1、毕业论文文献综述生物技术ISSR分子标记在植物研究中的应用概况摘要文章介绍了ISSR分子标记技术的原理及特点，用ISSR分子标记技术实验的基本研究方法，以及ISSR分子标记技术在不同植物种质资源研究中的应用现状等。最后，对ISSR分子标记技术在植物种质资源研究方面的发展做了展望。关键词ISSR；分子鉴定；遗传多样性；品种鉴定；应用ISSRINTERSIMPLESEQUENCEREPEAT是一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记技术，由加拿大蒙特利尔大学ZIETKIEWIEZ等1在1994年创建，它的基本原理是在SSR的3或5端锚定24个碱基做引物，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导
2、致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的INTERSSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。1ISSR分子标记的特点ISSR分子标记技术兼具SSR、RAPD、RFLP、AFLP等分子标记的优点，与SSR相比，ISSR不需要预先获知序列信息而使成本降低2，且多态性更丰富；与RAPD相比，ISSR重复性高，稳定性好，同时具备RAPD的简便、易操作等特点；与RFLP、AFLP相比，ISSR更快捷、成本较低、DNA用量小、安全性较高3,4。因此在多种植物的品种鉴定、遗传多样性分析、基因定位、遗传图谱的构建等方面已得到了广泛的应用。2IS
3、SR基本研究方法21基因组DNA的提取与检测取收集到的几种相似茶花的叶片干燥后，用改良的CTAB法514提取叶片DNA，NDA通常不用纯化，但需用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量与浓度，浓度需相同。稀释后20保存备用。22PCR扩增根据相关文献设计多条PCR引物，由上海生物公司合成。拿到引物后进行预实验，进行引物筛选，筛选出扩增带型清晰且重复性好的引物序列做进一步研究。经预实验优化实验条件，以确定最终反应条件，即PCR反应体系及PCR扩增程序。PCR产物在3的琼脂糖凝胶上120V电压下电泳约15H后，用凝胶成像系统拍照保存。23结果分析根据得到的电泳图，人工读取上面的条带，然后把有条带记为1，无条
4、带记为0，建立原始矩阵。随后采用P0PGEN32软件分析数据，分别获得茶花品种间的多态性位点数、多态性位点率PPL、NEIS基因多样性指数H、遗传相似系数HS等8,15。再用NTSYS210软件基于NEIS无偏估计的遗传相似性按UPGMA法进行品种间的聚类分析，绘制出品种间的亲缘关系树状图，由此将品种分类。3ISSR分子标记在植物种质资源研究中的应用ISSR分子标记技术在植物种质资源研究方面的应用已非常广泛，包括遗传相似性研究、品种鉴定以及遗传图谱的构建等。以下是ISSR分子标记技术在许多不同物种中的应用。31ISSR分子标记在槐树品种鉴定中的应用冷言峰6等人运用ISSR分子技术对香花槐、龙爪
5、槐、刺槐和红花槐4份相似槐树材料进行了品种鉴定和聚类分析，主要目的是鉴别香花槐和红花槐是否“同物异名”。从50条ISSR引物中筛选出19个条带清晰且重复性高的引物，扩增得到了224条带，其中多态性条带214条，占955。结果表明各槐树之间的相似性系数在018091之间，香花槐和红花槐之间的相似系数最大，为091。4种槐树在DNA分子水平上的差异较明显，据此可初步认为香花槐和红花槐不存在同物异名现象。该实验证明ISSRPCR在品种资源的研究中具有较大的应用潜力，同时也得到ISSR检测出的位点数目较多这个优点。32ISSR分子标记在芍药栽培品种鉴定中的应用于恒秀16等人采用ISSR引物标记技术，初
6、步分析了8个芍药栽培品种莲台、紫霞映雪、妒花魁、粉玉奴、蓝田碧玉、紫金龙、鱼鳞红、合欢娇、红莲等之间的亲缘关系。5条引物共扩增出21条谱带，亲缘指数分析表明蓝天碧玉与其余的七个品种之间的关系较远，其次是粉玉奴。该实验还得出，影响扩增反应结果清晰、准确的主要因素有退火温度、MG2浓度、TAQ酶等，提醒我们在今后的实验中可特别注意这几个因素。33ISSR分子标记在桉树遗传多样性中的应用张党权14等人以桉树的赤桉、巨桉、细叶桉和粗皮桉4个主要栽培种的L8个种源作为研究材料，根据优化的ISSRPCR反应体系和扩增条件，从100条引物中筛选出12条扩增条带特异、条带数适中、背景清晰、重复性好的引物，总计
