1、本科毕业设计（20_届）大黄鱼肌动蛋白基因克隆与序列分析所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录引言11材料与方法211材料2111实验材料2112实验试剂2113实验仪器212方法2121质粒提取3122EST测序3123设计引物测通全长32结果321序列测定322生物信息学分析5221大黄鱼肌动蛋白基因序列物种的同源性比较5222进化树5223蛋白质结构分析62231一级结构预测62232二级结构预测72233三维结构预测83讨论84小结9致谢11参考文献12摘要目的为了得到肌动蛋白基因全长序列，探讨该基因与其他物种肌动蛋白基因序列的同源性和与其他物种的亲缘关系，搞
2、清肌动蛋白结构。从分子水平出发研究，为大黄鱼资源保护和种质改良提供了参考资料。方法本实验以大黄鱼骨骼肌CDNA文库为材料，通过EST测序方法获得肌动蛋白基因片段，经BLAST在GENBANK上确定，然后拼接得到肌动蛋白基因全长序列。在NCBI网站上用BLAST对序列进行同源性分析，并用MEGA41软件构建了系统进化树。结果与讨论肌动蛋白普遍存在于真核生物中，是一中高度保守的基因。大黄鱼肌动蛋白与金头鲷，三刺鱼，非洲鲫鱼，青鳉，多线鱼，大西洋鲭鱼同源性比较显示，大黄鱼与大西洋鲭鱼同源性为78，与其他几种都为85。大黄鱼编码的肌动蛋白核苷酸序列与金头鲷，三刺鱼，非洲鲫鱼，青鳉，多线鱼，大西洋鲭鱼，
3、黑鼠，褐鼠，人构建的进化树中，大黄鱼与金头鲷的亲源关系最近。最后，通过EXPASY分析其氨基酸序列来确定蛋白质一级结构，二级结构和三维结构。关键词大黄鱼；骨骼肌肌动蛋白；表达序列标签（EST）测序ABSTRACTSTUDYINORDERTOOBTAINACTINFULLLENGTHSEQUENCEOFGENES,WHICHISFROMPSEUDOSCIAENACROCEA,TODISCUSSIONTHEGENESOFACTINGENESEQUENCEHOMOLOGYANDPHYLOGENETICRELATIONSHIPWITHOTHERSPECIES,TOFINDOUTACTINSTRUCTU
4、RESTARTINGFROMTHEMOLECULARLEVELSTUDY,ITCANPROVIDEAREFERENCETHATRESOURCEPROTECTIONANDGERMPLASMIMPROVEMENTFORPSEUDOSCIAENACROCEAMETHODINTHISEXPERIMENT,PSEUDOSCIAENACROCEASKELETALMUSCLECDNALIBRARYASTHEMATERIALS,WEWOULDHAVEACTINGENEFRAGMENTBYPSEUDOSCIAENACROCEAWHICHWASIDENTIFIEDINGENBANKBYBLAST,THENEXTS
5、TEPCOULDOBTAINACTINCDNASEQUENCEOFTHEGENESBYSPLICINGTHESEQUENCEHOMOLOGYANALYSISWITHBLASTATTHENCBIWEBSITEANDCONSTRUCTEDPHYLOGENETICTREEWITHTHEMEGA2SOFTWARERESULTSANDDISCUSSIONACTINGENERALLYEXISTSINEUKARYOTES,ITISAGENEWHICHISHIGHLYCONSERVEDCOMPAREDPSEUDOSCIAENACROCEAACTINGENEWITHTHESPARUSAURATA，GASTERO
6、STEUSACULEATUS，TILAPIAMOSSAMBICA，ORYZIASLATIPES，PLEUROGRAMMUSAZONUS，SCOMBERSCOMBRUS,HOMOLOGYOFPSEUDOSCIAENACROCEAANDSCOMBERSCOMBRUSREACH78,ANDWITHTHEOTHERIS85INTHETHEPHYLOGENETICTREEOFPSEUDOSCIAENACROCEAENCODINGACTINANDSPARUSAURATA，GASTEROSTEUSACULEATUS，TILAPIAMOSSAMBICA，ORYZIASLATIPES，PLEUROGRAMMUS
