1、本科毕业设计（20_届）RTLAMP技术检测烟草环斑病毒的研究所在学院专业班级食品质量与安全学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言错误未定义书签。2正文主体121供试材料122引物设计123烟草环斑病毒的RTLAMP扩增2231总RNA提取2232RTLAMP扩增2233RTLAMP结果分析224RTLAMP的检测反应温度优化试验225RTLAMP的检测反应时间优化试验226RTLAMP的特异性试验227RTLAMP的灵敏度试验228烟草环斑病毒RTPCR检测方法的建立229烟草环斑病毒的RTLAMP扩增产物的结果鉴定方法研究2210大豆样品中的TRSV的RTLAMP快读检测23结果与
2、分析331实验结果3311RTLAMP的检测反应温度优化试验结果3312RTLAMP的检测反应时间优化试验结果3313烟草换班病毒的RTLAMP特异性扩增结果3314RTLAMP检测灵敏度试验4315扩增产物的结果鉴定方法研究4316大豆样品中TRSV的RTLAMP快速检测结果532讨论54小结6致谢7参考文献8附录9摘要为了提高TRSV检测的准确性及检测效率，缩短检测时间，降低检测成本，本研究建立了一种快速、简便的RTLAMP检测烟草环斑病毒的方法。首先，合成本研究设计的引物，配制扩增混合体系，同时设置一个空白对照和一个阳性对照；然后，在60水浴锅中恒温扩增60MIN；最后，采用琼脂糖凝胶电
3、泳或SYBRGREENI染色的方法判断扩增结果，若有瀑布状条带出现或者溶液呈黄绿色，表示在样品中检测出了目标病毒，没有出现瀑布状条带或者溶液呈橘红色，则表示没有检测出目标病毒。采用本研究建立的RTLAMP方法对大豆TRSV阳性样品进行检测，并用荧光染料SYBRGREENI法观察，结果显示，阳性样品均显示明显的绿色。关键词烟草环斑病毒；环介导等温扩增；检测。ABSTRACTABSTRACTINORDERTOIMPROVINGTHEACCURACYANDTHEEFFICIENCYOFDETECTINGTRSV,SHORTENTHEDETECTIONTIME,REDUCINGTHEDETECTION
4、COST,THESTUDYESTABLISHEDARAPIDANDSIMPLETRSVDETECTIONMETHODSUSINGLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONLAMPFIRSTCOMPOUNDPRIMERSTHATHAVEBEENDEVISEDINTHISSTUDY,PREPAREMIXSYSTEMFORAMPLIFICATION,SETAQAPCROSSREFERENCEANDAPOSITIVECROSSREFERENCETHENAMPLIFYIN60WATERBATHPOTFOR60MINATLASTAGAROSEGELELECTROPHORESIS
5、ORSYBRGREENIDYINGAREUSEDTODETERMINETHEAMPLIFICATIONRESULT,IFWATERFALLSTRIPEORKELLYSOLUTIONAPPEARS,THATMEANSTHEPOSITIVEABOUTTARQETVIRUS,IFNOWATERFALLSTRIPEAPPEARSORTANGERINESOLUTION,THATMEANSTHENEQATIVEABOUTTARQETVIRUSUSINGTHISMETHODSTODETECTTHETRSVPOSITIVESAMPLEANDTHEFLUORESCENTDYESYBRGREENIWEREUSED
6、TOOBSERVETHERESULT,ITSHOWSTHATPOSITIVESAMPLESSHOWOBVIOUSGREEN。KEYWORDSTOBACCORINGSPOTVIRUSTRSVLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONLAMPDETECTION。11引言烟草环斑病毒（TOBACCORINGSPOTVIRUS，TRSV）隶属豇豆花叶病毒科（COMOVIRIDAE）线虫传多面体病毒属（NEPOVIRUS），是中国进境检疫法规中明确规定禁止入境的危害性有害生物。该病毒寄主范围广，可侵染52科246种植物，是果树、蔬菜、花卉等经济作物的重要病害之一，发生严重时可
