1、本科毕业设计（20_届）大黄鱼垂体肿瘤转化基因克隆及分子特征所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录引言21材料与方法211材料、试剂、仪器2111实验材料2112实验试剂2113主要耗材3114主要仪器312方法3121质粒提取3122EST序列测序3123目的基因的生物信息学分析42结果与分析521大黄鱼PTTGCDNA序列测定522大黄鱼PTTG蛋白序列分析5221大黄鱼PTTG蛋白同源性比较5222系统进化树分析823大黄鱼PTTG蛋白结构分析8231一级结构分析8232二级结构分析83讨论1031EST的应用1032ESTS数据的不足104小结与展望1041小
2、结1042展望10致谢错误未定义书签。参考文献121摘要目的用EST测通大黄鱼垂体肿瘤转化基因（PTTG）CDNA的全长，并利用生物信息学方法对其蛋白一级、二级结构进行模拟分析。方法根据大黄鱼肌肉组织CDNA全长文库，经大规模随机测序及重叠群内EST序列的拼接,获得了PTTG基因全长CDNA序列。多序列比对采用CLUSTALW程序。运用MEGA21软件，采用NEIGHBORJOINING法构建进化树。用EXPASY网站上的SOPMA法预测PTTG蛋白质的一级结构和二级结构。结果测得大黄鱼PTTGCDNA全长1254BP，含有1个155BP的5非编码区（UTR），550BP的3UTR和549BP
3、的开放阅读框（ORF）。整个开放阅读框编码182个氨基酸，预测的相对分子质量为206390DA，理论等电点为868。蛋白二级结构预测显示,该蛋白主要由随机卷曲、延伸链、螺旋和转角组成。结论由PTTG蛋白构建的NJ进化树显示大黄鱼的PTTG蛋白与胡瓜鱼、白斑狗鱼的亲缘关系较近，与人类、牛的亲缘关系都较远。关键词大黄鱼；PTTG；EST；序列分析【ABSTRACT】OBJECTIVETODETERMINETHEFULLLENGTHOFCDNASEQUENCESOFPITUITARYTUMORTRANSFORMINGGENEPTTGFROMPSEUDOSCIAENACROCEABYESTTHEBIO
4、INFORMATICSANDBIOTECHNOLOGYSOFTWAREWASUSEDTOPREDICTTHEPRIMARYSTRUCTURESANDSECONDARYSTRUCTUREOFPTTGMETHODBASEONMUSCLETISSUEFULLLENGTHCDNALIBRARYCONSTRUCTEDSUCCESSFULLYINPSEUDOSCIAENACROCEA,OBTAINFULLLENGTHCDNASEQUENCEOFPTTGGENEBYRANDOMSEQUENCINGONALARGESCALEANDESTSEQUENCESASSEMBLYINACONGTIGCLUSTALWPR
5、OGRAMWASUSEDTOMAKEMULTIPLESEQUENCEALIGNMENTUSINGMEGA21SOFTWARE,THEPHYLOGENETICTREEWASCONSTRUCTEDBYUSINGNEIGHBORJOININGMETHODTHEPRIMARYSTRUCTUREANDSECONDARYSTRUCTUREOFPTTGWEREPREDICTEDUSINGSOPMAONEXPASYWEBSITERESULTSTHEFULLLENGTHOFPTTGCDNASEQUENCEIS1254BP,CONTAININGA5UTRUNTRANSLATEDREGIONOF155BP,A3UT