7、AZONUS，SCOMBERSCOMBRUS,RATTUSRATTUS,RATTUSNORVEGICUS,HOMOSAPIENSRELATIONSHIPOFPSEUDOSCIAENACROCEAANDSPARUSAURATAISTHECLOSESTFINALLY,EXPASYSEQUENCEANALYSISTODETERMINETHEPROTEINPRIMARYSTRUCTURE,SECONDARYSTRUCTUREANDTHREEDIMENSIONALSTRUCTURESKEYWORDSPSEUDOSCIAENACROCEASKELETALMUSCLEALPHAACTINEST1引言大黄鱼（
8、PSEUDOSCIAENACROCEA），俗称黄花、大鲜、黄瓜鱼、大黄花鱼，隶属于脊索动物门（CHORDATA）、脊椎动物亚门（VERTEBRATA）、硬骨鱼纲（OSTEICHTHYES）、鲈形目（PERCIFORMES）、鲈形亚目（PERCOIDEI）、石首鱼科（SCIAENIDAE）、黄鱼（PSEUDOSCIAENA），为暖温性近海集群洄游鱼类，生活于近海的中、下层。根据大黄鱼的外部形态和生态地理学特征，田明诚等1把我国沿海大黄鱼分为3个地理种群岱衢族，分布于黄海南部至东海中部，包括吕泗洋、岱衢洋、猫头洋、洞头洋至福建嵛山岛附近闽粤东族,主要分布在东海南部、台湾海峡和南海北部；硇洲族,主要
9、分布于珠江口以西至琼州海峡的南海区。大黄鱼体形匀称、体色金黄，其营养丰富，味道鲜美，较其它养殖种类肉质更细嫩，肉食比例高，且其味道鲜美，营养价值高，含有丰富的蛋白质、微量元素和维生素，对人体有很好的补益作用，对体质虚弱和中老年人来说，食用黄鱼会收到很好的食疗效果，微量元素中含有的硒能清除人体代谢产生的自由基，能延缓衰老，并对各种癌症有防治功效。此外，大黄鱼还有很高的药用价值，其耳石有清热去瘀、通淋利尿的作用，膘有润肺健脾、补气止血作用，胆有清热解毒功能。肌动蛋白ACTIN基因大量存在于几乎所有物种的有核细胞中，是一种高度保守蛋白，与一些管家蛋白的基因一样，在物种内持续恒量表达，因而在很多量化的
10、实验技术如实时定量PCR、NORTHERN杂交、免疫蛋白印迹中被当作内参照。它是肌肉细胞的一个重要的收缩蛋白，也是细胞骨架的主要组成部分，参与细胞发育进程的多个方面，包括细胞运动、新陈代谢、有丝分裂、肌肉收缩等。它以两种形式存在于各细胞中球状单体G肌动蛋白（GACTIN）和纤维状聚合体F肌动蛋白（FACTIN）4。根据等电点的不同可将高等动物细胞内的肌动蛋白分为3类，分布于各种肌肉细胞中，和分布于肌细胞和非肌细胞中。目前分离到的至少有6种异构形式，有三种肌动蛋白（骨骼肌、心肌和平滑肌），骨骼肌和心肌即为横纹肌型的，一种肌动蛋白和两种肌动蛋白（平滑肌和非平滑肌）。近来的研究表明，尽管这些亚型在氨
11、基酸序列上同源性非常高（90），分子量也基本相同，但是不同的ACTIN基因在功能上是不可互换的。肌动蛋白是一种具有2个亚基的蛋白质，其主要作用显然是将肌动蛋白微丝锚定在肌节Z线上2。20世纪70年代以来，由于过度捕捞导致野生大黄鱼数量急剧减少，种质资源的遗传组成趋向同质化，遗传多样性水平降低，引起某些基因丢失而导致其优良经济性状衰退3。本实验用到的大黄鱼肌肉中的肌动蛋白属于骨骼肌肌动蛋白，近年来，人们发现肌动蛋白在鱼类肌肉中有重要的作用，骨骼肌肌动蛋白是构成骨骼肌肌纤维细丝的主要成分，参与肌肉所有的收缩活动，从而完成机体的多种机械运动。骨骼肌肌动蛋白是SATRAUD在1942年首次发现是从家兔
12、骨骼肌中分离的4，肌动蛋白约占骨骼肌纤维蛋白的20、占骨骼肌总蛋白含量12。肌肉的力量主要决定于肌纤维蛋白的数量和体积，故肌动蛋白表达的增加无疑能提高运动的强度。目前已经克隆的肌动蛋白只有人类、牛及少数啮齿动物等，且已有学者通过对骨骼肌肌动蛋白序列各方面的研究实验，知道机体的生长发育可调节骨骼肌肌动蛋白的表达5。所以从更多的生物中克隆得到该基因的序列，然后进行研究，这样就能了解其更多特性与功能。从1985年大黄鱼人工育苗和繁殖成功后大黄鱼养殖业得到迅速发展，特别是闽东地区，大黄鱼鱼网箱养殖已成为当地经济支柱之一6。而近几年发现，养殖大黄鱼普遍存在性早熟、生长缓慢、病害频繁发生等现象。因此，从分
13、子水平上研究大黄鱼，一方面为大黄鱼的资源保护和种质改良提供了参考资料外，同样也为大黄鱼作为模型动物研究人类的类似疾病和其他生物的关于该基因方面的机理奠定理论基础。本实验是通过EST测序，然后与网上的已有的EST序列进行比较，得到肌动蛋白片段后，经BLAST在GENBANK（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/DBEST）上查询确定是该基因后设计引物获得的大黄鱼的骨骼肌2肌动蛋白基因全长序列。对于EST（EXPRESSEDSEQUENCETAG）即为表达序列标签，是1991年VENTER等7在提出大规模CDNA测序研究战略时建立的技术。EST是长度为300500BP的部分CDNA，为了弄
