1、本科毕业设计（20_届）大弹涂鱼、弹涂鱼的线粒体COI基因差异及系统发育所在学院专业班级水产养殖学学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录引言11材料与方法111样品采集112基因组DNA提取113PCR扩增及序列测定114基因序列信息的收集215基因序列的分析22结果与分析221大弹涂鱼、弹涂鱼COI基因序列特征及变异222种间及种内的遗传距离423虾虎鱼科分类及其分子系统树53讨论6致谢错误未定义书签。参考文献7摘要本研究探讨将虾虎鱼科鱼类线粒体COI基因作为DNA条形码在物种鉴定上应用的可行性。采集虾虎鱼科中的大弹涂鱼BPECTINIROSTRIS和弹涂鱼PCANTONENSIS各6尾，
2、从其肌肉抽提DNA，然后PCR扩增线粒体COI基因，纯化并测序。研究中获得了这2种虾虎鱼科鱼类长度约为650BP的COI基因序列。该序列与GENBANK下载的其它12种虾虎鱼科鱼类的COI基因序列，经CLUSTALX辅助校正，采用MEGA软件以KIMURA2PARAMETER计算出种间及种内距离，并基于NJ和MP法构建出14种虾虎鱼科鱼类分子系统树。大弹涂鱼和弹涂鱼种内遗传距离分别为0002和0008，而14种虾虎鱼科鱼类种间平均遗传距离为0224。在分子系统树上，14个种均可形成单系，其中背眼虾虎鱼亚科的大弹涂鱼和青弹涂鱼间的遗传距离较大弹涂鱼和弹涂鱼的小，所以在系统发育上大弹涂鱼属与青弹涂
3、鱼属间的亲缘性比大弹涂鱼属与弹涂鱼属间的亲缘性高。关键词大弹涂鱼；弹涂鱼；COI基因；系统发育ABSTRACTINTHISSTUDY,WEDISCUSSEDTHEVALIDATIONOFCOIGENESEQUENCETOEFFICIENTLYIDENTIFYTHESPECIESOFGENUSGOBIIDAEBPECTINIROSTRISANDPCANTONENSISOFGOBIIDAESPECIESWERECOLLECTEDEACHSIXONEFORTHISSTUDY,THEIRGENOMICDNASWASEXTRACTEDFROMMUSCLE,ANDTHEMITOCHONDIALCOIGEN
4、EFRAGMENTSWEREAMPLIFIESWITHPCRAFTERPURIFICATION,THEAMPLIFIEDPRODUCTSWERESEQUENCEDTHEEXPERIMENTALRESULTSSHOWEDTHATAGENEFRAGMENTOFTHISTWOSPECIESWITHMOLECULARSIZEABOUT650BPWEREOBTAINEDAFTERPCRAMPLIFICATIONSTHESESEQUENSESANDOTHER12SPECIESOFGOBIIDAEWEREADJUSTEDBYCLUSTALX,THENTHEPROGRAMMEGAWASUSEDFORSEQUE
5、NCEANALYSISGENETICDISTANCESWERECOMPUTEDWITHKIMURA2PARAMETERMODELANDPHYLOGENETICTREEWASRECONSTRUCTEDWITHNJANDMPTHEDISTANCEWITHINSPECIESOFBPECTINIROSTRISANDPCANTONENSISWAS0002AND0008,RESPECTIVELY,ANDTHEAVERAGEDISTANCEBETWEENTHE14SPECIESWAS0224ONTHEPHYLOGENETICTREE,14SPECIESASSEMBLEDINONECLASSBUTTHEGEN