7、导致绝产。中国进口的植物种球茎和苗木中携带该病毒的风险很大1。目前，国内外针对用RTPCR和ICRTPCR技术检测植物病毒的研究已有不少35。TRSV所用的检测技术主要有DASELISA2、RTPCR技术和ICRTPCR技术6等。相比传统的电镜观察和生物学鉴定，这3种方法在检测周期方面具有明显的优势，操作简单方便。但是对设备和人员技术能力的要求较高。环介导等温扩增技术（LAMPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATION,LAMP）作为一种新的核酸扩增方法，具有检测速度快、操作简单和灵敏度高等优点。该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增的
8、BSTDNA酶，在等温条件下可高效、快速和特异地扩增靶序列7,8,9,10。目前，LAMP技术被广泛应用于植物病毒如番茄不孕病毒101、红薯花叶病毒12、动物病毒如对虾白斑综合征病毒13、牙鲆弹状病毒14、细菌如假结核耶尔森菌15、沙门菌16，牛瑟氏泰勒虫17等的检测。本文针对烟草环斑病毒的RTLAMP检测方法的建立进行了研究报道。首先，根据GENBANK（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV）中已登录的烟草环斑病毒的外壳蛋白基因序列L09205，在序列的保守区，设计得到F3、B3、FIP（F1CTTTTF2）、BIP（B1CTTTTB2）、LOOP1和LOOP2共6条引物。合成设计的引
9、物之后，根据查阅到的文献配制扩增混合体系，同时每个实验设置一个空白对照和一个阳性对照。然后，用设计的引物，在58、60、63和65四个温度条件下进行反应温度优化试验，在30MIN、60MIN和90MIN三个时间条件下做反应时间优化试验，用烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、香石竹环斑病毒、黄瓜绿斑驳病毒、南芥菜花叶病毒以及马铃薯V病毒等多种植物病毒RNA为模板进行引物特异性试验，与RTPCR对比做引物灵敏度试验，以确定本方法的最佳反应条件和本研究设计的引物的可行性。最后，采用琼脂糖凝胶电泳或SYBRGREENI染色的方法判断扩增结果。2材料与方法21供试材料含有TRSV的阳性样品物质购自美国AGDIA
10、公司，样品状态为新鲜叶片经液氮处理，磨成粉末状，冷藏于4冰箱保存。含有TRSV的大豆样品由本实验室从美国进境大豆中截获，经DASELISA和普通RTPCR检测确认为阳性。番茄环斑病毒（TOMATORINGSPOTVIRUS，TORSV）、香石竹环斑病毒（CARNATIONRINGSPOTVIRUS，CRSV）、黄瓜绿斑驳病毒（CUCUMBERGREENMOTTLEMOSAICVIRUS，CGMMV）、南芥菜花叶病毒（ARABISMOSAICVIRUS，ARMV）、马铃薯V病毒（POTATOVIRUSV，PVV）等阳性标准物质也都购自美国AGDIA公司。RTLAMP引物由上海英骏生物技术公司合成
11、。核酸提取试剂TRIZOL购自上海生物工程公司。RTLAMP扩增试剂盒由本实验室研制。ONESTEPRNAPCRKIT与DL2000MARKER购自大连TAKARA公司。22引物设计引物序列见表1，根据GENBANK（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV）中已登录的烟草环斑病毒的外壳蛋白基因序列L09205，采用BLAST程序进行同源性比较，在序列的保守区，使用PRIMEREXPRESS30软件，设计得到F3、B3、FIP（F1CTTTTF2）、BIP（B1CTTTTB2）、LOOP1和LOOP2共6条引物，分别识别外壳蛋白编码基因的8个位点。2表1RTLAMP检测烟草环斑病毒的引物TA
12、B1THERTLAMPPRIMERSFORIDENTIFICATIONOFTRSV引物PRIMERS序列SEQUENCE来源SOURCEF35CCAGCCCACGTTGTACTTT3L09205/AF461163/AY363727/U50869B35TTGATGGGTCAACTTCCAT3LOOP15TTGGCAGTGTATTGTTACCATGC3LOOP25ATTCAATTGGGTGATACTTTCGC3FIP5ACATGGGGCCCGTCATTGATTTTTTCCACAAATCAAGTAACGATGGC3BIP5GAGTTAAATAATCCAACTATGACGTGGCTTTTCATTGAT
