验所用到的与菌体接触到的所有仪器与试剂都需要经过严格的灭菌处理，灭菌条件为115，20分钟。322冻干保护剂的制备3221单一冻干保护剂的制备及选择将表1中的试剂按照相应浓度溶解在12的脱脂乳中，灭菌备用。表1单一冻干保护剂的类型及浓度冻干保护剂类型浓度冻干保护剂类型浓度糖类海藻糖蔗糖乳糖葡萄糖醇类甘油甘露醇山梨醇10101010222氨基酸谷氨酸钠L半胱氨酸缓冲盐类乙酸钠硫酸锰氯化钙空白无菌蒸馏水5200MG/ML02020203222复合冻干保护剂的制备及选择将表2中的试剂按照相应浓度溶解在
20、12的脱脂乳中制备成为复合冻干保护剂，灭菌备用。表2复合保护剂的3水平选择水平A海藻糖BL半胱氨酸MG/MLC山梨醇D乙酸钠10181012150200250102030015020025制作四因素三水平的响应面表格表3复合冻干保护剂的各种组合实验序号A海藻糖BL半胱氨酸MG/MLC山梨醇D乙酸钠1234567891011121314151617181920212223242526271081081010881010101210101210101010121012810812122002002002002001502001502502001502002001502002502002502502
21、0015015025020020025020031322232123121221232222122301502025025020250202020202020202025015015025020150150202025015020233菌体的活化与培养将实验室保藏的菌株于12脱脂乳培养基中活化，待生长情况稳定后，以3的浓度接种于MRS培养基中进行培养。34冻干前活菌计数采用梯度释平板计数法，即在无菌操作条件下，取100UL的菌液，加09ML的灭菌生理盐水，制成110的均稀释液，再依次进行L0倍递增稀释，至适当稀释度106，107,108后，分别取各稀释浓度100UL于固体培养皿中，每个梯度做3
22、个平行，然后用涂玻棒使菌体分散均匀，倒置，放入37、恒湿的培养箱中培养48H，之后，测定乳酸菌的菌体数，根据菌体的多少，可以全部计数或者平均分成4块，取其中一块计数4，得到菌体数。活菌测定主要用于冻干前菌体数的测定做3次平行，取平均和冻干后菌体数的测定做3次平行，取平均8。35菌体的收集及保护剂的添加取30ML菌液于已灭菌且编号的离心管4000R/MIN离心20MIN，去上清，加入30ML的已灭菌的生理盐水清洗。再于各管中分别加入已灭菌的30ML保护剂，充分混匀，放置12MIN后，以1ML分装于15ML离心管中，并对应编号。36预冻及冻干将已分装的各样品于40冰箱中预冻24H后，开盖，用保鲜膜
23、缠绕，再用消毒的牙签戳孔，放入瓶中，外接于真空冻干机冻干，冻干条件为真空度308PA，冷凝温度为8990，冻干时间24H。37复水及活菌计数371菌种的复水将冷冻干燥后的样品1ML、2组共2ML接种于75MLMRS培养基中3的浓度,摇床培养24H。372冻干后活菌计数方法同冻干前活菌计数。38存活率的计算194结果与分析由于脱脂乳价格合理，不论是单独使用还是与其它保护剂混用均有较好的保护效果，一般将其作为冻干保护剂的主要成分。根据相关文献，以经济角度考虑，选择价廉的冻干保护剂，并通过预试验确定添加量。41单一保护剂的选择本试验以12的脱脂乳和醇类选择甘油、甘露醇和山梨醇，糖类选择海藻糖、蔗糖、
24、乳糖和葡萄糖，缓冲盐类选择乙酸钠、硫酸锰和氯化钙，氨基酸类选择谷氨酸钠和L半胱氨酸，以冻干后存活率为指标，进行单因素试验，结果如表4。根据表4中的冻干后乳酸菌的存活率，可以得出糖类中的海藻糖，氨基酸类的L半胱氨酸，醇类的山梨醇，缓冲盐类的乙酸钠是乳酸菌在冷冻条件下存活率较高的。可在复合保护剂的研究中使用。冻干剂复水后1ML样液的活菌数冻干前1ML菌悬液的活菌数乳酸菌存活率表4单一保护剂对菌种存活率的影响冻干保护剂浓度冻干前菌数109冻干后菌数109存活率糖类海藻糖蔗糖乳糖葡萄糖氨基酸谷氨酸钠L半胱氨酸醇类甘油甘露醇山梨醇缓冲盐类乙酸钠硫酸锰氯化钙空白无菌蒸馏水101010105200MG/ML