6、ETICDISTANCEBETWEENBPECTINIROSTRISANDSHISTOPHORUSOFOXUDERCINAEWASSMALLERTHANBETWEENBPECTINIROSTRISANDPCANTONENSIS,SOTHEAFFINITYBETWEENBOLEOPHTHALMUSANDSCARTELAOSWASMUCHHIGHERTHANBOLEOPHTHALMUSANDPERIOPHTHALMUSKEYWORDSBOLEOPHTHALMUSPECTINIROSTRISPERIOPHTHALMUSCANTONENSISCYTOCHROMEOXIDASESUBUNITICOIPH
7、YLOGENESIS1引言虾虎鱼科（GOBIIDAE）属鲈鱼目，虾虎鱼亚目。虾虎鱼科鱼类的特点是身体细长，有两条脊鳍，大多数虾虎鱼科鱼类前鳍化为吸盘，可于岸边爬行，如弹涂鱼，大弹涂鱼。该科鱼类分布于全世界，一共大约有800多种，它们大多栖息于热带的海水中，是一种体型较小的食肉鱼类。当前，已经有很多人研究过COI基因序列作为DNABARCODE用于系统分类及物种鉴定上的的应用王中华等，2010；肖武汉等，2000；许守明等，2009。虽然因为涉及线粒体的进化历史、遗传特性和物种成种时间的默认前提使得利用COI基因作为DNABARCODE并非完全成立，但是细胞色素C氧化酶1号基因（COI）的部分序
8、列是目前在动物中最适用的DNABARCODE（柏干荣等，2003；李铁华等，2003；李连之等，2001）。且随着标准数据库的建立，基于COI基因的DNABARCODE在生物分类学和生态学中将得到广泛应用。近年来，在鱼类、昆虫、鸟类等动物的鉴别分类研究中COI作为扫描生命的条形码已被广泛用到。现今，因为COI条码序列获取很便捷，广泛适用硬骨鱼类物种鉴别，并可用于低级分类阶元的系统进化分析（刘楚吾等，2009；关申民等，2008），如由青石斑鱼COI与线纹刺尾鲷COI同源性很高，可判断青石斑鱼与线纹刺尾鲷亲缘性很高（施大卫等，2009）；采自东海的银鲳、翎鲳和中国鲳3种鲳属鱼类的线粒体COI基因
9、序列片段进行研究，能从分子水平研究中国东海海域鲳属鱼类的分类、遗传关系和系统进化，以其了解鲳属鱼类以及与鲳科之间的亲缘关系，又为鲳属鱼类保护生物学和系统进化提供分子生物学依据（张凤英等，2008）；HEBERT等（2003B对动物界11个门13320个物种的研究结果显示，线粒体COI基因细胞色素氧化酶亚基1靠近5端的一段序列能够对动物界的物种进行有效的鉴定，并且在多数动物类群中，COI基因都存在显著的序列变异。彭居俐等（2009）研究了基于线粒体COI基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应用。目前，对动物界物种进行DNA条形码研究所通常选择的基因就是COI基因。因此，虽然现在对于用
10、COI基因片段作为鱼类分类鉴定的DNABARCODE研究还比较少，但鱼类资源保护日益严峻，以COI基因序列为DNABARCODE的鱼类分类鉴别将被频繁用到。本研究将通过对大弹涂鱼、弹涂鱼及另外12种虾虎鱼科鱼类COI基因序列的分析研究，从而分析大弹涂鱼与弹涂鱼的系统进化关系，并总结出14种虾虎鱼科的基因序列的差异，进而为以后基于COI基因的DNABARCODE在鱼类物种鉴定的研究奠定基础，为鱼类分类学及生态学的发展提供参考。1材料与方法11样品采集本研究使用的大弹涂鱼、弹涂鱼各6个个体，大弹涂鱼采集自浙江省宁海县，而弹涂鱼采集自浙江省慈溪市杭州湾。从其各取背部肌肉组织样品放入液氮中过夜后，于8
11、0保存备用（关飞等，2007；陈虹等，2003；GASSERBETA1,1999）。12基因组DNA提取取样品背部肌肉100MG加液氮研磨，加500L裂解液、20L蛋白酶K、1LRNA酶，在55水浴至完全溶解。加等体积饱和酚，轻轻混匀于4、12000RPM离心20MIN后，小心移取上清液于新的灭菌离心管中，再加入等体积（500L）酚二氯仿二异戊醇（25241），混匀于4，12000RPM离心15MIN，再移取等体积（500L）氯仿二异戊醇（241）上下颠倒混匀后于12000RPM离心15MIN。移取上清液，取剩余液的1/10体积（50L）加入3M的NAAC和2倍体积（1000L）预冷的无水乙醇