13、AGATATTATGAGGCGAAAGA323烟草环斑病毒的RTLAMP扩增231总RNA提取采用TRIZOL试剂方法提取7。232RTLAMP扩增反应体系2ULAMPMIX10L，引物F3和B3的终浓度各为02M，LOOP1和LOOP2的终浓度各为08M，FIP和BIP的终浓度各为16M，BSTDNA聚合酶（5U/L）15L，AMVRNA聚合酶（5U/L）1L，模板RNA1L，用DDH2O补充至总体积20L。反应条件如下在恒温60的水浴锅中扩增1H。233RTLAMP结果分析反应结束后，取10L扩增产物进行20琼脂糖凝胶电泳，在GELDOC2000（BIORAD）凝胶成像系统上观察并记录结果
14、。24RTLAMP的检测反应温度优化试验以烟草环斑病毒RNA为模板，按照建立的RTLAMP检测方法，分别在58、60、63和65四个温度条件下进行扩增，反应时间为1H。每个温度条件设置二个RNA样品重复，一个空白对照。25RTLAMP的检测反应时间优化试验以烟草环斑病毒RNA为模板，按照建立的RTLAMP检测方法，分别在30MIN、60MIN和90MIN三个时间条件下进行扩增，反应温度为60。每个时间条件设置二个RNA样品重复，一个空白对照。26RTLAMP的特异性试验以烟草环斑病毒、番茄环斑病毒、香石竹环斑病毒、黄瓜绿斑驳病毒、南芥菜花叶病毒以及马铃薯V病毒等多种植物病毒RNA为模板，按照建
15、立的烟草环斑病毒RTLAMP检测方法，进行特异性研究。其中，烟草环斑病毒设置二个RNA样品重复，其余病毒设置一个RNA样品，并设置一个空白对照。27RTLAMP的检测灵敏度试验将提取好的烟草环斑病毒RNA模板进行10倍系列稀释，得到101、102、103、104和105稀释的病毒RNA样品。采用建立的RTLAMP和RTPCR方法进行扩增灵敏度比对试验。28烟草环斑病毒RTPCR检测方法的建立RTPCR反应体系参照ONESTEPRNAPCRKIT试剂盒说明进行，其中引物为F3和B3。反应条件如下50CDNA合成30MIN，94预变性2MIN；94变性30S，58复性30S，72延伸1MIN，35
16、个循环；最后72延伸5MIN。29烟草环斑病毒的RTLAMP扩增产物的结果鉴定方法研究将灵敏度实验中的RTLAMP扩增产物，用凝胶电泳法观察扩增结果；取5L扩增产物，直接加入01L的荧光染料SYBRGREENI，观察颜色变化。210大豆样品中TRSV的RTLAMP快速检测取已用DASELISA和普通RTPCR检测呈TRSV阳性的进境美国大豆样品，采用本研究建立的RTLAMP方法进行扩增检测，结果采用SYBRGREENI染色观察。33结果与分析31实验结果311RTLAMP的检测反应温度优化试验结果在相同反应时间，本实验设计的烟草环斑病毒的引物在58、60和63均出现可见条带，65没有出现条带。
17、在60条件下的扩增条带清晰明亮，63条带模糊不清晰（图1），由此，确定60为最佳反应温度。图1RTLAMP扩增烟草环斑病毒反应温度优化试验结果FIG1TEMPERATUREOPTIMIZATIONRESULTSOFRTLAMPFORTRSV注,MDL2000分子量标准1358466079631012651,2,4,5,7,8,10,11TRSVRNA3,6,9,12空白对照。NOTEMDL2000MARKER1358466079631012651,2,4,5,7,8,10,11TRSVRNA3,6,9,12NEGATIVECONTROL312RTLAMP的检测反应时间优化试验结果在60时，本实
18、验设计的烟草环斑病毒的引物在60MIN和90MIN均出现明显的条带，30MIN条件下没有出现扩增条带（图2），且60MIN和90MIN的条带在亮度和清晰度方面没有显著差异，故确定60MIN为最佳反应时间。图2RTLAMP扩增烟草环斑病毒反应时间优化试验结果FIG2TIMEOPTIMIZATIONRESULTSOFRTLAMPFORTRSV注,MDL2000分子量标准1330MIN4660MIN7990MIN1,2,4,5,7,8TRSVRNA3,6,9空白对照。NOTEMDL2000MARKER1330MIN4660MIN7990MIN1,2,4,5,7,8TRSVRNA3,6,9NEGATI