7、扩增出120条清晰可重复的DNA条带，其中93条是多态性条带。每个引物可扩增的多态条带长度范围为3002500BP，数目在411条，平均为775条，多态带百分率为775。NEI遗传距离和遗传一致度的结果表明，遗传一致度的变化范围在0387109140之间，遗传距离的变化范围在0089909491之间，桉树4个种的种间遗传相似性差异较大，种内遗传相似性极高。34ISSR分子标记在杏李品种上分子鉴定的应用段伟17等人采用ISSR分子标记,对14个杏李品种进行了遗传多样性分析,从100条ISSR引物中筛选出多态性较高的22条引物，对14个杏李品种进行扩增,共扩增出205个位点,其中特异性位点168个
8、，多态性位点比率为8195；聚类分析结果表明14个杏李品种中味馨与其它品种之间平均遗传距离最大,风味玫瑰与味厚之间遗传距离最小UPGMA聚类分析可将14个供试品种分为两大类,即味馨单独为1类,其他品种聚为第2类。35ISSR分子标记在茶树上的应用姚明哲、黄海涛等18利用筛选出的8个ISSR引物对六个茶树品种的基因组DNA进行扩增。共扩增出99条带，其中多态性条带82条，多态性为796。NEILI系数分析结果表明，供试品种的相似系数在0535到0735之间，可将6个品种聚为两类，茂绿、翠峰、青峰、迎霜和劲蜂聚为一类，龙井43单独聚成一类。JOUANNLAI等19应用RAPD及ISSR技术分析台湾
9、地区引进的品种和台湾野生茶树共37个样本，结果表明RAPD不能区分所有样本，而ISSR可以区分所有样本。谭和平20等采用100个ISSR引物对32个茶树资源的DNA进行PCR扩增反应，初步建立32个茶树资源的ISSR分子指纹图谱。王亨洪21等人利用ISSR分子标记技术对四川、重庆等地12份重要的野生大茶树资源的遗传多态性进行了分析。7条多态性引物共扩增出146条扩增带，其中139条为多态性带，多态位点百分比为952。根据在相同迁移位上有扩增带记为1、无带记为0的方法构建矩阵，然后用软件分析。经软件分析得到供试品种间的相似系数介于037071，平均为051，基因H和SHANNON信息系数分别为0
10、20和034。在此基础上建立了聚类分析树状图，将其12个品种划分成了3大聚类组。通过以上可知，ISSR分子标记技术在茶组植物的品种鉴定、种质资源分析、遗传多样性分析等方面已经有了广泛的应用。36ISSR分子标记在茶花上的应用罗晓莹22等运用ISSR分子标记技术，利用筛选出的10条ISSR引物，对珍稀濒危植物杜鹃红山茶的2个亚种群60个单株的遗传多样性进行了研究。结果显示杜鹃红山茶的遗传多样性较低，亚种群间遗传分化较小。倪穗8等采用ISSR分子标记技术对国内外具有代表性的20个茶花品种进行了品种间遗传关系的分析，从60条随机扩增引物中筛选出了2L条谱带清晰且重复性好的引物序列，共扩增出153条扩
11、增带，其中多态性条带146条，多态位点百分比为954。用软件进行品种间多样性分析得出20个供试品种间的遗传相似系数HS介于050074之间，平均值为063。结合茶花形态学特征与UPGMA聚类分析结果，可将20个茶花品种分为2个大类群。潘仙鹏23等采用ISSR分子标记技术对2种茶花品种及其变异新品种进行了遗传多样性分析，所选用的100个引物中有12个产生了较为清晰有效、重复性好的条带。12个引物共扩增出110条带，其中8个引物可扩增出多态性条带，但只有13条特异性条带，多态位点百分率为118。该实验虽然得到了较低的多态性，但仍说明了茶花变异品种和原种间具有一定的遗传变异。ISSR分子标记技术在茶
12、花的种质资源研究及品种间遗传多样性分析中已有了一定的应用，只是相关的文献还是不多，相信随着今后ISSR分子标记法更广泛的应用，在这方面的研究一定也会越来越多的。4展望ISSR作为一种新型的DNA分子标记技术，在植物种质资源研究尤其是种质资源鉴定、遗传多样性分析和亲缘关系及基因定位等方面得到了较为广泛的应用24，而且与其他分子标记技术相比优势也较为突出。然而，ISSR分子标记技术还是存在一些不足的，例如其呈孟德尔遗传，为显性标记，不能区分纯合体与杂合体25。在扩增条带有无的判读上受人为主观因素影响较大，不同的人的判读结果不一定一致，如何减少人为因素的影响，使其尽可能的公正客观是其改进的方向。此外