12、20于20冰箱过夜。24H后，4，10000RPM离心15MIN，弃上清液，然后加入70酒精1ML反复洗涤，沉淀再次离心15MIN。将沉淀于放置至无酒精味。最后用适量的溶液TE溶解，置于4冰箱中保存备用。13PCR扩增及序列测定PCR扩增的目的片段是COI基因靠近5端的长度为650左右的序列。其扩增和测序引物参照文献WARDETAL,2005，由上海生工合成，引物序列为F1TCAACCAACCACAAAGACATTGGCACF2TCGACTAATCATAAAGATATCGGCACPCR反应使用的每一样品扩增体积为50L，其中无菌水175L，引物各25L，TAE缓冲液25L，DNA模板25L。P
13、CR反应条件为预变性945MIN，变性9430S,退火5430S，延伸7230S，最后延伸7210MIN，保温4。扩增产物经2的琼脂糖凝胶电泳检测后，将阳性PCR产物送至INVITROGEN公司完成测序工作。214基因序列信息的收集除本研究所检测的2种虾虎鱼科鱼类弹涂鱼和大弹涂鱼外，从GENBANK下载12种虾虎鱼科鱼类及乌塘鱧科的乌塘鱧（BOSTRYCHUSSINENSIS）的COI基因序列。利用本研究的2种虾虎鱼科和这另外的12种虾虎鱼科鱼类的COI基因同源序列一起分析研究，将同为虾虎鱼亚目的乌塘鱧科乌塘鱧的COI基因同源序列用作外群（杨天燕等，2007；柳淑芳等，2010）。所分析物种的
14、COI基因及其相关信息见表1。15基因序列的分析获得的测序结果先利用NCBI软件中的BLAST工具进行相似性的检索，以确认实验所得基因序列是目的片段（张仪等，2004）。用CLUSTALX软件对本研究所得序列和GENBANK下载的相关序列进行排序并进行手工校正剪切，然后用MEGA软件计算出序列的碱基组成、种内以及种间遗传距离。分子系统树的构建采用的是邻接法NJ和最大简约法MP。邻接法分析采用KIMURA2PARAMETER遗传距离，进行1000次自展分支检验。最大简约法分析使用启发式搜索，构树方法采用二等分再连接TREEBISECTIONRECONNECTION,TBR，所有数据均未加权，获得
15、50一致性的树，可靠性由1000次自展分支检验（杨学明等，2006；柳淑芳等，2010；MURGIARETAL,2002）。表1本研究所分析物种的COI基因信息TAB1INFORMATIONOFCOIGENESOFANALYTICALSPECIESINTHISSTUDY表示外群REPRESENTTHEOUTGROUP2结果与分析21大弹涂鱼、弹涂鱼COI基因序列特征及变异本研究所使用的引物位于COI基因的5端，采用上游引物F1与下游引物R1对总DNA进行PCR。通过PCR可获得的2种虾虎鱼科背眼虾虎鱼亚科的鱼类，即弹涂鱼和大弹涂鱼各6个个体的线粒体COI基因部分片段，片段长度约为650BP，表
16、明COI基因通用引物在虾虎鱼科中具有一定的普遍适用性。由图1可见，本研究两种虾虎鱼科鱼类提取的基因组DNA及PCR产物经电泳后都能较好的分离成像。A编号物种名称拉丁名分类地位样品数GENBANK序列号GP_1丝条凡塘鱧VALENCIENNEASTRIGATA虾虎鱼科虾虎鱼亚科凡塘鱧属1FJ584231GP_2六斑凡塘鳢VALENCIENNEASEXGUTTATA虾虎鱼科虾虎鱼亚科凡塘鱧属1FJ584224GP_3双带凡塘鳢VALENCIENNEAHELSDINGENII虾虎鱼科虾虎鱼亚科凡塘鱧属1HQ561523GP_4宽纹叶虾虎鱼GOBIODONHISTRIO虾虎鱼科虾虎鱼亚科叶虾虎鱼属1F
