1、本科毕业设计（20_届）不同加工环境温度下枪乌贼微生物总数的变化规律所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1前言152材料与方法1521试验材料1522仪器设备1623药品与试剂1624试验方法17241原料前处理17242方法172421菌落总数测定172422菌种纯化与鉴定173结果与讨论1831不同温度下腐败开始点和腐败终点分析1832冻藏枪乌贼菌相分析19321初始菌相分析19322枪乌贼货架期终点时的菌相组成1933不同加工环境温度下的菌落数量分析204结论26致谢错误未定义书签。参考文献26附录错误未定义书签。摘要微生物作为造成食品腐败变质的主要原因
2、，针对性地加以控制就可有效降低食品腐败率。本文选取了冻藏枪乌贼作为研究材料，对其微生物总数及菌群随暴露时间、温度的变化进行了分析与研究，以期可以有效控制枪乌贼的保藏与利用率。实验模拟了525的加工环境温度下枪乌贼微生物菌相及品质随时间的变化规律，并以此为依据建立了数学模型以快速预测枪乌贼中微生物的生长繁殖。结果表明，在525的温度范围内，枪乌贼到达腐败开始点和腐败终点时的菌落总数对数值的平均值分别为48610103和65090056。且本课题依据测定结果，得到了不同温度下微生物总数对数值与贮藏时间的变化关系曲线。此外，研究还表明希瓦氏菌是造成枪乌贼腐败变质的优势菌群，且温度越低，希瓦氏菌所占比
3、例越高。关键词枪乌贼；温度；菌落总数；菌相ABSTRACTTHEORGANISMWASTHEMAINCAUSEOFTHECORRUPTIONOFFOODTHEREFORE,WESHOULDCONTROLTHECONTENTOFMICROORGANISMPURPOSELYINTHISPAPER,FROZENSQUIDWASSELECTEDASTHERAWMATERIAL,ANDTHETOTALNUMBEROFMICROORGANISMSWITHTHECHANGESOFTIMEANDTEMPERATUREWEREANALYZEDWEMADEASIMULATIONOFTHEAMBIENTTEMPER
4、ATUREINTHERANGEOF525,ANDMEASUREDTHEBACTERIALCOLONIESATAPPROPRIATEINTERVALSBESIDES,THERESULTSWERETAKENASTHEBASISFORMATHEMATICALMODELSTOPREDICTTHEGROWTHANDREPRODUCTIONOFMICROORGANISMSOFSQUIDTHETESTSSHOWEDTHATTHESTARTINGPOINTANDTHEENDINGPOINTOFCORRUPTIONWERE48610103AND65090056INTHERANGEOF525ASSOCIATEDE
5、QUATIONSWEREMADEOUTWHICHSHOWEDTHEMICROORGANISMSWITHTHECHANGEOFTIMEANDTEMPERATUREANDTHEDOMINATEDSPOILAGEORGANISMSWEREIDENTIFIEDASSHEWANELLASPPTHELOWERTHETEMPERATUREWAS,THEGREATERPROPORTIONOFPHASEOFBACTERIAITWOULDTAKEKEYWORDSSQUIDTEMPERATURETHEAMOUNTOFMICROORGANISMBACTERIAPHASE1前言中国枪乌贼地方名本港鱿鱼、中国鱿鱼台湾锁管
6、、拖鱿鱼、长筒鱿是世界枪乌贼科中最重要的经济种,约占世界枪乌贼科总产量的60。泰国中国枪乌贼的年产量约为四万吨；菲律宾次之,约为两万吨；中国居第三位，约为一万五千吨；再以下为越南,约为一万吨；印度尼西亚为六千吨。中国枪乌贼的捕捞业在海洋渔业中占有相当重要的地位。中国枪乌贼除少量鲜销外,主要晒成鱿鱼干远销，成干率约为1012中国枪乌贼肉甜细嫩,质地极佳，在国内外海味品市场上列为一级优质品14。随着人们生活水平的提高以及全民健康意识的加强，人们对食品的要求与日俱增，水产品因其味美和较高的营养价值，越来越受到欢迎，具有较为光明的开发前景。微生物在食品中生长繁殖会导致食品发生腐败变质,失去食用价值。动