14、清EST之间的关系，美国国立生物技术信息中心（NCBI）根据EST相似性比较进行聚类分析，形成了数据库UNIGENE。EST技术是将MRNA反转录成CDNA并克隆到载体构建成CDNA文库后，大规模随机挑选CDNA克隆，对其5或3端进行一步法测序，所获序列与基因数据库已知序列比较，从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的技术8。VANDELOO等9第一次成功地应用EST方法分离到蓖麻油酸生物合成的关键酶基因。该技术的提出对新基因的发现、人类基因转录图的制作、全长基因的克隆、基因表达谱的研究等有重要的作用。1材料与方法11材料111实验材料实验材料为大黄鱼骨骼肌
15、CDNA文库。112实验试剂1质粒提取溶液I50MMOL/L葡萄糖，25MMOL/LTRISCLPH80，10MMOL/LEDTAPH80，高压下蒸气灭菌15MIN，贮存于40；2质粒提取溶液II02MO1/LNAOH临用前用10MOL/L贮存液现稀释，1SDS；3质粒提取溶液III60M15MOL/L乙酸钾，5ML冰乙酸，285M1水，钾离子终浓度为3MO1/L，乙酸根终浓度为5MOL/L；4异丙醇购于宁波奥博科学仪器有限公司；70的乙醇取70ML的无水乙醇加DEPCH2O（RNASEFREE）定容到100ML，于4保存备用。无水乙醇为AR级，购于宁波奥博科学仪器有限公司；5DEPCH2O（
16、RNASEFREE）购自上海生工生物工程公司；6LB液体培养基1L蛋白胨10G，NACI5G，YEASTEXTRACT5G，PH70，氨苄青霉素终浓度100G/ML，高温高压灭菌30MIN。113实验仪器1各型号枪头、无粉乳胶手套和口罩均购自江苏省通州市南兴申海玻璃仪器厂。2REVCD13863V型超低温冰箱美国REVCD公司；3GIS2008凝胶图像处理系统上海天能科技有限公司；4DV8D电热恒温槽上海一恒科技有限公司；5BIOFUGEFRESCO高速台式冷冻离心机美国SORVALL公司；6DYY8B型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂；7HZ9211K恒温振荡器太仓市科教器材厂；8LX100手掌
17、型离心机江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司；12方法上面引言部分已经提到本实验是通过EST技术获得的大黄鱼肌动蛋白基因片段，且是从大黄鱼肌肉CDNA文库开始的，即以全长CDNA文库为材料，通过了解CDNA文库构建的基础上再进行下一步的实验，CDNA文库的构建先是从大黄鱼中提取总的RNA，再从MRNA逆转录成CDNA，CDNA与载体连接，我们实验室用到的载体是PDNRLIB，然后连接的产物用电穿孔法转入大肠杆菌JM109感受态细胞中，最后3进行培养，这个过程就成功构建了全长CDNA文库1013。接下来就是挑取菌落并对细菌进行扩大培养等，具体步骤如下所述。121质粒提取常规提取质粒步骤按文献141
18、6进行，再根据自己实验室情况加以改良。1挑带有质粒的大肠杆菌于LB液体培养基中，37振荡培养1216小时，直至长出菌落（养菌扩增质粒）。2将菌落接种到96孔板上，每孔加入1ML培养物，37过夜培养，室温，3000RPM离心5MIN，弃上清，倒置晾干。3加入200LSOLUTIONI，封膜用振荡器充分振荡，直至板底无沉淀为止，一定要使菌体充分分散。4加入200L新配的SOLUTIONII，用胶带封口，轻轻反复颠倒45次，使溶液充分混匀切勿剧烈振荡。5再加入200L冷的SOLUTIONIII，用胶带封口，反复颠倒15次。4000RPM离心20MIN，将上清转入另一新的96孔深孔板中。6深孔板每孔加
19、入450L异丙醇，用胶带封口，反复颠倒5次，4000RPM离心20MIN，沉淀DNA。7弃尽上清液，加600L70乙醇，用硅胶垫封口，充分振荡，离心4000RPM，5MIN。8去掉上清，重复上一步。9超净工作台吹干沉淀，用30L超纯水溶解DNA，20储存备用。10电泳检测。加3L溴芬兰，3L质粒将6L液体全部点入加样孔。电压200V，时间20MIN。123EST测序随机测序大黄鱼肌肉组织CDNA全长文库的克隆群，测序工作在北京华大基因公司完成，由ABI3730测序仪进行大规模测序。采用M13通用引物从CDNA的5端测取，本实验所用的的质粒载体为PDNRLIB，该质粒载体中含有M13正向的通用引