17、J583450GP_5GOBIONELLUSOCEANICUS虾虎鱼科拟虾虎鱼亚科1GU224484GP_6大弹涂鱼BOLEOPHTHALMUSPECTINIROSTRIS虾虎鱼科背眼虾虎鱼亚科大弹涂鱼属6本研究GP_7GNATHOLEPISTHOMPSONI虾虎鱼科拟虾虎鱼亚科1GU224475GP_8青弹涂鱼SCARTELAOSHISTOPHORUS虾虎鱼科背眼虾虎鱼亚科青弹涂鱼属1EU595282GP_9弹涂鱼PERIOPHTHALMUSCANTONENSIS虾虎鱼科背眼虾虎鱼亚科弹涂鱼属6本研究GP_10黄体叶虾虎鱼GOBIODONOKINAWAE虾虎鱼科虾虎鱼亚科叶虾虎鱼属1FJ58
18、3456GP_11五线叶虾虎鱼GOBIODONQUINQUESTRIGATUS虾虎鱼科虾虎鱼亚科叶虾虎鱼属1FJ583459GP_12CTENOGOBIUSBOLEOSOMA虾虎鱼科拟虾虎鱼亚科1GU224403GP_13OLIGOLEPISACUTIPENNIS虾虎鱼科拟虾虎鱼亚科1HQ654731GP_14丝虾虎鱼CRYPTOCENTRUS虾虎鱼科虾虎鱼亚科丝虾虎鱼属1HQ561513OUT1乌塘鱧BOSTRYCHUSSINENSIS乌塘鱧科乌塘鱧属1AY7221643B图1提取的DNA电泳图及PCR扩增结果FIG1THEELECTROPHORESISFIGURESOFEXTRACTING
19、DNAANDPCRPRODUCT为基因组电泳图；为产物电泳图。弹涂鱼个体编号为1，2，3，4，5，6；大弹涂鱼个体编号为B1，B2，B3，B4，B5，B6。图MARKER为1KBDNAMARKER；图MARK为PCU19DNAMARKER。AISTHEGENOMICDNAELECTROPHORESISFIGUREBISTHEPCRPRODUCTSELECTROPHORESISFIGURETHEINDIVIDUALBPECTINIROSTRISNUMBERSFOR1,2,3,4,5,6THEINDIVIDUALBPECTINIROSTRISNUMBERSFORB1,B2,B3,B4,B5,B6A
20、FIGUREMARKERFOR1KBDNAMARKERBFIGUREMARKERFORPCU19DNAMARKER采用CLUSTALX软件对本研究所得的两种COI部分序列和12个已发表虾虎鱼科鱼类COI同源序列进行聚类和排序，保留其共有序列，长度为601BP，编码200个氨基酸。用MEGA4计算这24条序列的碱基组成，平均碱基组成为A238、T292、G186、C284，AT含量530高于GC470。而对所研究的14种鱼24个COI基因片段来说，第1密码子位点GC含量571显著高于第2和第3密码子位点440和307表2。所有个体序列核苷酸变异情况见表3。全部位点中不变位点有486个，转换位点有
21、67个，颠换位点有48个。其中不变位点属第2码子位点最多，为200个；而转换位点和颠换位点均属第3密码子位点最多，分别为59个和47个。由表4可以看出，这14种虾虎鱼科鱼类24个个体的COI基因平均GC含量为396504，其中第1密码子位点的GC含量均较高457582，第2密码子的GC含量高度一致都为440，第3密码子的GC含量变化范围最大275490。而大弹涂鱼和弹涂鱼COI基因片段的GC含量相对较低，分别为406和396。表2所选虾虎鱼科个体的COI基因部分序列中各碱基平均分布频率4TAB2AVERAGENUCLEOTIDEFREQUENCIESOFCOIPARTIALSEQUENCESO
22、FTHESELECTEDGOBIIDAESPECIES碱基总频率密码子第一位点密码子第二位点密码子第三位点T292163415299C284266295290A239267145304G185304145107表3所选虾虎鱼科个体的COI部分序列各密码子碱基变异情况TAB3SEQUENCESVARIATIONOFCOIGENEOFTHESELECTEDGOBIIDAESPECIES不变位点转换位点颠换位点R全部位点4866748141ST192811142ND20000NC3RD94594712表4本研究所选虾虎鱼科个体的COI基因密码子位点GC含量TAB4THEGCCONTENTFORALL
