1、毕业论文文献综述生物技术卵黄抗体的研究进展摘要卵黄抗体IGY是从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，它是一种具有较强免疫功能的蛋白质，目前已被广泛应用于动物疾病的诊断及防治。本文对卵黄抗体的形成、性质、作用机理、分离提纯方法及其在检测诊断上和疾病防治方面的应用情况进行了综述，可以预见，随着研究的进一步深入，卵黄抗体的应用将不断扩大。关键词卵黄抗体；应用；研究进展0引言卵黄抗体EGGYOLKIMMUNOGLOBAULI简称IGY指母鸡所产蛋的蛋黄中含有的免疫球蛋白。卵黄抗体的研究始于19世纪末至20世纪初1，自1893年KLEMPERER首次报道鸡蛋中存在抗体以来,人们对卵黄抗体IGY的研究越
2、来越多,认识也越来越深入,应用也日益广泛。目前它已被广泛地用于许多疾病,尤其是近几年来,在家禽传染病的防治上得到广泛应用。现阶段在卵黄抗体的形成、生物学特性等方面已研究的比较清楚，并且卵黄抗体作为诊断试剂和防治药物的研究愈来愈受到关注。本文就卵黄抗体的形成、生物学特性、作用机理、提纯方法以及应用等作一综述。1卵黄抗体的形成禽类的免疫系统包括细胞免疫和体液免疫，分别受胸腺和法氏囊的控制。当机体受到外来抗原刺激后，产生一系列免疫应答反应，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，浆细胞分泌大量特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体主要是IGG在卵细胞中逐渐蓄积，形成卵黄抗体2，3。2卵黄抗体的
3、特性与哺乳动物相比,产蛋母鸡生产抗体具有快速、成本低、效率高、产量高的特点。有证据表明,卵黄原抗体对比哺乳动物原抗体有更好的生物学优势4。IGY在结构上类似于哺乳动物的IGG,但在化学结构上有许多不同点。IGY的分子量为180KDA,即6770KDA的重链和2230KDA的轻链，沉降系数为7S，等电点接近525。而IGG分子量为150KDA,即50KDA的重链和2223KDA的轻链。IGY由于结构中比IGG重链多了一个恒定区,但却没有IGG特有的铰链区,所以IGY的摆动性、柔韧性下降,但IGY的分子量较IGG大,所以稳定性较高。IGY具有较强的耐热、耐酸能力,在PH49的环境中稳定,在65下可
4、保持活性24H以上。与哺乳类IGG相比,IGY有更多的疏水性分子,这恰好使它更适于脂类含量丰富的卵黄环境6。卵黄抗体IGY相对于传统哺乳动物的抗体IGG具有以下优点（1）IGY不与哺乳动物补体、FC受体结合，也不与葡萄球菌蛋白A（SPA）或链球菌蛋白G（SPG）结合；IGY还不与血清中的类风湿因子（RF）结合，因而用IGY检测可避免假阳性结果，提高免疫学检测的准确性2。（2）产生免疫反应所需的抗原剂量小，由于禽类与哺乳动物在种系发生史上距离较远,IGY抗体与抗原亲和力高,产生有效免疫应答所需的抗原剂量较小,且不易与哺乳动物的免疫球蛋白发生交叉反应6。（3）每个蛋大约含100MG以上的IGY，一
5、个月可达3G，相当于兔子的1020倍；卵黄中没有其他的IG，易于提纯5。（4）在实际生产中，动物的采血不仅对动物本身是极大的应激，而且费时、费工，大规模生产是不切实际的，而利用蛋鸡生产抗体要方便的多1。3卵黄抗体的作用机理特定病原菌的卵黄抗体能直接黏附于病原菌的细胞壁上，改变病原细胞的完整性，直接抑制病原菌的生长；卵黄抗体可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；一部分卵黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，这些片段含有抗体的可变小肽（FAB）部分，这些小肽很容易被肠道吸收，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性，而IGY的稳定区（FE部
6、分）留在肠内7。4卵黄抗体的分离、提纯方法卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例为12。大部分蛋白质都是脂蛋白质，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白（、）是水溶性的，而IGY是卵黄球蛋白。因此IGY的分离纯化首先需有效地去除卵黄中的脂类，从水溶性蛋白中分离IGY4。41卵黄抗体的粗提近二十几年来,已建立了许多较为高效而经济的方法,如聚乙二醇沉淀法、氯仿抽提法、水稀释法、辛酸沉淀法CA法等。411聚乙二醇（PEG）沉淀法PEG是非离子型水溶性聚合物,高浓度不引起蛋白质变性,沉淀时间比硫酸铵和乙醇都短,不影响离心处理。该法最早由POLSON报道17。一般用PBS或TBS作缓冲液将卵黄液稀释