25、222020202019191919191919191919191919142088028106016055113088127108060064013754615569296046675732347由SPSS软件可以得到相关的分析数据见表5，海藻糖、山梨醇与乙酸钠对保护剂的保护作用非常显著，相对而言，L半胱氨酸的显著性较小，它对保护剂的保护作用较弱。但是海藻糖，L半胱氨酸，山梨醇，乙酸钠中每个水平的显著性非常接近，它们对保护剂的保护作用前后保持一致。表5各因素在各水平的显著性大小变量水平平均值显著性海藻糖L半胱氨酸山梨醇乙酸钠1011011011010335105471081640569605
26、662053420640404749069180502058560553211109091091090911142复合冻干保护剂的选择421复合冻干保护剂的菌种存活率以单因素保护剂筛选出来的海藻糖，L半胱氨酸，山梨醇，乙酸钠为原料，使用四因素三水平响应面法探究不同浓度对菌种存活率影响，结果见表6。表6复合冻干保护剂对菌种存活率的影响实验序号A海藻糖BL半胱氨MG/MLC山梨醇D乙酸钠冻干前的菌数109冻干后的菌数109存活率12345678910111213141516171819202122232425262710810810108810101012101012101010101210128
27、108121220020020020020015020015025020015020020015020025020025025020015015025020020025020031322232123121221232222122301502025025020250202020202020202025015015025020150150202025015020219191919191919191919191919191919191919191919191919191914706414404807115712805115707506716307915916605811804614514306714
28、8050070041154157773476253883682782403586428487306224767535782637218183实验结果使用SPSS软件对实验结果进行分析并建立响应面的模型，得到在复合冻干保护剂的各影响因素中，海藻糖的影响因素最大，山梨醇次之，L半胱氨酸最小，各因素对存活率的影响主次顺序为海藻糖山梨醇乙酸钠L半胱氨酸，并且，添加量与存活率均呈正相关。422复合保护剂单因素间的相互作用复合保护剂中的海藻糖，L半胱氨酸，山梨醇，乙酸钠各个因素的作用，以及各个因素的相互关系，得到方差、自由度、平均值、F值、显著性见表7，由此可以得出海藻糖与海藻糖，L半胱氨酸与山梨醇，L半
29、胱氨酸与乙酸钠的显著性较好，在乙酸钠的量一定的时候，海藻糖与L半胱氨酸随着自身浓度的增加，乳酸菌的存活率提高，保护作用增大；山梨醇相反。在山梨醇的量一定的时候，海藻糖，L半胱氨酸与乙酸钠随着自身浓度的增加，乳酸菌的存活率提高，保护作用增大。L半胱氨酸的量一定的时候，海藻糖，山梨醇与乙酸钠随着自身浓度的增加，乳酸菌的存活率提高，保护作用增大。海藻糖的量一定的时候，L半胱氨酸与乙酸钠随着自身浓度的增加，乳酸菌的存活率提高，保护作用增大；山梨醇反之。表7各因素及因素间的相互关系的分析因素方差自由度平均值F值显著性更正模型海藻糖L半胱氨酸山梨醇乙酸钠海藻糖L半胱氨酸海藻糖山梨醇海藻糖乙酸钠L半胱氨酸山
30、梨醇L半胱氨酸乙酸钠山梨醇乙酸钠误差总和1571A6701069500040008000800000033000200440072001400011003415712411111111111227006567010695000400080008000000330002004400720014000016066916452572170619192201950719286083381737417310791617574834432000600000001009300480048045800120178000900060028存活率的计算可以根据海藻糖，L半胱氨酸，山梨醇，乙酸钠这四个因素、四个因素