19、VECONTROL313烟草环斑病毒的RTLAMP特异性扩增结果烟草环斑病毒的阳性标准物质经过RTLAMP扩增后，能够得到特异性的瀑布状条带，而其它病毒毒株的RNA模板则无扩增条带出现，空白对照中无特异性基因条带（图3）。这表明本研究设计的6条引物针对TRSV的检测具有非常好的特异性。4图3RTLAMP特异性扩增烟草环斑病毒结果FIG3RESULTSOFRTLAMPSPECIFICAMPLIFICATIONOFTRSV注,MDL2000分子量标准1,2TRSVRNA3TORSVRNA4CRSVRNA5CGMVRNA6ARMVRNA7PVVRNA8空白对照。NOTEMDL2000MARKER1,
20、2TRSVRNA3TORSVRNA4CRSVRNA5CGMVRNA6ARMVRNA7PVVRNA8NEGATIVECONTROL314RTLAMP检测灵敏度试验不同稀释梯度的烟草环斑病毒RNA经过RTLAMP扩增后，其检测灵敏度为103病毒稀释液，比普通RTPCR扩增灵敏度高出10倍（图4）。图4RTLAMPANDRTPCR检测烟草环斑病毒的灵敏度结果FIG4THESENSITIVITYRESULTSOFRTLAMPANDRTPCRFORTRSVAMPLIFICATION注,MDL2000分子量标准16RTLAMP扩增灵敏度712RTPCR扩增灵敏度1,7101稀释液2,8102稀释液3,91
21、03稀释液4,10104稀释液5,11105稀释液6,12空白对照。NOTEMDL2000MATKER16RTLAMPAMPLIFICATIONSENSITIVITY712RTPCRAMPLIFICATIONSENSITIVITY1,6101DILUTION2,8102DILUTION3,9103DILUTION4,10104DILUTION5,11105DILUTION6,12NEGATIVECONTROL315扩增产物的结果鉴定方法研究本研究利用沉淀法和染色法对LAMP产物进行了检测。LAMP沉淀较少，肉眼较难分辨沉淀的有无；LAMP产物中加入SYBRGREENI染色剂，对照颜色呈橙红色，
22、而有扩增产物则呈绿色（图5A）。在紫外灯下观察，空白对照和无RTLAMP产物的样品管均没有发出白色荧光，而有RTLAMP扩增产物的样品管则发出白色荧光，且白色荧光的亮度与RNA模板浓度的高低成正比（图5B）。RTLAMP扩增产物，用凝胶电泳法观察结果和用荧光染料SYBRGREENI观察的结果一致。A肉眼观察OBSERVATIONWITHNAKEDEYES5B紫外观察OBSERVATIONWITHULTRAVIOLETLIGHT图5荧光染料SYBRGREENI处理RTLAMP产物的观察结果FIG5THERESULTSOFRTLAMPPRODUCTSTREATEDWITHSYBRGREENI注,A
23、肉眼观察；B紫外观察。1101稀释液2102稀释液3103稀释液4104稀释液5105稀释液6空白对照。NOTEA、OBSERVATIONWITHNAKEDEYESBOBSERVATIONWITHULTRAVIOLETLIGHT1101DILUTION2102DILUTION3103DILUTION4104DILUTION5105DILUTION6NEGATIVECONTROL316大豆样品中TRSV的RTLAMP快速检测结果采用本研究建立的RTLAMP方法对大豆TRSV阳性样品进行检测，并用荧光染料SYBRGREENI法观察，结果显示，阳性样品均显示明显的绿色。图6RTLAMP检测大豆样品中
24、TRSV的结果FIG6RESULTSOFRTLAMPDETECTIONFORSOYBEANINFECTEDWITHTRSV注,1,2TRSV阳性大豆3TRSV阴性大豆4空白对照。NOTE1,2SOYBEANWITHTRSV3HEALTHYSOYBEAN4NEGATIVECONTROL32讨论自环介导等温扩增技术建立以来，该方法已被逐渐应用于细菌、病毒和寄生虫等的检测。2008年，黄帆等利用LAMP技术在几种常见的致病分支杆菌中检测结合分支杆菌，结果表明，LAMP技术能在恒温（63）条件下，1H内检测出结核分枝杆菌，且特异性明显18。兰青阔等研究LAMP在检测转基因抗草甘膦大豆CP4EPSPS基
25、因上的应用，结果显示，LAMP方法能购特异性检测CP4EPSPS基因，检测灵敏度是常规定性PCR方法的10倍19。2009年，夏永恒等建立的LAMP方法检测2种鸡免疫抑制性疾病，结果表明，LAMP检测法的灵敏度比PCR高10倍，检测的阳性率要比PCR高20。鲁勇等建立了LAMP快速检测沙门氏菌INVA基因的方法，结果显示LAMP的检测限达到102CFU/ML21。2010年，谢青梅等用RTLAMP技术检测H5亚型禽流感病毒，扩增后产物加入核酸染色剂SYBYGREEN和4MMOL/LMG2，结果可视，检测结果与RTPCR方法一致，且整个过程只需12H22。POON等采用PCR和LAMP来扩增甲型