7、5倍,加入35的PEG6000或硫酸葡聚糖,10000R/MIN低温离心25MIN后取上清,可得卵黄抗体粗提物。412氯仿抽提法NTAKARUTIMANA在15ML的蛋黄液中加入40MLTBS和40ML氯仿,以10000R/MIN低温超速离心25MIN后保留水层。中间层再用40MLTBS萃取一遍。两步得到的水层均为WSF。有些人还用丙酮作为萃取液。此法去除脂类比较彻底,上清液澄清透明,抗体回收率高,但上清液中残留有机溶剂,对抗体活性有影响,同时有机溶剂造成的环境污染比较严重,因而此法仅适合实验室少量制备。413水稀释法19倍的蒸馏水稀释卵黄,利用01的盐酸调节蒸馏水的PH至50,搅拌15MIN
8、,置4过夜后脂蛋白自然沉淀,通过以10000R/MIN低温超速离心25MIN去除脂类,收集上清液即得WSF18。414辛酸沉淀法CA法辛酸沉淀法CA法则是利用抗体蛋白的化学性质进行分离和纯化。在低离子强度、PH4245的酸性条件下,辛酸可与绝大多数的卵黄蛋白反应,形成不可逆的沉淀,唯有IGY类抗体蛋白不发生反应,仍留在上清中,离心除去沉淀,将上清的PH调整到70左右,用硫酸铵使IGY析出,可得到纯度80以上的IGY,该法经济、简便、快速,不损害抗体活性,回收率高8。42IGY的精细纯化421超滤法超滤法多使用多空纤维超滤膜进行,也可在IGY的多次沉淀或亲和层析后用于研究的进一步纯化。KIM等研
9、究表明19,用AMICONCELL系统,可截取大于一定分子量的蛋白,浓缩倍数可随意调整,对抗体活性无影响,是其中较好的方法。缺点是超滤装置成本较高。422离子交换层析IGY多以葡聚糖交联的弱碱性阴离子交换剂DEAE为载体,磷酸盐缓冲液为吸附,洗脱体系进行分离纯化。陈天豹等用DEAETOYOPEAL650M阴离子交换色谱法分离纯化IGY,总蛋白回收率达9320。423无机物沉淀法该法是蛋白质提取的经典方法,最常用的是硫酸铵或硫酸钠沉淀法。RUAN等用水稀释法粗提卵黄获得水溶性成分后,加入等体积磷酸盐缓冲液PBSPH74稀释,再加入饱和硫酸铵PH6070，使硫酸铵浓度为50,4静置1H,5000R
10、/MIN离心20MIN,弃上清。再用PBS溶解沉淀至原IGY的体积,加入饱和硫酸铵至33饱和度,5000R/MIN离心20MIN,取沉淀。如此重复23次可获高纯度的IGY。424凝胶层析FU等在用水稀释法获得WSF后,再过SEPHADEXG75柱子,进行凝胶层析,可获得高纯度的IGY。CONSTANTINOIU应用TGEL纯化鸡的IGY,回收率为637。5卵黄抗体的应用卵黄抗体作为一种廉价、易获得的抗体，目前已得到越来越广泛的应用。51卵黄抗体在动物疾病诊断、防治方面的应用在免疫诊断方面，由于IGY不激活补体、不结合类风湿因子、不与SPA、SPG、哺乳动物FC受体，与IGG几乎无交叉反应，这使
11、得卵黄抗体在检测诊断上具有更强的特异性和灵敏度，它可作为免疫学实验检测工具，用于测定循环复合物、类风湿因子和补体等，减少假阳性5。同时又避免了动物采血的痛苦，受到实验动物的保护者的欢迎。从而使得越来越多的的人倡议用卵黄抗体取代高免血清。在疾病预防方面，由于卵黄抗体能抵抗幼龄动物肠道中胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的消化，故常在幼畜饲料或添加剂中加入一定量的针对某些特定疾病的卵黄抗体,以使其获得有效的被动保护免疫力。何月英等利用小鹅瘟强毒制备的卵黄抗体,对23日龄雏鹅进行预防,其保护率高达1004。房祥军等报道在用不喂初乳的仔猪所做的试验中,不让母猪哺育初生仔猪而代之以代乳料,出生6H内对照组与处理组分
12、别给饲盐溶液或抗大肠杆菌的鸡IGY,结果表明,与对照组相比,饲喂鸡IGY的仔猪死亡率与腹泻率下降,72H后对照组和试验组的死亡率与腹泻率分别为65和85、11和399。李沁光等报道,仔猪出生后口服猪大肠杆菌高免卵黄液,可明显降低仔猪黄痢的发生率10。此外，卵黄抗体还被广泛应用于许多动物疾病的治疗，且效果都较为显著。如詹丽娥等用IBD、ND和EDS76三联高免卵黄抗体治疗上述三种疾病,总有效率可达50以上12。汪铭书应用抗鸭病毒性肝炎DHV的卵黄抗体治疗人工感染的鸭时,当用1万倍LD50强毒时保护率可达到10013。张毓金等曾对流行于粤闽一带蕃鸭养殖区的花肝病研制出了抗蕃鸭花肝病的卵黄抗体进行治