23、CODONPOSITIONOFTHESELECTEDGOBIIDAESPECIESCOIGENEINTHISSTUDY22种间及种内的遗传距离14种虾虎鱼科鱼类的种内和种间遗传距离,采用MEGA基于KIMURA2PARAMETER计算出来（柳淑芳等，2010）。结果，虾虎鱼科鱼类种内遗传距离平均值为0005种间遗传距离平均值为0224遗传距离是种内遗编号物种样品数量平均GC含量（）全部位点1ST位点2ND位点3RD位点GP_1丝条凡塘鱧1494567440475GP_2六斑凡塘鱧1476577440410GP_3双带凡塘鱧1492572440465GP_4宽纹叶虾虎鱼1504582440490
24、GP_5GOBIONELLUSOCEANICUS1423458440370GP_6大弹涂鱼6406477440300GP_7GNATHOLEPISTHOMPSONI1424458440375GP_8青弹涂鱼1432497440360GP_9弹涂鱼6396472440275GP_10黄体叶虾虎鱼1461477440465GP_11五线叶虾虎鱼1452457440460GP_12CTENOGOBIUSBOLEOSOMA1463558440390GP_13OLIGOLEPISACUTIPENNIS1458578440355GP_14丝虾虎鱼1456557440370平均值4535214403975传
25、距离的448倍。弹涂鱼和大弹涂鱼的种内遗传距离分别为0008和0002，均未超过HEBERT等2003A所推荐的物种鉴定最小种间遗传距离0020。除此之外，其余12种虾虎科鱼类的种内遗传距离因只有一个样品而未算出，以N/C表示表5。14种虾虎鱼科鱼类中种间平均遗传距离全部大于0020，其中846以上的种间平均遗传距离大于0200。遗传距离最大的是虾虎鱼亚科丝虾虎鱼属的丝虾虎鱼和同一亚科叶虾虎鱼属的五线叶虾虎鱼，为0292。遗传距离最小的是背眼虾虎鱼亚科大弹涂鱼属的大弹涂鱼和同一亚科青弹涂鱼属的青弹涂鱼，为0148，大弹涂鱼与弹涂鱼的遗传距离次之，为0163。依据HEBERT等2003A,B的说
26、法，说明这三种虾虎鱼科鱼类在遗传上有较大亲缘性。表5所选鱼类两两比对的种间平均遗传距离和种内遗传距离TAB5GENETICDISTANCEWITHINSPECIESANDPAIRWISESPECIESINTHESELECTEDSPECIES23虾虎鱼科分类及其分子系统树采用MEGA基于MP和NJ法，对虾虎鱼科三个亚科14种鱼类的24个COI基因序列构建分子系统树，得到的结果具有相似的拓扑结构，但节点支持率相对较低，结果如图2。从图2可见，大弹涂鱼和弹涂鱼的不同个体均可聚在同一分支内，且14个种均可形成单系。NJ树和MP树具有较高的相似性，且两系统树都显示大弹涂鱼与青弹涂鱼分入同一分支，而弹涂鱼
27、位于另一分支。在NJ和MP分子系统树上，还表现出一些与中国动物志分类法不一致的结果。GOBIONELLUSOCEANICUS，GNATHOLEPISTHOMPSONI，CTENOGOBIUSBOLEOSOMA，OLIGOLEPISACUTIPENNIS这四种鱼类按照国际分类法，应被分入虾虎鱼科中的一个新的亚科拟虾虎鱼亚科，而中国动物志则把它们归入虾虎鱼亚科中。从本研究的分子系统树上看，这四种鱼类与虾虎鱼亚科的鱼类已经达到了亚科上的差异，也与背眼虾虎鱼亚科鱼类的在分子系统树上达到并列的位置，因而本研究结果在一定程度上支持国际分类法。NJ树GP_9GP_6GP_14GP_12GP_7GP_4GP_
