1、毕业论文文献综述生物技术绿色荧光蛋白在分子生物学研究中的应用摘要绿色荧光蛋白GREENFLUORESCENTPROTEIN，GFP基因一种能发出绿色荧光的新型报告基因，它在蓝光或长紫外光的激发下，不需要任何反应底物及其他辅助因子就能自发地形成绿色荧光，并且能在在细胞内稳定表达。GFP对受体细胞无毒性，对目的基因没有影响，可以很方便的对活体进行观察，来检测基因的表达。因此，GFP已经成为生命科学领域中研究得最广泛的蛋白质之一。本文就GFP在分子生物学中的应用作简要阐述。关键词绿色荧光蛋白；标记；载体引言在研究基因的表达调控、信号转导、蛋白运输与定位时常用荧光物质或报告基因作为标记。分泌型胎盘磷酸
2、酯酶SECRETEDEMBRYOALKALINEPHOSPHATASE，SEAP基因、半乳糖苷酶GALACTOSIDASE基因、荧火虫荧光素酶LUCIFERASE，LUC基因是目前常用的一些报告基因，但是它们需要底物和辅助因子，否则不能用于检测，因而在活体中无法更好地应用1。绿色荧光蛋白GREENFLUORESCENTPROTEIN，GFP是近年发展起来的一种新型的报告基因，它能自发地发出绿色荧光，荧光反应也不是酶反应，因此受到了广泛的关注2。作为报告基因，GFP不需要任何外源性底物和辅助因子，无毒、稳定、无污染，而且可以在紫外或蓝光激发下直接观察3。因此，GFP在分子生物学研究中有广阔的应用
3、前景，本文就其在分子生物学的应用做一简要综述。1绿色荧光蛋白概述11绿色荧光蛋白的性质在水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内存在一类生物发光蛋白绿色荧光蛋白GREENFLUORESCENTPROTEIN，GFP4。它在紫外或蓝色波长范围的光线激发下，依靠钙离子的帮助能够发出绿色荧光，并在活细胞内稳定表达。GFP的分子量为27KD，由238个氨基酸构成，由11个片层组成桶状构成疏水中心，第6567位氨基酸SERTYRGLY形成发光团，是主要发光的位置。发光的过程中还需要冷光蛋白AEQUORIN的帮助，且这个冷光蛋白与钙离子可产生交互作用，由此产生绿色荧光5。它在395NM处具有最大吸收高峰，在475N
4、M处还有一个肩峰6。12绿色荧光蛋白的优点作为一种新型的标记分子，GFP具有诸多优点而备受关注1便于检测无需底物和辅助因子提供能源，可被光直接激发；2荧光特性稳定对高温60、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂等大多具有较强抗性，对光漂白有较强的耐受性，3对细胞或组织无毒害GFP与目的基因融合后对目的基因的表达没有多大的影响，也不会损害宿主细胞；4通用性和共用性GFP的表达不受宿主范围的限制，也没有细胞种类和部位的限制；5分子量小，便于构建载体与其他序列一起构建载体之后不至于使载体过大影响转化频率；6可进行活细胞定时定位观察能够在细胞和生物体内对目标基因的表达产物进行实时示踪，对高等动物或植物进行转基因
5、标记和体内观察；7不受假阳性干扰，灵敏度高其他生物本身不含有GFP，不会出现假阳性结果，比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分辨率；8易于得到突变体可通过不同的方法得到GFP的突变体，如荧光强度增加或者颜色改变等；9能制成永久标本光漂白和福尔马林的固定都不容易破坏GFP的荧光，利用这个特点可以制成标本用于长期保存711。2绿色荧光蛋白在分子生物学中的应用21用于构建基因工程的表达载体因为GFP的生物发光无种属组织特异性，所以人们可根据自己的实验目的在不同表达系统中能随意构建表达GFP的表达载体12。陆惠萍等利用绿色荧光蛋白基因GFPS65T构建载体并使其在大肠杆菌中高效表达13。沈关心等构建了
6、WEE1HU与GFP融合基因表达载体，并对其在真核细胞的表达及生物学效应进行研究14。SUMMERS等用GFP作为报告基因构建两种转录型的穿梭报告载体并用于丝状蓝藻的研究15。GUPTA等利用GFP构建载体并使其在大肠杆菌重组突变体中的过量表达16。程克棣等构建了能在大肠杆菌中表达融合蛋白的通用表达载体PHISEGFP，并建立了离子交换层析和亲和层析两步纯化融合蛋白的方法17。孙丽萍等构建了人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体并转染HEK293T细胞，为进一步深入探索NOD2启动子的始动原因及调控机制奠定基础18。姜伯乐等将增强型绿色荧光蛋白基因编码序列克隆到不含启动子的载体PLAFR6