20、物，引物序列为5DGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA3。124设计引物测通全长将测得的序列以CROSSMATCH软件并结合手工处理，去除低质量的序列和载体序列。利用BLAST将测得的有效EST（大于100BP）序列经BLASTX检索NCBI及SWISSPROT蛋白质数据库，比较EST与其他物种的同源性高低，且E值小于等于002的搜索结果认为有生物学意义上的显著相似性。获得肌动蛋白基因的EST，然后经BLAST在GENBANKHTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/DBEST查询确定为大黄鱼肌动蛋白基因片段，接着对其设计引物来获得全长。从该基因的EST片段设计引物（20BP左右）继
21、续进行测序，再以第二次测得的结果设计引物，一直到测通全长为止。然后根据首末重复部分进行拼接得到大黄鱼肌动蛋白基因序列的全长，并对得到的序列进行生物信息学分析。2结果21序列测定EST测序获得的大黄鱼肌动蛋白基因的EST，设计引物且拼接后获得大黄鱼肌动蛋白基因全长序列，用DNAMAN软件对其全长序列翻译成氨基酸序列，整理得到为图1所示，序列全长为1431BP，其中ORF编码序列975BP，编码324个氨基酸。41G2AACACGAGCGCACGAGTCAGTGAGCGATGAAGCGGCCGCATAACTTCGTATAGCATACAT62TATACGAAGTTATCAGTCGACGGTACCGG
22、ACATATGCCCGGGAATTCGGCCATTACGGCCMPGNSAITA122GGGGGGGGTATCCTGACTCTGAAGTACCCCATTGAGCACGGTATCATCACCAACTGGGACGGGILTLKYPIEHGIITNWD182GACATGGAGAAGATCTGGCACCACACCTTCTACAACGAGCTGAGAGTGGCCCCCGAGGAGDMEKIWHHTFYNELRVAPEE242CACCCCACCCTGCTCACTGAGGCCCCCCTGAACCCCAAGGCTAACAGAGAGAAGATGACCHPTLLTEAPLNPKANREKMT302CAGATCAT
23、GTTTGAGACCTTCAACGTCCCCGCCATGTATGTGGCCATCCAGGCTGTGCTGQIMFETFNVPAMYVAIQAVL362TCCCTGTACGCTTCCGGCCGTACCACCGGTATTGTGCTGGATGCTGGTGATGGTGTGACCSLYASGRTTGIVLDAGDGVT422CACAACGTCCCAGTCTATGAGGGTTACGCCCTGCCCCACGCCATCATGCGTCTGGACCTGHNVPVYEGYALPHAIMRLDL482GCTGGTCGCGATCTGACCGACTACCTGATGAAGATCCTGACTGAGCGTGGCTACTCCTT
24、CAGRDLTDYLMKILTERGYSF542GTGACCACCGCCGAGCGTGAGATCGTGCGCGACATCAAGGAGAAGCTGTGCTATGTGGCTVTTAEREIVRDIKEKLCYVA602CTGGACTTCGAGAACGAGATGGCCACCGCTGCCTCCTCCTCCTCCCTGGAGAAGAGCTACLDFENEMATAASSSSLEKSY662GAGCTTCCCGACGGTCAGGTCATCACCATCGGTAACGAGAGGTTCCGTTGCCCCGAGACCELPDGQVITIGNERFRCPET722CTCTTCCAGCCTTCCTTCATTGGTATG
25、GAGTCTGCTGGTATCCATGAGACCGCCTACAACLFQPSFIGMESAGIHETAYN782AGCATCATGAAGTGCGACATTGACATCCGCAAGGACCTGTACGCCAACAATGTCCTCTCCSIMKCDIDIRKDLYANNVLS842GGTGGTACCACCATGTACCCTGGTATTGCTGACCGTATGCAGAAGGAGATCACTGCTCTGGGTTMYPGIADRMQKEITAL902GCCCCCAGCACCATGAAGATCAAGATCATTGCCCCTCCCGAGAGGAAGTACTCCGTCTGGAPSTMKIKIIAPPERKYS