7、物性水产品原料与畜产品原料相比,含水量相当高，一般在7080；肌肉蛋白中的基质蛋白较少，肌肉组织脆弱，自溶作用速度快，容易受伤，特别易受微生物的侵染，因而更易于腐败变质59。据统计，生产的食品中每年都有25在收获后因为微生物的作用腐败变质造成损失，这一情况在水产品中更为严重。故防腐保鲜已成为国内外水产鲜品和加工行业中关注的热点。而有关于不同环境温度对冻藏枪乌贼微生物菌群变化的影响,在国内外很少有此方面的研究报导1015。为了适应现实要求，更好地对冻藏枪乌贼采取合适的杀菌技术，更好地保持其原有风味特性，故本课题对不同加工环境温度对冻藏枪乌贼微生物总数变化规律的研究更加显得尤为重要1622。而对于
8、不同环境温度对冻藏枪乌贼微生物菌群的影响，国内外目前没有对此方面的专研究和报导。THERUVATHILKSINI等人研发了适宜淡水鱼野鲮鱼香肠制剂，具有良好的化学和物理特性并能达到商业肉类香肠的标准。薄荷团一起添加其他香料能有效地屏蔽泥泞的不良气味，提高野鲮香肠的适口性。如丁香，肉桂等香料与钾，山梨酸也能增加香肠的保质期2325。F,BONDUELLE等人的研究中发现，其中发生在直接接触冰的鱿鱼存储过程中激烈的可溶性物质溶出，大大影响了化学效率指标对于新鲜度指标的评价。在塑料袋冰的存储过程中的鱿鱼样品中，体现关于NPN和FAA方面的优势，其中嗜冷细菌计数无明显改变。但是，有必要进行进一步研究来
9、评估特定腐败菌和致病细菌的生长来验证每个存储方法的使用方面对消费者安全性。传统的化学指标TMA和VBN，在用CI处理样品的实验过程中没有增加。而在用NC处理样品过程中增长缓慢，对于评价此种鱿鱼的新鲜度指标和货架期的效用不是很大。于此相反，游离色氨酸和尿素，可以作为此种鱿鱼的有用的新鲜度指数，其中当水溶性化合物溶出程度为最小化时，因为它们的内容含量在NC处理样品过程中的存储期间一直逐步增加。不同的处理条件对所有的化学指标评价有着显著的影响。在用非接触式冰处理的样品中，TMA，VBN，游离色氨酸和尿素含量相对较低，但是微生物污染已经已经比较高，用此可见，这些化合物的含量低并不一定对应具有鱿鱼品质高
10、。因此，LPLEI鱿鱼化学指标的可接受程度，要与人类消费相兼容，才能选择合适的存储条件26。本课题选用冻藏枪乌贼作为原料。对其进行菌相分析,分离确定冻藏枪乌贼上的微生物菌群种类和数量。研究不同加工温度下冻藏枪乌贼微生物及品质随时间的变化情况。并以此为依据建立数学模型，预测微生物随时间和温度的变化情况。能够为更好地对冻藏枪乌贼采取合适的杀菌技术提供更多的理论依据。2材料与方法21试验材料冻藏枪乌贼，某水产品企业提供，选择厚度较大的胴体部分作为研究对象。22仪器设备立式压力蒸汽灭菌器LDZX50KBS电子分析天平BS110S北京赛多利斯天平有限公司超净工作台SWCJ2FD苏净集团华利达旋涡混合器W
11、H861太仓市科教器材厂移液枪TRIPETTE德国BRAND公司LHS150SC恒温恒湿培养箱上海一恒科技有限公司菌落计数器J2江苏姜堰市康泰医疗器材厂海尔冰箱BCD191WE青岛海尔集团显微镜XSZ106NO007361NOVEL数显恒温水浴锅NH6国华电子有限公司电热恒温鼓风干燥箱宁波江南仪器厂23药品与试剂营养琼脂培养基生化试剂杭州微生物试剂有限公司氧化酶试纸生化试剂杭州天和微生物试剂有限公司溴百里香酚兰生物染色素上海试剂三厂结晶紫生物染色素温州市东升化工试剂厂孔雀石绿生物染色素温州市东升化工试剂厂番红花红T生物染色素上海试剂三厂75医用酒精分析纯宁波市镇海甬锋化工厂95乙醇分析纯常熟市
12、场园化工有限公司氯化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司对氨基二甲苯分析纯上海试剂三厂萘酚分析纯温州市东升化工试剂厂香柏油分析纯中国上海标本模型厂液体石蜡化学纯杭州化学试剂厂30过氧化氢分析纯宜兴市第二化学试剂厂二甲苯分析纯上海试剂四厂昆山分厂氢氧化钾分析纯兰溪中星化工试剂有限公司磷酸氢二钾分析纯宜兴市第二化学试剂厂三氯化铁分析纯中国医药上海化学试剂公司24试验方法241原料前处理在无菌环境中将冻藏枪乌贼的胴体部分切割成约为20CM2、厚度约为2CM的肌肉组织块以备用。242方法2421菌落总数测定将分割好的组织块清洗后，放置在已灭菌的玻璃容器中，分别存放于5、10、15、20与25恒温箱中进行贮
13、藏实验。用已灭菌剪刀在无菌环境中剪碎肌肉组织，称取25G样品至于装有225G灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振荡后制成101稀释液，用10倍递增法进一步制成102、103、104和105等稀释度的稀释液，选取合适浓度的菌液，分别采用倾注法和涂布法，利用营养琼脂培养基进行微生物培养，且每个浓度每种培养方法做2个平板，置30恒温培养箱中培养，2D后计数。其中，5、10、15、20与25条件下储藏的样品分别隔24H、12H、6H、4H、2H测定一次。2422菌种纯化与鉴定根菌落形态观察观察己分离纯化的单个菌落的大小、光泽度、透明度、颜色、边缘结构、表面形态等。细菌个体形态观察挑取菌落进行革兰氏染色观察，