13、疗试验,结果表明该抗体对于花肝病的早期预防与治疗效果明显14。张英等用抗小鹅瘟的卵黄抗体治疗发病鹅群,治愈率为952。目前国内广泛应用于禽类疾病防治方面的有抗传染性法氏囊病、抗鸡新城疫、抗鸭病毒性肝炎、抗鸡减蛋综合症等卵黄抗体。用卵黄抗体治疗疾病,安全、高效且无公害,我国已有商品化的卵黄抗体供应,如农业部已批准四川畜牧兽医学院研制的IBD精制蛋黄抗体为二类新生物制品。52卵黄抗体在水产养殖方面的应用卵黄抗体除了对以上陆生动物疾病诊断、预防、治疗方面的应用外，对于水生生物，特别是水产养殖方面也具有重要的作用。在水产动物，GUTIERREZ等1993报道日本鳗鱼通过口服特异性IGY,可降低死亡率,
14、清除肠道病原菌,从而减少对肝和肾的侵害5。在水产养殖方面，白斑综合症是当前全球对虾养殖业所面临的危害性最大、影响范围最广的病害之一,并成为目前制约养虾业发展的主要瓶颈之一。目前,在畜禽生产中已经成功运用口服抗特定病原微生物的卵黄抗体来防治动物肠道微生物的感染。但未见用抗WSSV白斑综合症病毒的卵黄抗体来防治对虾白斑综合症。闫东春21等曾报道，轮虫细胞膜可与白斑综合症病毒特异性结合，为探讨WSSV的治疗方法提供的一定依据。雷勇等以螯虾为动物模型,制备了可大规模生产的抗WSSV卵黄抗体制剂,并在螯虾上作应用效果试验,证实饲料中02的IGY含量具有良好的保护作用,为WSS的预防与治疗提供了一种全新的
15、思路,并为WSSV卵黄抗体的开发应用提供关键的实验数据和理论依据，预计该种口服卵黄抗体在螯虾养殖中将会发挥越来越重要的作用11。此外，作为主要水产养殖品种的中华鳖也面临着一些疾病的困扰。其中以嗜水气单胞菌引起的中华鳖出血性败血症尤为严重。SZILVIAL等22针对支原体16SRRNA基因的特异PCR进行探针检测，基于16SRRNA基因的部分序列的分析可知，华丽闭壳龟内的支原体似乎与最近描述东部箱龟中的支原体相同。李肖梁等利用含有抗嗜水气单胞菌鸡卵黄免疫球蛋白IGY的添加剂饲喂中华鳖,观察其对中华鳖生长和免疫功能的影响15。通过攻毒试验表明,特异性IGY抗体的饲料添加剂对该病具有较好的预防作用,
16、与对照组和饲喂非特异性IGY抗体组相比,死亡率可降低808和792,肾脏中细菌总数也明显减少。这种通过被动免疫的途径为该菌引起的动物疾病预防和控制提供了科学依据。据报道,嗜水气单胞菌亦可引起软体动物、鱼类、两栖类、鸟类及哺乳类等多种动物的全身性败血症或局部感染,常致动物大量死亡16,尤其是人工密集养殖和水温较高的条件下最为常发,该病的安全防治现已成为规模化人工养殖场的主要目标之一。口服卵黄抗体的出现将为该菌带来的疾病提供更多的救治机会，减少了养殖场的经济损失。由此可见，卵黄抗体已在水产养殖方面发挥了不可替代的作用，它的高效与安全已逐渐取代了原有的药物治疗，作为一种绿色的新型添加剂，其作用不可估
17、量。6小结卵黄抗体作为替代抗生素的新型饲料添加剂正在引起人们的关注,卵黄抗体取代抗生素用作生长促进剂,不会产生药物残留,是一种安全的绿色添加剂。生产技术较为成熟用鸡卵黄大量生产、制备多克隆抗体是近年来抗体制备技术中新兴的研究领域。另外卵黄抗体产量高,价格低廉。使用卵黄抗体技术生产免疫球蛋白,可以减少对动物的应激,提高动物的福利。综上所述，卵黄抗体作为抗体家族的重要成员，较哺乳动物抗体有独特优势，因而具有广阔的开发前景。然而目前卵黄抗体在诸多方面存在问题，如没有统一的标准和成熟的方法；保存及运输问题；卵黄抗体中含有大量蛋白质、磷脂等大分子物质,注入机体后,可能出现过敏反应；可能会干扰常规免疫；若
18、在卵黄抗体生产过程中感染病原微生物,对产品又未进行无菌检验、外源病菌检验,这样的产品用于动物后,必将给动物带来感染各种疾病的机会,尤其是垂直传播疾病。这些问题,在一定程度上影响了卵黄抗体的开发和应用3。今后应尽快制订该类产品质量标准,进一步改善产品性状,提高产品质量,以使它在更多领域发挥更大的作用。参考文献1杨菲菲卵黄抗体研究进展及应用J现代农业科技，2008，（20）2312322王金洛，徐福州卵黄抗体研究进展J农业新技术，2003，（06）36383张心如，杜干英卵黄抗体的应用与问题J四川畜牧兽医，1996，（01）51524陈连颐卵黄抗体的特性、应用及开发前景J中国禽业导刊，2007，2
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