26、VW962ATCGGTGGCTCCATCCTGGCTTCCCTGTCCACCTTCCAGCAGATGTGGATCTCCAAGCAGIGGSILASLSTFQQMWISKQ1022GAGTACGACGAGGCTGGCCCCAGCATTGTCCACAGGAAGTGCTTCTAAATCCTCCATCTTEYDEAGPSIVHRKCF1082CTTCTCCAGCTTCTCCATCACTTACACCACCAACTATCGGGAGATCAAGCAAGGAGGAT1142AACCTCTGCGGCACAGCAACACTCTGCTCTCAATGGACTTTCTGTCTGCGCTGTTGACAT1202GCATA
27、TGCATTTTGTTATCCTTTTAAAAATGTGCATATTTTATAGCTGTTTGTTGTCTGT1262GTTGTACGGAGAGAGGCTGTGAAAAATCCACCACTGAACCATGCATCCACTCAAAAAAAA1322AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCATGTCGCGACTGAGCATACAACGCATGTGAACTGAT1382GCAGCCATGACTTTTCCTGCTAATTGCCATGGTCAACGGGGCGAAGTCTA图1大黄鱼肌动蛋白基因全长序列FIG1FULLLENGTHSEQUENCEOFPSEUDOSCIAENACROCEAALPHA
28、ACTIN图1显示的序列1BP到94BP为5端非编码区，95BP到1069BP为编码区，ATG为起始密码子，TAA是终止5密码子，分别用下划线表明，1070BP到1431BP为3端非编码区。编码区翻译的氨基酸序列已在上图列出，氨基酸数为324。22生物信息学分析221大黄鱼肌动蛋白基因序列物种的同源性比较同源性是两种核酸分子的核苷酸序列之间，或两种蛋白质分子的氨基酸序列之间相同的程度。通过NCBI（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/）上BLAST来比对不同物种中肌动蛋白基因同源性17。大黄鱼肌动蛋白基因与SPARUSAURATA金头鲷，AF1904731，GASTEROSTEUSAC
29、ULEATUS（三刺鱼，BT0270911），TILAPIAMOSSAMBICA（非洲鲫鱼，AB0378661），ORYZIASLATIPES（青鳉，NM0011048061），PLEUROGRAMMUSAZONUS（多线鱼，NP0010911），SCOMBERSCOMBRUS（大西洋鲭鱼，EF6070931）这6中生物同源性比较得出（表1），大黄鱼与大西洋鲭鱼同源性为78，与其他几种为85，比较是以核苷酸序列进行的，说明这几种生物与大黄鱼的核苷酸序列都达到了85相似，大西洋鲭鱼的相似性稍微低了点。如看一定范围内最大的同源性时，与大西洋鲭鱼达到了96，与金头鲷同源性为95，三刺鱼94，非洲鲫鱼
30、和多线鱼为93，从这些数据可以说明肌动蛋白基因核苷酸序列在一定区域最大的相似性很高。同样用CLUSTALW分析上面的核苷酸系列时，从起始密码子ATG后128130的GGT开始到终止密码子，之间的序列高度相似，表明该基因的这段区域的高度保守性。表1金头鲷，三刺鱼，非洲鲫鱼，青鳉，多线鱼，大西洋鲭鱼肌动蛋白基因序列的同源性比较TABLE1LPHAACTINGENESEQUENCEHOMOLOGYOFSPARUSAURATA，GASTEROSTEUSACULEATUS，TILAPIAMOSSAMBICA,ORYZIASLATIPES,PLEUROGRAMMUSAZONUS,SCOMBERSCOMBR
31、US登录号物种名同源性AF1904731SPARUSAURATA85金头鲷BT0270911GASTEROSTEUSACULEATUS85三刺鱼AB0378661TILAPIAMOSSAMBICA85非洲鲫鱼NM0011048061ORYZIASLATIPES85青鳉AB0733811PLEUROGRAMMUSAZONUS85多线鱼EF6070931SCOMBERSCOMBRUS78大西洋鲭鱼222进化树以分子数据为依据构建的进化树不仅精确地反映物种间或群体间在进化过程中发生的极微细的遗传变异（小至一个氨基酸或一个核苷酸差异），而且能借助化石提供的分子类群的分化年代能定量估计出物种间或群体间的