26、流感病毒的RNA，结果表明，LAMP的灵敏度比PCR的高出10倍，而且，LAMP分析法的试验结果与病毒学诊断完全一致23；PARIDA等采用RTLAMP分析法和RTPCR分析法测定西尼罗病毒RNA，RTLAMP的反应条件为63的恒温条件下反应60MIN，并且其反应全程用同步比浊仪跟踪监视，检验结果显示RTLAMP的灵敏度高于RTPCR，且RTLAMP得出的结果较RTPCR更接近于病毒分析得出的结果8。大量研究证明，LAMP技术是一种快速、灵敏度高、特异性好、结果判断方便的分子生物学检测方法。6本研究建立了检测TRSV的RTLAMP方法。为该方法在TRSV快速检验中的开发应用奠定基础。该方法反应
27、速度快。本研究采用一种具有解旋功能且呈瀑布式扩增的BSTDNA聚合酶，呈恒温扩增，没有反转录步骤，也不需要PCR仪升降温的时间，所以扩增时间非常短，扩增效率非常高；该方法灵敏度高。本研究结果表明，RTLAMP方法敏感性比RTLAMP方法强，其灵敏度是RTPCR的10倍。该方法特异性高。RTLAMP技术的关键是针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，当引物完全识别靶序列结合区并皮配的情况下才能顺利进行，这一点现实了该技术的高度特异性；该方法产物检测便捷。反应结果可以用肉眼直接判断，根据反应体系中是否形成白色沉淀或染色反应体系是否出现变色现象来定性判断RTLAMP结果；该方法设备简单，操作简便。RT
28、LAMP反应只需要一个简单的恒温水浴锅，不需要昂贵的PCR仪，操作简易，易于在基层推广应用。本研究使RTLAMP技术用于TRSV的检测成为了可能，具有很高的使用价值。近年来，有学者发现LAMP扩增反应所需要的BST聚合酶比TAQ聚合酶有更高的耐受性24，对与DNA和RNA的检测来说，核酸抽提步骤或省略，也能达到检测的目的，这是一个很闪光的优点22。但是，LAMP的产物是复杂的茎环结构，较难分离出单链DNA。最后，LAMP法只有两种结果扩增和不扩增，扩增与否只是通过扩增产物的有无来判断，一旦发生非特异性扩增，则很难鉴别25。LAMP技术有简单、对操作人员和设备要求低、费时少、结果读取直观等优点，
29、目前已有部分商品化试剂盒供应，用于一些难培养、常规检测易漏检的病原体的检测26。同时，国外EIKENGENOMESITEHTTP/WWWEIKENCOJP/EN/INDEXHTML网站已开发出多种动物疾病的LAMP检测试剂盒27。随着方法的不断发展与改进，必将会在分子生物学诊断检测方面发挥重要的作用。4小结1、本研究建立烟草环斑病毒RTLAMP检测方法。首先，合成本研究设计的引物，配制扩增混合体系，同时设置一个空白对照和一个阳性对照；然后，在60水浴锅中恒温扩增60MIN；最后，采用琼脂糖凝胶电泳或SYBRGREENI染色的方法判断扩增结果，若有瀑布状条带出现或者溶液呈黄绿色，表示在样品中检测
30、出了目标病毒，没有出现瀑布状条带或者溶液呈橘红色，则表示没有检测出目标病毒。2、本研究表明，RTLAMP技术在植物病毒快速检测方面具有快速、操作简单、灵敏度高等优点。3、采用本研究建立的RTLAMP方法对大豆TRSV阳性样品进行检测，并用荧光染料SYBRGREENI法观察，结果显示，阳性样品均显示明显的绿色。7参考文献1张仲凯，李毅云南植物病毒M北京科学出版社，200120242JDCASTELLO，ASSISTANTPROFESSOR，ETALDETECTIONOFTOBACCOMOSAICANDTOBACCORINGSPOTVIRUSESINWHITEASHTREESBYENZYMELIN
31、KEDIMMUNOSORBENTASSAYJTHEAMERICANPHYTOPATHOLOGICALSOCIETY，1984，6897877903魏梅生，相宁，张春泉，等菜豆荚斑驳病毒的RTPCR检测J大豆科学，2005，2443173194于翠，杨翠云，宋绍祎，等进口大豆上菜豆荚斑驳病毒的免疫捕获巢式RTPCR检测J植物检疫，2006，2042012045闻伟刚，崔俊霞，赵秀玲，等半巢式RTPCR检测进口大豆中菜豆荚斑驳病毒的研究J植物病理学报，2006，3642963006杨翠云，曹洁，等烟草环斑病毒的RTPCR和ICRTPCR检测方法的研究J上海农业学报，2007，23183877NOT