7、上，构建报告质粒PLZY，为研究目的基因在不同宿主中的表达和研究植物病原细菌型效应物蛋白的植物亚细胞定位提供了材料19。何淑雅等将携带人脆性X相关基因1（FRAGILEXRELATEDGENEL，FXR1）与EGFP的融合并构建表达载体，为研究FXR1基因在脆性X综合征中的作用机制奠定基础20。张鲲等构建了大肠杆菌双顺反子表达载体，并中研究绿色荧光蛋白的表达水平21。唐金宝等利用增强型绿色荧光蛋白基因作筛选标记构建克隆载体22。22作为报告基因用于转基因研究GFP作为报告基因可用来检测转基因效率，把GFP基因连接到目的基因的启动子之后，通过测定GFP的荧光强度就可以对该基因的表达水平进行检测。
8、GFP作为一种标记蛋白也可以完全替代抗生素或除草剂以筛选转基因组织。SHEEN报道，通过电击ELECTROPORATION转染玉米叶肉原生质体，有50原生质体观察到GFP荧光23。黄国存等将GFP作报告基因，将外源基因导入棉花，能够快速地对转化子进行活体筛选鉴定24。HU报道，用电击法和PEG法同时转化玉米和拟南芥菜ARABIDO原生质体，GFP在玉米原生质体中表达25。程在全等用GFP作报告基因用基因枪法转化水稻愈伤组织，在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白基因的表达26。黄乐天等通过冻融法将含有GFP基因的重组表达载体转入到根癌农杆菌中，再利用根癌农杆菌介导的方法将GFP基因导入到胡萝卜愈伤组
9、织细胞中，经过除菌和抗性筛选后在荧光显微镜观测到被转化的愈伤组织在受蓝光激发后发出绿色荧光，证明GFP基因在胡萝卜愈伤组织细胞中获得了表达27。23蛋白融合将蛋白质的N端或C端与GFP融合之后仍能保持其天然蛋白的特性，因此GFP可作为一种“荧光标签”用来研究蛋白质在细胞中的定位、转移、相互作用等。BAULCOMBE等将马铃薯X病毒和融合蛋白载体PVXGFP接种菸草NCLEVELANDII12D后，在紫外光下可以直接观察到病毒侵染的确切部位28。KHLER等用拟南芥叶绿体蛋白的RECA序列连接GFP，结果表明GFP标记的RECA序列存在于叶绿体的基质中29。25研究病原物与宿主之间的相互作用将病
10、原体用GFP活体标记，可以在全真条件而不是模拟条件下实时研究病原体与宿主的关系。郝敏等利用GFP所发出的绿色荧光，来追踪白叶枯细菌侵染水稻的路径，以及检测水稻在遭受白叶枯病害时的一些生理生态变化30。EPEL等将GFP基因与烟草花叶病毒运动蛋白基因在烟草花叶病毒中融合表达，观察到病毒运动蛋白与宿主细胞肌动蛋白的结合，表明是病毒与植物组分间的相互作用促进了病毒在植物体内的局部传播31。陆勇军等将高量表达绿色荧光蛋白基因的自发突变质粒转化至嗜肺军团菌，以转化菌饲喂嗜热四膜虫BF1株后，在荧光显微镜下能清楚观察到细菌在细胞内的形态变化、增殖和裂解宿主细胞的过程，这为研究嗜肺军团菌与原生动物寄主的相互
11、关系提供了一种简单而直观的方法32。展望虽然GFP在分子生物学的众多研究领域有着广泛的应用，但目前看来仍有其不足，GFP的检测灵敏度还不够高，有待进一步改进，天然的GFP形成具有活性的形式这个过程十分缓慢，需要通过折叠和加工，某些GFP不能耐受紫外光的漂白和破坏作用，虽然自发的荧光现象还十分微弱，但也存在于许多物种之中，这些都会使GFP的检测受到不同程度的干扰。但随着生物技术的发展，对GFP的不断改进和理论研究的进一步深入，我们有理由相信，GFP一定会给我们带来更多的应用价值，并进一步揭开生命的未解之谜。参考文献1张敏,任慧霞报告基因的应用研究进展J食品与药品,2007,9945482杨英军,
12、周鹏转基因植物中的标记基因研究新进展J遗传,2005,2734995043杨慧敏,李文刚,吴高锋,等绿色荧光蛋白的研究进展J中国畜牧兽医生理生化,2008,35829324唐孝青,李斌,伍小兵,等绿色荧光蛋白及其应用的研究进展J陕西农业科学,2007,11231245段青,王倩,祁庆生绿色荧光蛋白在蛋白质研究中的应用J生命的化学,2007,27148516余林辉,姚伟,段真珍,等绿色荧光蛋白及其在农作物研究中的应用J安徽农业科学,2008,36361578815790,158017汪恒英,周守标,常志州,等绿色荧光蛋白GFP研究进展J生物技术,2004,14370738吴瑞,张树珍绿色荧光蛋白
13、及其在植物分子生物学中的应用J分子植物育种,2005,322402449ALKAABIKM,YAFEAA,ASHRAFSSEFFECTOFPHONTHERMALANDCHEMICALINDUCEDDENATURATIONOFGFPJAPPLIEDBIOCHEMISTRYANDBIOTECHNOLOGY,2005,126214915610MAREKH,SLAVOMR,VLADISLAVCGREENFLUORESCENTPROTEINASAVITALMARKERFORNONDESTRUCTIVEDETECTIONOFTRANSFORMATIONEVENTSINTRANSGENICPLANTSJPL