32、分化年代18。根据蛋白质的序列构建分子进化树EVOLUTIONARYTREE进化树给出分支层次或拓扑图形，它是产生新的基因复制或享有共同祖先的生物体的歧异点的一种反映，树枝的长度反映当这些事件发生时就存在的蛋白质与现在的蛋白质之间的进化距离。根据进化树不仅可以研究从单细胞有机体到多细胞有机体的生物进化过程，而且可以粗略估计现存的各类种属生物的分歧时间。通过蛋白质的分子进化树分析，为从分子水平研究物种进化提供了新的手段，可以比较精确的确定本文中大黄鱼骨骼肌肌动蛋白的进化地位。6我们通过利用CLUSTALX及MEGA41软件来构建系统进化树。CLUSTALX先建立ALN文件，然后用MEGA41软件
33、对大黄鱼（PSEUDOSCIAENACROCEA），金头鲷（SPARUSAURATA），三刺鱼（GASTEROSTEUSACULEATUS），非洲鲫鱼（TILAPIAMOSSAMBICA），青鳉（ORYZIASLATIPES），多线鱼（PLEUROGRAMMUSAZONUS），大西洋鲭鱼（SCOMBERSCOMBRUS），黑鼠（RATTUSRATTUS），褐鼠（RATTUSNORVEGICUS），人（HOMOSAPIENS）10中生物构建了进化树，此进化树是以这些生物编码的肌动蛋白基因核苷酸序列构建的，该进化树可分为两个进化链，鱼类为一支，哺乳动物为另一分支，金头鲷与大黄鱼的亲缘关系最近，与人
34、、黑鼠和褐鼠的亲缘关系较远，在不同的两分支上。图2肌动蛋白在几种物种中的进化树FIG2EVOLUTIONARYTREEOFALPHAACTININSEVERALSPECIES223蛋白质结构分析2231蛋白质的一级结构预测蛋白质的一级结构（PRIMARYSTRUCTURE）就是蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序，也是蛋白质最基本的结构。它是由基因上遗传密码的排列顺序所决定的。各种氨基酸按遗传密码的顺序，通过肽键连接起来，成为多肽链，故肽键是蛋白质结构中的主键。蛋白质的一级结构决定了蛋白质的二级、三级等高级结构，成百亿的天然蛋白质各有其特殊的生物学活性，决定每一种蛋白质的生物学活性的结构特点，首
35、先在于其肽链的氨基酸序列，由于组成蛋白质的20种氨基酸各具特殊的侧链，侧链基团的理化性质和空间排布各不相同，当它们按照不同的序列关系组合时，就可形成多种多样的空间结构和不同生物学活性的蛋白质分子。通过EXPASY网站（HTTP/EXPASYORG/TOOLS/）对大黄鱼肌动蛋白一级结构的预测，知道其一级结构的等电点为535，分子量为362055，氨基酸数为324（图3）。7图3大黄鱼肌动蛋白一级结构等电点，分子量和氨基酸数，分别为535，363053，324FIG3PRIMARYSTRUCTUREOFPSEUDOSCIAENACROCEAALPHAACTIN,THEORETICALPI535,
36、MOLECULARWEIGHT362055,AMINOACIDS3242232蛋白质的二级结构预测二级结构（SECONDARYSTRUCTURE）是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具有周期性的结构的构象，是多肽链局部的空间结构，主要有螺旋、折叠、转角、无规则卷曲等几种形式，它们是构成蛋白质高级结构的基本要素19。二级结构是通过骨架上的羰基和酰胺基团之间形成的氢键维持的，氢键是稳定二级结构的主要作用力。大黄鱼肌动蛋白二级结构（图4）分析得到，螺旋占4256，随机卷曲占3086，转角占710，随即延伸链占1944。图4大黄鱼肌动蛋白二级结构HH螺旋，TT转角，EE随即延伸链，CC随机卷曲FIG4
37、SECONDARYSTRUCTUREOFPSEUDOSCIAENACROCEAALPHAACTINHHALPHAHELIX,TTBETATURN,EEEXTENDEDSTRAND,CCRANDOMCOIL2233蛋白质的三维结构预测8蛋白质三级结构（PROTEINTERTIARYSTRUCTURE）即蛋白质分子处于它的天然折叠状态的三维构象。三级结构是在二级结构的基础上进一步盘绕，折叠形成的。三级结构主要是靠氨基酸侧链之间的疏水相互作用，氢键，范德华力和静电作用维持的。多肽链中，各个二级结构的空间排布方式及有关侧链基团之间的相互作用关系，称为蛋白质的三级结构。换言之，蛋白质的三级结构系指每一条