14、观察细胞的形状和细胞间的排列方式，并进行显微照相。生理生化试验菌株做革兰氏染色实验，然后参照海产鱼贝类细菌鉴定图示，见图1、图2，分别对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌进行鉴定。鉴定试验主要包括氧化酶试验，过氧化氢酶试验，运动性实验，鞭毛染色，芽孢染色，O/F实验，糖发酵试验，耐盐生长试验，产H2S实验，O/129敏感性试验等。分子生物学鉴定16SRNA测序分析鉴定。图1革兰氏阳性菌鉴定图FIG1IDENTIFICATIONPROCEDURESOFGRAMPOSITIVEMICROORGANISM图2革兰氏阴性菌鉴定图FIG2IDENTIFICATIONPROCEDURESOFGRAMNEGATIV
15、EMICROORGANISM3结果与讨论31不同温度下腐败开始点和腐败终点分析将枪乌贼放置在5、10、15、20与25温度条件下进行储藏，研究其微生物总数与菌相变化。结果发现，在525温度范围内，当鱿鱼到达腐败开始点即表面出现异色，质地开始松软，此时枪乌贼的品质开始下降。由表1得，在525温度范围内，其微生物总数的对数值均在48630103范围内。而当微生物总数的对数值在65090056的范围内时，此时的枪乌贼有着强烈的腐臭味，颜色泛微黄色和淡粉红色，肌肉组织松散无弹性，可认为达到货架期终点，此时定义为腐败终点。表1腐败开始点和腐败终点TAB1STARTINGPOINTANDENDINGPOI
16、NTOFCORRUPTION温度（）腐败开始点菌落对数值LGCFU/G腐败终点菌落对数值LGCFU/G5489064991048906453154933652820475965642548416501平均值48636509极差01030056在5贮藏条件下，枪乌贼经过120H的贮藏，才开始出现腐败现象，192H后到达腐败终点。而在25下储藏时，22H就到达腐败终点，到40H就完全达到了腐败终点。由此可见，温度越高，越快出现腐败状况，也越容易达到腐败终点。32冻藏枪乌贼菌相分析321初始菌相分析冻藏枪乌贼中的微生物菌相组成较为复杂，其中主要组成为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。并且在清洗前后菌相组成
17、有较大差异。由表2知，冻藏枪乌贼清洗前的菌株数为65，其中主要是希瓦氏菌属、棒杆菌属、环丝菌属、不动杆菌属、假单胞菌属，其中革兰式阴性菌和阳性菌的比例分别占到5693和4154。但清洗后的枪乌贼只分离到37株菌株，而且菌相组成大部分为革兰氏阴性菌希瓦氏菌，复杂度大大降低。由此可分析得出，在未清洗鱿鱼中分离到的大部分革兰氏阳性菌可能是由于该实验研究对象为冻藏产品，由于在捕捞、速冻或运输过程中受到人工、环境等外界微生物污染，而这部分菌大多附在枪乌贼胴体表面或表面冰层中，故当用清水进行清洗处理后，这部分菌就会大幅度减少。322枪乌贼货架期终点时的菌相组成由表4可知，枪乌贼5、10、15、20与25温
18、度条件下进行储藏达到货架期终点时，希瓦氏菌属所占比例均大于其他菌株，分别为7219、6627、6170、5854和5517，较初始菌相百分明显上升。且温度越低，希瓦氏菌的优越性就越明显，这可能跟希瓦氏菌在低温下较其他菌种能够更好的繁殖生长有关。故可认为希瓦氏菌群是冻藏枪乌贼的优势菌群。表2冻藏枪乌贼初始菌相组成TAB2INITIALMICROFLORACOMPOSITIONOFFROZENLOLIGOPLEI菌群组成清洗前清洗后菌株数百分比菌株数百分比革兰氏阴性G弧菌属11541270杆状菌属23081270黄杆菌属23081270不动杆菌属46153812假单胞菌属8123141081希瓦氏
19、菌203077123243革兰氏阳性G芽孢杆菌属11541270葡萄球菌属57692541棒杆菌属57691270环丝菌属16246292432其他11542541总计6510037100表3枪乌贼货架期终点时的菌相组成TAB3MICROFLORACOMPOSITIONOFLOLIGOPLEIATTHEENDPOINTOFSHELFLIFE33不同加工环境温度下的菌落数量分析随着暴露时间的不同，不同温度下的枪乌贼微生物总数对数值的变化分别呈现不同的变化规律。分别将枪乌贼放置在温度条件下进行储藏，测定其菌落总数。其中表48分别为525实验条件下菌落总数对数值随时间的变化情况。其中图37为525下