31、之间的相互作用、四个因素的平方来确定，存活率可以由以下公式来表达存活率03959024A001769B002573C002558D00092AB009122AC00206AD01048BC013377BD00592CD00853A2004956B202208C2001315D243最佳复合保护剂配方的确定验证根据模型可以得出最佳复合保护剂的配方成分为海藻糖的水平为091，L半胱氨酸的水平为058，山梨醇的水平为097，乙酸钠的水平为057，也就得相当于海藻糖的浓度为1182，L半胱氨酸的浓度为171MG/ML，山梨醇的浓度为103，乙酸钠的浓度为1715，按照上述的保护剂浓度的配比，进行实验，
32、得出实验结果，与存活率1进行比较。实验中测得以下数据冻干前的乳酸菌的数为19109CFU/ML，冻干后的乳酸菌数为1876109CFU/ML，得到乳酸菌的存活率为98737，与预测的结果相近。5讨论实验结果表明乳酸菌在冻干过程中，使用保护性能较高的保护剂可以起到很大的作用。根据文献参考，保护剂一般是从糖类、醇类、氨基酸累以及盐类四大方面选取保护效果较好的复合保护剂。在研究乳酸菌冻干保护剂的实验中，首先从糖类、醇类、氨基酸类以及盐类筛选出单因素的保护剂，得出海藻糖，L半胱氨酸，山梨醇，乙酸钠的保护作用下乳酸菌的存活率较高。各因素对存活率的影响主次顺序为海藻糖山梨醇乙酸钠L半胱氨酸。由海藻糖，L半
33、胱氨酸，山梨醇，乙酸钠四种因素根据一个三水平组成一个响应面的27次的实验，得到各次实验的菌种存活率，四个因素、四个因素之间的相互作用对存活率的影响效果，得到乳酸菌存活率最高的复合保护剂。海藻糖的浓度为1182，L半胱氨酸的浓度为171MG/ML，山梨醇的浓度为103，乙酸钠的浓度为1715，在这样的保护剂的组合下，得出乳酸菌在冻干之后的存活率接近1。对存活率最高的复合保护剂进行实验验证，然后实验得出的存活率与理论的存活率进行比较，两者非常接近。与泡菜乳酸菌，干酪乳杆菌，瑞士乳干菌，保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌，双岐杆菌比较，保护剂对乳酸菌的保护效果较好，使用相同含量保护剂乳酸菌的存活率更高。乳酸
34、菌在冷冻干燥的过程中，细胞在会受到一定的损伤，包括机械损伤、溶质损伤、细胞膜损伤、细胞代谢调节作用损伤。加入保护剂之后，可以对乳酸菌进行膜相变温度TM的影响，对体系玻璃化转变温度的影响，对蛋白结构的影响等方面的进行保护。有研究者认为，糖类物质上的经基与细胞膜磷脂上的磷酸基团连接形成氢键，从而阻止和限制细胞膜因失水而融合，并降低相变温度，不易向凝胶相转变而保持细胞液晶相，从而增加膜的流动性。防止蛋白质因冻干而变性，使菌体细胞在低温冷冻和干燥失水的情况下，仍保持细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。糖类保护剂由于具有多个经基，可以与菌表面自由基联结起来，避免菌体暴露在介质中，还可与蛋白质形成氢键以取代
35、水，保证蛋白质的稳定性。在溶液中易结合水分子，发生水合作用，减少了游离水的含量并增加了溶液的豁性，从而减缓晶核的生长过程，使形成的冰晶较细小，以达到保护细胞的目的。冻干保护剂能保护乳酸菌的存活率，保护介质在干燥后起支撑作用，冻干的样品不失原有的固体骨架结构，保持原有的形态。冻干后菌体附着在保护介质上，大大减少了菌体暴露于外部的区域，减少了外界环境因素对菌体的影响，降低了菌体死亡的可能性，从而提高了其冻干存活率。另一方面保护剂与菌体细胞壁结合，有助于稳定细胞内部成分，有助于菌体细胞冻干存活率的提高。乳酸菌在冻干保护剂的保护作用下，提高了在低温、干燥、缺氧环境下的存活率，有利于它自身的保存，菌种的