38、多肽链内所有原子的空间排布，即多肽链的三级结构主链构象侧链构象，三级结构是在二级结构的基础上由侧链相互作用形成的。大黄鱼肌动蛋白三维结构（图5）同样用EXPASY网站上三级结构预测软件SWISSMODEL2021，进AUTOMATEDMODE输入序列后，结果会发送到我的邮箱，然后进WORKSPACE，用他发我们邮箱的登录号得到测得的结果。图5大黄鱼肌动蛋白三维结构FIG5TERTIARYSTRUCTUREOFPSEUDOSCIAENACROCEAALPHAACTIN3讨论实验过程中所用的EST测序方法，能很快得到所需的基因片段，使该实验变得更简洁和迅速，同时也节省费用。在大规模EST测序中，各
39、步骤紧密相连，任何一个环节出现问题都会造成重大损失，因此,必须对整个流程进行严密质量监控，主要包括RNA和MRNA纯度，文库库容，重组效率，插入片段长度，CDNA重组质粒提取质量等各项检测22。同样，对EST数据也要进行污染和读长分析，不符合要求的数据必须去除。本实验以CDNA为材料，前面一系列的工作可省去，但必须要确定该文库足够好的基础上再开展下面实验，只有有了高质量的文库，接下去的实验才能得到准确的结果。提取质粒时，实验过程中的每个细节都要严谨（同样也包括其他的实验步骤），本实验是通过碱法提取质粒的。在加入SOLUTIONII（现配）时，时间不能过长，因为在碱性条件下基因组DNA片段会慢慢
40、断裂，同时要温柔混合，要不然提取的质粒上会混有大量的基因组DNA。肌动蛋白是一个持家基因，在所有高等真核生物中高度保守。大黄鱼肌动蛋白与SPARUSAURATA金头鲷，AF1904731，GASTEROSTEUSACULEATUS（三刺鱼，BT0270911），TILAPIAMOSSAMBICA（非洲鲫鱼，9AB0378661），ORYZIASLATIPES（青鳉，NM0011048061PLEUROGRAMMUSAZONUS（多线鱼，NP0010911），SCOMBERSCOMBRUS（大西洋鲭鱼，EF6070931）这6中生物同源性比较看出，大黄鱼与大西洋鲭鱼同源性为78，与其他几种为85
41、，但在一定范围内的最大同源性都很高。本文同源性比较是比较了肌动蛋白的核苷酸序列，如果把核苷酸翻译成氨基酸序列与其他物种比较，肌动蛋白在其他许多物种的同源性都达到了96，如大黄鱼与鲤鱼，斑鱼，真鲷，牛，耶氏突吻鳕，斑马鱼，爪蟾，智人，非洲爪蟾的同源性比较，在12313氨基酸处，很多生物这部分氨基酸序列基本一致，充分体现了持家基因的这一高度保守性的特点。同样上面已提到利用CLUSTALW分析核苷酸序列相似性时，从128个核苷酸GGT后面到终止密码子的序列与其他生物比较时，这段序列是高度相似的。在获得到大黄鱼肌动蛋白基因序列时，起始密码子是不确定的，2829之间是一个ATG，9597又是一个ATG，
42、通过DNAMAN软件把这段序列翻译成氨基酸序列时发现，如果是第一个为起始密码子的话，很快就遇到了终止密码子，所以以第二个为起始密码子比较好，之后又通过CLUSTALW（HTTP/WWWEBIACUK/TOOLS）将大黄鱼肌动蛋白基因核苷酸序列与其他物种进行了比较，其他生物也都是以后面那个为起始密码子，所以就确定大黄鱼肌动蛋白基因核苷酸序列中的9597的ATG为起始密码子。在进化树中，各物种间距离的远近代表亲缘关系的远近，用MEGA41软件把大黄鱼（PSEUDOSCIAENACROCEA），金头鲷（SPARUSAURATA），三刺鱼（GASTEROSTEUSACULEATUS），非洲鲫鱼（TIL
43、APIAMOSSAMBICA），青鳉（ORYZIASLATIPES），多线鱼（PLEUROGRAMMUSAZONUS），大西洋鲭鱼（SCOMBERSCOMBRUS），黑鼠（RATTUSRATTUS），褐鼠（RATTUSNORVEGICUS），人（HOMOSAPIENS）10种生物构建的进化树看出，大黄鱼与金头鲷的亲缘关系最近。进化树构建时也是通过核苷酸序列进行的，因为氨基酸序列同源性过高，以至于在很多的真核生物中该基因的氨基酸序列都基本一致，所以通过氨基酸构建的进化树不成功。肌动蛋白基因之所以有那么高的保守性是因为该基因是持家基因，持家基因是维持细胞最低限度功能所不可少的基因，这类基因在所有类