28、10GP_11GP_5GP_13GP_8GP_3GP_2GP_1GP_90008GP_601630002GP_1402040226N/CGP_12023202230234N/CGP_70173020902640216N/CGP_402580272024102450242N/CGP_10023002490257024802480172N/CGP_110269028702920256023801870188N/CGP_501890205021602130175024102250251N/CGP_13019401990246019602020233024802380181N/CGP_80184014
29、802220220020502420240025502020229N/CGP_302180210021002330218023302310254023402100216N/CGP_2022002380196023502350224023102600204020402220176N/CGP_10224026302310230023402330230025802210246024401960183N/C6MP树图2MP和NJ法构建的14种虾虎鱼科鱼类分子系统树FIG2MPANDNJTREERESULTINGFROM14GOBIIDAESPECIES3讨论OLIGOLEPISACUTIPENNISC
30、TENOGOBIUSBOLEOSOMAGOBIONELLUSOCEANICUSGNATHOLEPISTHOMPSONIPERIOPHTHALMUSANTONENSIS（6）SCARTELAOSHISTOPHORUSBOLEOPHTHALMUSPECTINIROSTRIS（6）CRYPTOCENTRUSVALENCIENNEASEXGUTTATAVALENCIENNEASTRIGATAVALENCIENNEAHELSDINGENIIGOBIODONOKINAWAEGOBIODONHISTRIOGOBIODONQUINQUESTRIGATUSBOSTRYCHUSSINENSIS7438724740
31、33153925392550GOBIONELLUSOCEANICUSGNATHOLEPISTHOMPSONICTENOGOBIUSBOLEOSOMAOLIGOLEPISACUTIPENNISPERIOPHTHALMUSANTONENSIS（6）BOLEOPHTHALMUSPECTINIROSTRIS（6）SCARTELAOSHISTOPHORUSCRYPTOCENTRUSVALENCIENNEASEXGUTTATAVALENCIENNEASTRIGATAVALENCIENNEAHELSDINGENIIGOBIODONQUINQUESTRIGATUSGOBIODONHISTRIOGOBIODON
32、OKINAWAEBOSTRYCHUSSINENSIS2959464440221924221924197本研究的两种虾虎鱼科鱼类大弹涂鱼和弹涂鱼采样点分别为浙江宁海和浙江慈溪，且这两种鱼类的种内距离分别为0002和0008，种间距离为0163，远远大于HEBERT等2003A推荐的物种鉴定最小种间遗传距离为0020，说明本研究中的两种虾虎鱼科鱼类采样正确。研究中的14种虾虎鱼科鱼类24个个体的COI基因GC含量为396504，平均为453；其中第1密码子位点的GC平均含量达521，贡献最大；第3密码子的GC含量变化范围最大275490；第2密码子的GC含量高度一致均为440。而WARD等2005
33、分析了澳大利亚207种鱼类的COI基因序列,结果表明143种硬骨鱼类的GC平均含量为471，高于61种软骨鱼类422的GC平均含量。其中第1、2、3密码子的GC平均含量分别为571、426、411，然而研究中的大弹涂鱼、弹涂鱼及青弹涂鱼的GC含量各为406，396，432，三种平均GC含量411，低于报道中的软骨鱼类422。这种造成虾虎鱼科背眼虾虎鱼亚科的鱼类GC平均含量低于软骨鱼类的现象还有待进一步研究。另外，柳淑芳（2010）研究的石首鱼科30种石首鱼科鱼类的75个COI基因序列GC含量平均为483，其中第2密码子位点GC含量平均为566，第1密码子的GC平均含量为449，第3密码子的GC