20、不同暴露时间下的微生物总数对数值的变化关系曲线。其中各个回归曲线方程见表9，525各个温度下的回归曲线的相关系数R2分别为09952,09882,09897,09937,09962。菌群组成510152025菌株数百分比菌株数百分比菌株数百分比菌株数百分比菌株数百分比革兰氏阴性G希瓦氏菌13572191126627876170725854645517假单胞菌属331765271598211489108137603不动杆菌属52679533749611894151293黄杆菌属105331781071108100杆状菌属0010591071216300库特氏菌属00211800324400革兰氏
21、阳性G环丝菌属1158814828211489201626282414棒杆菌属00105900001086葡萄球菌属00000010811086其他2107003213324400总计1871000016910000141100001231000011610000表45下的菌落对数值TAB4THENUMBEROFCOLONIESAT5时间（H）菌落对数值（LGCFU/G）时间（H）菌落对数值（LGCFU/G）时间（H）菌落对数值（LGCFU/G）122399843644156536924241696402816859053626471084496180623648275612048411926
22、3116029971325168204636872329614452592166499Y8E07X300003X200007X23172R20995201234567050100150200250X时间/HYLGN/LGCFU/G）图35下的菌落数回归曲线FIG3REGRESSIONCURVEOFCOLONIESAT5表510下的菌落总数TAB5THENUMBEROFCOLONIESAT10时间（H）菌落对数值（LGCFU/G）时间（H）菌落对数值（LGCFU/G）时间（H）菌落对数值（LGCFU/G）2242660401610861022425187247591206298362726845
23、27313263174832349659211446453Y3E06X300005X200103X20948R20988201234567020406080100120140160180X时间/HYLGN/LGCFU/G）图410下的菌落数回归曲线FIG4REGRESSIONCURVEOFCOLONIESAT10表615下的菌落数TAB6THENUMBEROFCOLONIESAT15时间（H）菌落对数值（LGCFU/G时间（H）菌落对数值（LGCFU/G时间（H）菌落对数值（LGCFU/G62321424557786148122460484933846298182640545181906317
24、2429916054039664723036016656081026528364389726004Y4E06X300002X200625X19765R20989701234567020406080100120X时间/HYLGN/LGCFU/G）图515下的菌落数回归曲线FIG5REGRESSIONCURVEOFCOLONIESAT15表720下的菌落数量TAB7THENUMBEROFCOLONIESAT20时间（H）菌落对数值（LGCFU/G）时间（H）菌落对数值（LGCFU/G）时间（H）菌落对数值（LGCFU/G）42397284197526098824923243275662141226
25、91364890606419162893405050646564203243445690243705485977Y3E05X300032X200008X23153R2099620123456701020304050607080X时间/HYLGN/LGCFU/G）图620下的菌落数回归曲线FIG6REGRESSIONCURVEOFCOLONIESAT20表825下的菌落总数TAB8THENUMBEROFCOLONIESAT25时间（H）菌落对数值（LGCFU/G）时间（H）菌落对数值（LGCFU/G）时间（H）菌落对数值（LGCFU/G）22417163933306147424921843763