36、保藏。乳酸杆菌科以乳酸杆菌属最为重要，大多是工业上尤其是食品工业上的常用菌种。存在于乳制品，发酵植物食品如泡菜、酸菜、青贮饲料、及人的肠道，尤其是乳儿肠道中。我国发酵乳制品工业的迅猛发展，积极研究并大力开发高效浓缩型酸奶冻干发酵剂，对推动我国酸奶发酵剂的生产水平，提高国产发酵剂的竞争力，具有重要的意义21。乳酸菌是酸奶的发酵剂，乳酸菌良好的生长是保证酸奶的品质的关键因素。乳酸菌作为一种蔬菜腌制剂,和与多种食品质相关的重要微生物已有较多文献报道。研究优良乳酸菌菌种的高效培养技术以及其保藏方法对发乳酸菌作为蔬菜发酵剂具有重要的现实意义22。甘油、山梨醇、甘露醇多元醇在商业上可用被用作一个控制冷冻保
37、护剂23。乳酸菌菌种的保藏是一门关键的技术，可以有效的发展乳酸菌产业，对经济的发展有着重要的作用。相信在今后的科学研究中，应该可以研究对保护效果更好的保护剂。参考文献1英华,霍贵成,郭鸽乳碱菌冷冻干炼保护剂的筛选J食品科技,2006,1172752CARVALHOAS,SILVA7,HOP,ETALEFFECTOFVARIOUSGROWTHMEDIAUPONSURVIVALDURINGSTORAGEOFFREEZEDRIEDERTEROCOCCUSFAECALISANDENLERACOCCUSDURANSJAPPLIEDMICROBIOLOGY,2003,949479523靳志强,李平兰培养基
38、、保护剂和饥饿处理对冻干乳酸菌存活性的影响J食品科学,2007,72962994朱敖兰,杨洁生物制品冻干保护剂及其保护机理的研究进展J喀什师范学院学报,2007,646505BUMSOOHANANDJOHNCBISCHOFDIRECTCEL1INJURYASSOCIATEDWITHEUTECTICCRYSTLLIZATIONDURINGFREEZINGCRYOBIOLOGY,2004,488216李春,张兰威乳酸菌细胞膜冻干损伤研究进展J中国乳品工业,2004,32428297蒲丽丽,刘宁,张英华等乳酸菌冻干保护剂及保护机理的研究进展J中国乳业,2005650528董英,林泽营,周国磊等泡菜乳
39、酸菌冻干保护剂的研究J食品工业,2007,110129邢蕾,吴晖,刘冬梅等干酪乳杆菌鼠李糖亚种冻干保护剂的研究J中国乳品工业,2009,11151710林云双岐杆菌冻干保护剂条件的研究J饲料研究,2002,64711古元懿,欧军,粱金钟保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌冻干工艺条件的研究J酿酒,2008,4475112蒲丽丽,刘宁,霍贵成嗜热链球菌冻干保护剂保护作用的研究J食品科技,2007,7323413张英华,霍贵成,郭钨乳酸菌冷冻干燥技术研究进展J东北农业大学学报,2005,36679914蒲丽丽,刘宁保加利亚乳杆菌冻干保护剂保护作用的研究J中国酿造,2010,5464815SAMUELBLES
40、LIEETA1TREHALOSEANDSUCROSEPROTECTBOTHMEMBRANESANDPROTEINSININTACTBACTERIADURINGDRYINGJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY1995,61103592359716钟芳食品的冷冻玻璃化保藏J食品与机械,2000,795917吴玲,潘道东,刘海燕瑞士乳杆菌冻干保护剂的选择J2010,115715918张英华,霍贵成,郭鸽乳酸菌冷冻干燥保护剂的筛选J食品科技,2006,11727519董英,林泽营,周国磊等泡菜乳酸菌冻干保护剂的研究J食品工业,2007,1101220纪振杰,郭德军利
41、用响应面法优化双歧杆菌冻干保护剂的配比J中国生物制品学杂志,2008,981381621邓鹏超乳酸菌的高密度培养及酸奶冻干发酵剂的研究D华中农业大学微生物学,200822吴祖芳,翁佩芳,楼佳瑜乳酸菌的高密度培养及发酵剂保藏技术的初步研究J食品与发酵工业,2009,55923MICHELESAVINI,CINZIACECCHINI,MARIACRISTINAVERDENELLIPILOTSCALEPRODUCTIONANDVIABILITYANALYSISOFFREEZEDRIEDPROBIOTICBACTERIAUSINGDIFFERENTPROTECTIVEAGENTSJNUTRIENTS2010,2,330339