34、平均含量为427。彭居俐等2009也报道了鲤科鲌属4种鱼类32个COI基因序列的第1密码子位点GC含量最高516，其次是第2密码子位点428，第3密码子位点的GC含量最低423；与上述报道中不同的是，本研究发现14种虾虎鱼科鱼类的COI基因序列中第2密码子位点GC含量表现为高度一致，这是否为虾虎鱼科鱼类独有现象,还有待于进一步分析研究。除此之外，较大的种间序列差异是对物种进行准确鉴定的先决条件彭居俐等，2009。HEBERT等2003A对动物界的11个动物门13320个物种进行分析得出物种内的遗传距离很少有大于0020的，大部分的种内遗传距离小于0010。HEBERT等2003A，B提出，利用
35、COI基因序列有效鉴别物种的关键点是种间的遗传距离必须大于种内的遗传距离，并且距离差异大约10倍。本研究的14种虾虎鱼科鱼类的种内遗传距离平均值为0005，种间遗传距离平均值为0224，种间遗传距离是种内遗传距离的458倍。因此，可以说明COI基因序列能够对虾虎鱼科鱼类进行有效的物种鉴定，可将虾虎鱼科的线粒体COI基因序列做成DNA条形码（柳淑芳等，2010；谭晓玲等，2002）。从分子系统树中可看出，本研究的弹涂鱼和大弹涂鱼的各6个不同个体都能够聚集在各自的同一分支内,且14个种均可形成单系。更重要的是，本研究的三大亚科虾虎鱼亚科叶虾虎鱼属的宽纹叶虾虎鱼、黄体叶虾虎鱼、五线叶虾虎鱼，凡塘鱧属
36、的六斑凡塘鱧、丝条凡塘鱧、双带凡塘鱧，及丝虾虎鱼属的丝虾虎鱼；背眼虾虎鱼亚科的弹涂鱼、大弹涂鱼、青弹涂鱼；拟虾虎鱼亚科的GOBIONELLUSOCEANICUS，GNATHOLEPISTHOMPSONI，CTENOGOBIUSBOLEOSOMA，OLIGOLEPISACUTIPENNIS。在MP和NJ系统树中这三个亚科的鱼类都能够分入各自的分支中，并能够清楚地观察出虾虎鱼科这三个亚科的鱼类。说明目前国际分类法将GOBIONELLUSOCEANICUS，GNATHOLEPISTHOMPSONI，CTENOGOBIUSBOLEOSOMA，OLIGOLEPISACUTIPENNIS分入一个新的亚科拟
37、虾虎鱼亚科中，是比较合理的。另一方面，本研究的分子系统树也充分证明了虾虎鱼科鱼类在分子上分类和形态学上的分类基本一致（陈峥宏等，2009；董云伟等，2002）。NJ和MP系统树上，均可看出大弹涂鱼和弹涂鱼的遗传距离比大弹涂鱼和青弹涂鱼的大。表五中的大弹涂鱼和弹涂鱼的种间遗传距离为0163，而大弹涂鱼和青弹涂鱼的种间遗传距离为0148，前者种间的遗传距离也大于后者。因此，本研究可证明大弹涂鱼和青弹涂鱼在系统发育上的关系较大弹涂鱼和弹涂鱼的关系较为密切。综上所述，基于虾虎鱼科鱼类的线粒体COI基因构建出的分类系统与形态学的分类单元划分基本一致，所以可以根据该基因的差异来探讨虾虎鱼科属、种分类单元的
38、系统发育问题。但两系统树的节点值都比较低，可能虾虎鱼科鱼类COI基因较为保守，这还需要大量的研究证明。参考文献1柏干荣,陆松敏线粒体DNA编码细胞色素氧化酶亚基基因突变与疾病J国外医学分子生物学分册,2003,82343933952陈虹,陈汉彬中国不同地理株白纹伊蚊细胞色素C氧化酶亚基1基因序列比较J中国流行病学杂志,2003,2461911933陈峥宏,郎书源,吴晓娟,等用COX1基因片段的PCR鉴定亚洲带绦虫和牛带绦虫J贵阳医学院学报,2009,3432392414关飞,牛安欧,李友松,等中国不同种拟钉螺CO1基因序列差异分析及其系统学初探J中国人兽共患病学报,2007,23145475董