44、型的细胞中都进行表达，因为这些基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。持家基因表达水平受环境因素影响较小，而是在个体各个生长阶段的大多数、或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。目前已克隆的骨骼肌肌动蛋白基因只有人类、牛及少数啮齿类动物等23。近期对肌动蛋白的研究比较多见的是，肌动蛋白的表达在运动过程中的变化，特别是肌动蛋白MRNA的变化，还有一些药物或是某些病对其表达的影响。如王瑞元等24做的一次力竭性离心运动后大鼠骨骼肌肌动蛋白基因表达影响实验发现，大鼠股四头肌肌动蛋白基因表达明显下降。赵中应等25
45、研究发现，理气扶正药能消除运动性疲劳过程中骨骼肌肌动蛋白基因的表达，大鼠运动后恢复期用药组该基因MRNA比运动组高。王高学等26也做可关于哈士蟆油复合药实验，证明该药也有类似效果。一些疾病的话如肾阳虚能抑制该基因的表达。还有事对一些骨骼肌废用性萎缩的研究，如JOANNA等27对大鼠进行去神经、肢体固定、断腱后，发现肌动蛋白量都下降了，PHILIPBABIJ等也做了类似的实验，且结果比较一致。蛋白质是基因表达的产物，其中任何一个环节的改变都可改变蛋白质含量，所以在研究运动对肌动蛋白的影响时，必然要上升到分子的水平去研究。4小结大黄鱼肌动蛋白普遍存在于真核生物中，肌动蛋白是一种具有2个亚基的蛋白质
46、，其主要作用是将肌动蛋白微丝锚定在肌Z线上，该基因是一种在进化中高度保守的蛋白质，这从上面的同源性比较中可以很明显看出。大黄鱼肌动蛋白分子量为362055，含有324个氨基酸，其编码序列高度保守，尤其是10起始密码子后的GGT序列考试到终止密码子区，而非编码区序列差异还是蛮大的。肌动蛋白等电点为535，说明含有的酸性氨基酸比较多。弄清大黄鱼肌动蛋白基因的序列非常重要，它可以为其他的实验和研究提供数据参考，能更好的搞清该基因在机体中的作用。而且目前的自然界，由于各方面的原因，一些物种消失或濒临灭绝，伴随着一些相关基因的消失。海中野生的大黄鱼被大量捕杀，使其遗传多样性大大降低，所以人们现在都在研究
47、很多人工养殖方法，但是人工养殖会伴随着一些不好的结果，如生长缓慢、性成熟提早、亲鱼个体变小及肉质变差等。从分子水平上进行研究，能大大改善这样一种状况，提高大黄鱼的种质和促进资源保护，同时也为其他物种所面临的类似问题提供参考价值。而且本实验的研究对象大黄鱼，它是一种很好的模式生物，将对以后研究其他物种肌动蛋白基因提供很大的帮助，肌动蛋白是细胞骨架的主要成分，参与细胞发育各个进程，在生物学上发挥着很重要的作用，研究该基因具有很大的应用价值和广阔的前景。参考文献1毛勇,蒋秋芬,曾华嵩等大黄鱼线粒体DNA控制区多样性分析J厦门大学学报,2010,4934404442贺淹才肌动蛋白和肌动蛋白基因的研究进
48、展J生命的化学,2002,3222482503黎中宝,方秀,陈锦等大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEA养殖群体遗传多样性的降低J海洋与湖沼,2009,4044464504李兴平,唐国勇运动对骨骼肌肌动蛋白的影响研究评述J吉首人学学报,2007,2861131155任文军骨骼肌肌动蛋白及基因表达与运动的影响J中国组织工程与临床康复,2005,1136723672396张李强网箱养殖大黄鱼J特种经济动植物,2004,136157于凤池EST技术及其应用综述J农业生物技术科学,2005,21254588孙亮先,谢进金,王周英表达序列标签ESTJ泉州师范学院学报自然科学,2002,204757
49、99VANDELOOFJ,BROUNP,TURNERS,ETALANOLEATE12HYDROXYLASEFROMRICINUSCOMMUNISLISAFATTYACYLDESATURASEHOMOLOGPROCNATLACADJSCI,1995,38455910王伟,薛良义,李婷等大黄鱼肌肉组织CDNA全长文库的构建及EST分析J台湾海峡,2010,29218919511许德荣,唐其,梁延海等狼毒大戟CDNA文库构建及EST测序J分子植物育种,2010,8113914412孙升,薛良义,童丽娟大黄鱼GDF8II开放阅读框序列克隆及分析J宁波大学学报,2009,21394213程导军,夏庆友,周泽杨等家蚕CDNA文库构建及大规模EST测序J蚕业科学,2003,29433533914王勇,袁华,刘国磊改进的碱裂解法大规模提取质粒DNAJ数理医学杂志,2010,23551952015J萨姆布鲁克,DW拉塞尔分子克隆实验指南M黄培堂译北京科学出版社,200516孙晓东,韩立敏，王转等质粒DNA提取方法比较J陕西教育学院学报,2009,252868817张昌盛,刘群