26、264936257220459834648082681224890366490102828245213386508123139265982406501143737285707Y00002X300118X200453X24479R20993701234567051015202530354045X时间/HYLGN/LGCFU/G）图725下的菌落数回归曲线FIG7REGRESSIONCURVEOFCOLONIESAT25表9回归曲线方程和相关系数TAB9REGRESSIONCURVEANDR2温度回归曲线方程R25Y8E07X300003X200007X231720995210Y3E06X3000
27、05X200103X209480988215Y4E06X300002X200625X197650989720Y3E05X300032X200008X231530993725Y00002X300118X200453X24479099624结论将枪乌贼放置在5、10、15、20与25温度条件下进行储藏，对其在储藏期间的微生物总数和菌相进行分析知枪乌贼在腐败过程中，其菌相包括希瓦氏菌、假单胞菌属、不动杆菌属、黄杆菌属、杆状菌属库特氏菌属、环丝菌属、葡萄球菌属、棒杆菌属等。其中希瓦氏菌为优势菌群，且温度越低，希瓦氏菌的比例越高，这可能跟希瓦氏菌的低温下的生存能力强有一定关系。研究结果表明，在525的温
28、度范围内，枪乌贼到达腐败开始点和腐败终点时的菌落总数对数值的平均值分别为48610103和65090056。且本课题还依据测定结果，得到了不同温度下微生物总数对数值与贮藏时间的变化关系曲线，经分析知各回归曲线的相关系数都很接近于1，可信度高。故可以此为依据，在知道初始菌落数的情况下，即可根据数学模型确定枪乌贼在特定时间下的微生物情况，以此来判定枪乌贼的新鲜程度，有利于工厂对原料进行监控与管理，确保产品品质。参考文献1毛延年水产鲜度保持剂J食品科学,1982,0551552张寿山法典标准中制定和应用食品微生物指标的原则J中国食品卫生杂志,1997,0315203张寿山鱼的鲜度为什么会下降J中国食
29、品,1982,1220264杨守明试论“感官指标”在公共场所卫生监督中的重要性J环境与健康杂志,1997,0351555王秀云判断食品鲜度的几种方法J山西食品工业,1998,012132316蒲传奋,唐文婷,王世清,等贮藏时间和温度对生食粉品质影响的初探J中国食品工业,2007,092112137钱家亮,宋俊梅,宁维颖豆豉天然制曲过程的动态研究J食品与发酵工业,2008,025105158郝生宏,杨荣芳,富新华,等不同贮存条件对冷鲜猪肉品质的影响J辽宁农业职业技术学院学报,2009,0141469赵凤义控制奶粉微生物指标的有效办法J中国奶牛,1991,02555910黄家英食品微生物指标的控管
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32、ONOFFOODRELATEDMICROORGANISMSJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,1999,6531312131522WEKHOF,ADISINFECTIONWITHASHLAMPSPDAJOURNALOFPHARMACEUTICALSCIENCEANDTECHNOLOGYJ2000,543,26427623WUYTACK,EY,THIPHUONG,LD,AERTSEN,A,ETALCOMPARISONOFSUBLETHALINJURYINDUCEDINSALMONELLAENTERICASEROVARTYPHIMURIUMBYHEATANDB
33、YDIFFERENTNONTHERMALTREATMENTSJJOURNALOFFOODPROTECTION,2003,661313724RICE,JK,EWELL,MEXAMINATIONOFPEAKPOWERDEPENDENCEINTHEUVINACTIVATIONOFBACTERIALSPORESJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,2001,67125830583225OTAKI,M,OKUDA,A,TAJIMA,K,ETALINACTIVATIONDIFFERENCESOFMICROORGANISMSBYLOWPRESSUREUVANDPULSEDXENONLAMPSJWATERSCIENCEANDTECHNOLOGY,2003,47318519026GMEZLPEZ,VM,DEVLIEGHERE,F,BONDUELLE,V,ETALFACTORSAFFECTINGTHEINACTIVATIONOFMICROORGANISMSBYINTENSELIGHTPULSESJ