13、，ISSR虽然已经广泛用于植物种质资源鉴定的研究，但是由于目前仍缺乏标准的DNA指纹图谱库，还不能大规模广泛应用于作物品种真实性和纯度鉴定17。相信随着分子生物学和生物信息学技术的不断发展和改进，ISSR分子标记技术凭借其简便、经济、快速、多态性高、稳定性强等优点将越来越得到广泛使用，特别是应用于大批量样品的研究，为植物种质资源研究以及遗传多样性分析方面发挥更大的作用。参考文献1ZIETKIEWIEZE,RAFALSKIA,LABUDADGENOMEFINGERPRINTINGBYSIMPLESEQUENCEREPEATSSRANCHOREDPOLYMERASECHAINREACTIONAMP
14、LIFICATIONJGENOMICS,1994,2021761832IANDGODWIN,ELISABETHABAITKEN,LAWRENCEWSMITHAPPLICATIONOFINTERSIMPLESEQUENCEREPEATISSRMARKERSTOPLANTGENETICSJELECTROPHORESIS,1997,18152415283朴红梅,李万良,穆楠等ISSR标记的研究与应用J吉林农业科学,2007,32528304宁静,朱旗,黄建安等ISSR分子标记及其在茶树遗传育种研究中的应用J茶叶科学技术,2008,2585欧阳彩虹,何桥,秦国新等25个菊花品种遗传多样性的ISSR分析
15、J山西农业大学学报自然科学版,2010,3032012046冷言峰,马云芳,何桥等几个槐树植物的ISSR鉴定J西南师范大学学报自然科学版,2007,32683867田青松,韩冰,杨劼等96份雀麦属材料遗传多样性的ISSR分析J中国草地学报,2010,118258倪穗,李纪元,王强20个茶花品种遗传关系的ISSR分析J林业科学研究,2009,2256236299王照兰,杨持,赵丽丽等扁蓿豆不同品系ISSR标记遗传差异和遗传多样性J中国草地学报,2010,1111710赵晓清,王波,王一等利用ISSR分析野生蘑菇与双孢蘑菇的遗传多样性J四川大学学报自然科学版,2009,4641130113411倪
16、穗,田敏,李纪元等红山茶总DNA提取及ITSPCR扩增条件优化研究J浙江林业科技,2007,272161912李延龙,张明,曹秀敏等ISSR分子标记技术在金叶女贞品种鉴定中的应用J安徽农学通报,2008,14223939,3413霍光,李德芳,陈安国利用ISSR分子标记分析44份红麻种质资源的遗传多样性J安徽农业科学,2009,37219890989214张权党,田华,谢耀坚桉树4个种遗传多样性的ISSR分析J中南林业科技大学学报自然科学版,2010,301121715SUSHMAVERMA,TSRANAGENETICDIVERSITYWITHINANDAMONGTHEWILDPOPULATI
17、ONSOFMURRAYAKOENIGIILSPRENG,ASREVEALEDBYISSRANALYSISJBIOCHEMICALSYSTEMATICSANDECOLOGY,20111616于恒秀,王淼,梁国华等ISSR引物鉴定芍药栽培品种之间亲缘关系的初步研究J植物生理学通讯,2006,42227127417段伟,闫文德,乌云塔娜14个杏李品种的ISSR分析及分子鉴别J内蒙古农业大学学报自然科学版,2010,214715318姚明哲,黄海涛,余继忠等ISSR在茶树品种分子鉴别和亲缘关系研究中的适用性分析J茶叶科学,2005,25215315719JOUANNLAI,WEICHENYANG,AN
18、DJUYINGHSIAO,ANASSESSMENTOFGENETICRELATIONSHIPSINCULTIVATEDTEACLONESANDNATIVEWILDTEAINTAIWANUSINGRAPDANDISSRMARKERSBOTBUUACADSIN2001,429310020谭和平,徐利远,余桂蓉等茶树种质资源ISSR分子标记初步研究J核农学报,2006,20211311521王亨洪,索化夷,杨坚等川渝地区重要野生大茶树遗传多样性的ISSR分析J茶叶科学,2009,29216817222罗晓莹,庄雪影,杨跃生杜鹃红山茶遗传多样性的ISSR分析J热带亚热带植物学报,2007,1529310023潘仙鹏,洪莉,干才连等2个茶花变异种与原种间的ISSR分析J浙江农业科学,2010,229529724朱岩芳,祝水金,李永平等ISSR分子标记技术在植物种质资源研究中的应用J种子,2010,2555925KOSMANE,LEONARDKJSIMILARITYCOEFICIENTSFORMOLECULARMARKERSINSTUDIESOFGENETICRELATIONSHIPSBETWEENINDIVIDUALSFORHAPLOID,DIPLOID,ANDPOLYPLOIDYSPECIESJMOLECULARECOLOGY,2005,142415424