39、云伟,牛翠娟,鲍蕾,等单只轮虫DNA提取及其细胞色素C氧化酶I亚基部分序列测定J动物学研究,2002181836关申民,高邦权COI序列影响动物分类学与生态学的DNABARCODEJ生态学杂志,2008,278140614127李连之,黄仲贤细胞色素C氧化酶研究新进展J无机化学学报,2001,1767617748李铁华,郭湘荣,胡铃,等我国五省美洲钩虫COI基因序列多态性分析J中国寄生虫病杂志,2003,2142102139刘楚吾,刘丽,王中铎,等军曹鱼的分子遗传特性研究J热带海洋学报,2005,241778510彭居俐,王绪祯基于线粒体CO1基因序列的DNA条形码在鲤科鲌属鱼类物种鉴定中的应
40、用J水生生物学报,2009,33227127611施大卫,王利,娄绘芳,等青石斑鱼细胞色素C氧化酶亚基COX基因的克隆鉴定及表达分析J中国水产科学,2009,160446847512谭小玲,柳君泽,曹利飞,等缺氧对大鼠大脑皮质细胞色素氧化酶亚基、表达协同性的影响J生理学报,2002,54651952413王中华,应天雷,黄仲贤细胞色素C突变研究进展J化学通报,20101313614肖武汉,张亚平鱼类线粒体DNA的遗传与进化J水生生物学报,2000,24438439115许守明,陈双喜何艳霞细胞凋亡与细胞色素CJ安徽农学通报,2009,15153816杨天燕,高天翔3种鲻科鱼类线粒体CO基因片段
41、序列的比较分析J中国海洋大学学报,2007,37SUP06106617杨学明,郭亚芬罗氏沼虾3个群体线粒体CO基因的序列差异和遗传标记研究M遗传,2006,28554054418张凤英,夏连军黄鲷线粒体CO基因部分序列遗传变异研究J热带海洋学报,2005,245838919柳淑芳,陈亮亮,戴芳群,等基于线粒体CO1基因的DNA条形码在石首鱼科SCIAENIDAE鱼类系统分类中的应用J海洋与湖沼,2010,41222323020张仪,刘和香,冯婷,等子一代实验室钉螺细胞色素C氧化酶I、细胞色素B基因序列分析J中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2004,22527427621WARDRD,ZEMLAKT
42、S,INNESBHETAL,2005DNABARCODINGAUSTRALIASFISHSPECIESMPHILTRANSRSOCB,3601847185722GASSERB,ZHUX,MCMANUSDPNADHDEHYDROGENASESUBANITANDCYTOCHROMECOXIDASOSUBUNITSEQUENCESCOMPAREDFORMEMBERSOFTHEGENUSTAENIACESTODAJINTJPARASITOL,1999,29121965197023HEBERTPDN,CYWINSKAA,BALLSLETAL,2003ABIOLOGICALIDENTIFICATIONST
43、HROUGHDNABARCODESMPROCRSOCB,27031332224HEBERTPDN,RATNASINGHAMS,DEWAARDJR,2003BBARCODINGANIMALLIFECYTOCHROMECOXIDASESUBUNITIDIVERGENCESAMONGCLOSELYRELATEDSPECIESMPROCRSOCB,270969925MURGIAR,TOLAG,ARCHERSN,ETALGENETICIDENTIFICATIONOFGREYMULLETSPECIESMUGILIDAEBYANALYSISOFMITOCHONDRIALDNASEQUENCEAPPLICATIONTOIDENTIFYTHEORIGINOFPROCESSEDOVARYPRODUCTSBOTTARGAJMARINEBIOTECHNOLOGY,2002,44119126