32、OMIT，OKAYAMAH，MASUBUCHIH，ETALLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONOFDNAJNUCLEICACIDSRESEARCH，2000，2812E638MANMOHANP，GUILLERMOP，SHINGOINOUE，ETALREALTIMEREVERSETRANSCRIPTIONLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONFORRAPIDDETECTIONOFWESTNILEVIRUSJJCLINMICROBIOL，2004，4212572639YASUYOSHIM，MASATAKAK，NORIHIROT，ET
33、ALREALTIMETURBIDIMETRYOFLAMPREACTIONFORQUANTIFYINGTEMPLATEDNAJJBIOCHEMBIOPHYSMETH，2004，59214515710DUKESJP，KINGDP，ALEXANDERSENSNOVELREVERSETRANSCRIPTIONLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONFORRAPIDDETECTIONOFFOOTANDMOUTHDISEASEVIRUSJARCHVIROL，2006，1511093110611刘佳，黄丛林，等环介导等温扩增技术检测菊花中番茄不孕病毒J中国农业科学，2010，4
34、361288129412SFUKUTA，TIIDA，YMIZUKAMI，ETALDETECTIONOFJAPANESEYAMMOSICVIRUSBYRTLAMPJARCHIVESOFVIROLOGY，2003，1481713172013何琳，徐海圣，等白斑综合征病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立J水产学报，2010，34459860314孙颖杰，岳志芹，等牙鲆弹状病毒环介导等温扩增检测方法的建立与应用J华中农业大学学报，2010，29220320715包云娟，朱水荣环介导等温技术在假结核耶尔森菌检测中的应用J微生物检测方法，2010，32055956016王敏雅，徐明汉，等沙门菌INVA基因
35、LAMP快速检测法的建立和初步应用J中国卫生检验杂志，2008，18101971198117王中光，张守发，等牛瑟氏泰勒虫环介导等温扩增检测方法的建立J中国预防兽医学报，2010，32210811118黄帆，李琳，等DNA环介导恒温扩增技术速检测结核分枝杆菌的研究J现代食品科技，2008，24883583819兰青阔，王永，等LAMP在检测转基因抗草甘膦大豆CP4EPSPS基因上的应用J安徽农业科学，2008，624103771037820夏永恒，杨兵，等2种鸡免疫抑制性疾病LAMP检测方法的建立J中国动植物检疫，2009，265293221鲁勇，李红海，等LAMP快速检测沙门菌INVA基因的
36、方法建立于应用J浙江中西医结合杂志，2009，19421621822谢青梅，曹永曹，等H5亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增（RTLAMP）检测技术J中国兽医学报，2010，301414623POONL，LEUNGCS，CHANKH，ETALDETECTIONOFHUMMANINFLUENZAAVIRUSESBYLOOPMEDIATEDISOTHERNALAMPLICATIONJJCLINMCROBIOL，2004，4251956196124KANEKOH，IIDAAOKIK，ETALSWNSITIVEANDRAPIDDETECTIONOFHERPESSIMPLEXVIRUSANDVARICELLAZOSTERVIRUSDNABYLOOPMEDIATEDISOTHERMALAMPLIFICATIONJJCLINMICROBIOL，2005，4333290329625赵飞，邹为民LAMP法在水产动物病原快速检测中的应用J南方水产，2007，32717526甘文佳，胡旭初LAMP技术及其在病原诊断中的应用J中国病原生物学杂志，2010，5214314527刘宝山，潘树德，等环介导等温扩增技术在畜禽疾病诊断中的应用J中国兽医杂志，2009，4596465