14、ANTCELLTISSUEANDORGANCULTURE,2006,86330331811刘艳丽,鲁澄宇绿色荧光蛋白的特性及其在药学研究中的应用J药物生物技术,2009,16217017412杨健,任碧轩,唐恩洁绿色荧光蛋白表达质粒的构建及鉴定J川北医学院学报,2005,6212312513陆惠萍,周凤娟,孙树汉绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的克隆及高效表达J第二军医大学学报,1997,18540640814沈关心,周华荣,张晓晖,等绿色荧光蛋白与WEE1HU融合基因的构建及其真核表达J中国生物化学与分子生物学报,2001,17671571915ARGUETAC,YUKSEKK,SUMMERSMCO
15、NSTRUCTIONANDUSEOFGFPREPORTERVECTORSFORANALYSISOFCELLTYPESPECIFICGENEEXPRESSIONINNOSTOCPUNCTIFORMEJJOURNALOFMICROBIOLOGICALMETHODS,2004,5918118816JAINS,TEOTIAS,GUPTAMNPURIFICATIONOFGREENFLUORESCENTPROTEINOVEREXPRESSEDBYAMUTANTRECOMBINANTESCHERICHIACOLIJPROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION,2004,36768117程
16、克棣,王伟,孟超,等绿色荧光蛋白标记的表达载体PHISEGFP的构建J中国生物工程杂志,2005,259353918孙丽萍,胡巢凤,周羽竝人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建J现代免疫学,2008,28321922319姜伯乐,赵宇,刘建元,等含有增强型绿色荧光蛋白报告子的载体系统的构建J广西农业生物科学,2008,27434334820何淑雅,马云,杨阳,等FXR1基因与增强型绿色荧光蛋白融合载体的构建及表达J现代生物医学进展,2009,71265126721张鲲,马媛媛,邹少兰大肠杆菌双顺反子表达载体中绿色荧光蛋白表达水平的研究J生物技术通报,2009,5606322唐金宝,陈
17、永,梁淑娟,等利用增强型绿色荧光蛋白基因作筛选标记克隆载体的构建及鉴定J中国海洋药物杂志,2009,282283123SHEENJ,HWANGS,NIWAY,ETALGALBRAITHDWGREENFLUORESCENTPROTEINASANEWVITALMARKERINPLANTCELLSJTHEPLANTJOURNAL,1995,5877778424黄国存,张寒霜,高鹏,李俊兰,朱生伟,孙敬三GFP基因在棉花转化中的应用J2001,23213113425HUW,CHENGCLEXPRESSIONOFAEQUOREAGREENFLUORESCENTPROTEININPLANTCELLSJFE
18、BSLETTERS,1995,36933133426程在全,丁玉梅,曾黎琼,等绿色荧光蛋白基因作为报告基因在水稻基因转化中的应用研究J云南植物研究,2002,24334135127黄乐天,蒋琳兰,宋进锋绿色荧光蛋白基因导入胡萝卜愈伤组织并获得表达J生物技术,2006,162182128BAULCOMBEDC,CHAPMANS,CRUZSSJELLYFISHGREENFLUORESCENTPROTEINASAREPORTERFORVIRUSINFECTIONSJTHEPLANTJOURNAL,1995,71045105329KHLERRH,CAOJ,ZIPFELWR,ETALEXCHANGEOF
19、PROTEINMOLECULESTHROUGHCONNECTIONSBETWEENHIGHERPLANTPLASTIDSJSCIENCE,1997,2762039204230郝敏,邢达,谢波,等含有绿色荧光蛋白基因的质粒载体的构建及其在水稻白叶枯细菌中的表达J激光生物学报,2002,11642743031EPELBL,PADGETTHSPLANTVIRUSMOVEMENTPROTEINDYNAMICSPROBEDWITHAGFPPROTEINFUSIONJGENE,1996,173757932陆勇军,黄绍松,徐润林用绿色荧光蛋白研究军团菌与寄主的相互关系J微生物学通报,2006,3322124