6、ROF550BP,ANDANORFOF549BPTHEORFSEQUENCEENCODESAPOLYPEPTIDEOF182AMINOACIDSWITHANESTIMATEDMOLECULARWEIGHTOF206390DAANDPIOF868PREDICTIONOFTHESECONDARYSTRUCTUREOFTHEPROTEINSHOWEDTHAT,THEPROTEINWASCOMPOSEDOFRANDOMCOIL,EXTENDSTRAND,ALPHAHELIXANDBETATURNCONCLUSIONBASEDONSEQUENCESOFPTTGPROTEIN,APHYLOGENETICT
7、REEBYNJMETHODINDICATEDTHATPSEUDOSCIAENACROCEAHASAVERYCLOSERELATIONSHIPWITHTHATOFOSMERUSMORDAXANDESOXLUCIU,ANDAREMOTERELATIONSHIPWITHTHATOFHOMOSAPIENSANDBOSTAURUSKEYWORDSPSEUDOSCIAENACROCEAPTTGESTSEQUENCEANALYSIS2引言大黄鱼LARIMICHTHYSCROCEA，属石首鱼科SCIAENIDAE，黄鱼属LARIMICHTHYS，也称黄鱼、大鲜、大黄花等。大黄鱼是群体性洄游鱼类，一般生活在暖温
8、性的近海中下层。我国主要分布在南海、黄海南部和东海。大黄鱼是一种重要的海产经济鱼类。其肉质细腻，味道鲜美，营养丰富，肌肉蛋白质中富含多种氨基酸，是当今人类较为理想的动物蛋白源。大黄鱼可鲜食，也可加工制成水产品，大黄鱼制成的水产品独具特色和风味。此外大黄鱼还有较大的药用价值中医认为黄鱼有和胃止血、益肾补虚、健脾开胃、安神止痢、益气填精之功效；对贫血、失眠、头晕、食欲不振及妇女产后体虚有良好疗效。此外，大黄鱼耳石有清热去瘀、通淋利尿的作用，膘有润肺健脾、补气止血作用，胆有清热解毒功能。垂体瘤转化基因PTTG是一种原癌基因，最初从垂体瘤中分离得到。PTTG不仅在很多肿瘤组织中均显示出高表达，并且在一
9、些正常的增生性组织中也存在表达。PTTG是一种很强的肿瘤转化基因，在大多数肿瘤的发生过程中，PTTG都密切参与肿瘤的发生、发展、侵袭、转移。PTTG通过多种机制参与肿瘤的发生，在促进细胞转化及肿瘤形成中起着重要作用。癌基因与抑癌基因都在肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用。细胞的完全恶性转化是由于一个复杂的调控网络共同作用于肿瘤细胞，这个调控网络的组成为多种癌基因与抑癌基因。通过对PTTG基因进行分子克隆及特征分析，对我们研究肿瘤的发生机制非常有利。若能在核酸甚至是蛋白水平上阻断PTTG的表达，也许能够逆转肿瘤的恶性表型如发生、转移等。随着水产市场的放开，水产品价格大幅度上涨，刺激渔场大肆捕捞，
10、捕捞技术也突飞猛进，导致大黄鱼资源状况从此一蹶不振。过度捕捞使海洋的鱼类资源失去了自我更新的能力，曾经是东海特产的大黄鱼，就此濒临灭绝。此外，产卵地环境的变化也是大黄鱼销声匿迹的重要原因。沿海城市的邻近水域、河口及港湾水域被不同程度地污染，造成水质下降；有机农药、各种废弃物和有害物进入东海；围海造田等海洋工程污染对水流环境的改变对大黄鱼的近海产卵环境造成了影响，使得大黄鱼“逃之夭夭”。同时近海资源遭到严重破坏，进几十年以来发展了大黄鱼的人工育苗技术，因而养殖规模越来越大。研究结果表明长期人工繁殖育种的动物会产生养殖品系的遗传退化，引起某些基因丢失而导致其优良经济性状衰退。目前养殖大黄鱼已出现了
11、一系列问题，如性成熟大大提前、生长过程缓慢和大黄鱼的肉质变差等现象，都会直接影响大黄鱼的年产量、商品价格和销售。所以，通过现代生物学方法改良大黄鱼的遗传背景，从而提高大黄鱼的抗病害能力以及肉质，以达到高产优质的效果，是人们正在着力研究的课题1。1材料与方法11材料、试剂、仪器111实验材料实验材料为80冷藏的大黄鱼肌肉组织CDNA文库菌。112实验试剂1LB培养基TRYPTONE1GYEASTEXTRACT05GNACL1GDDH2O至100ML用1MOL/L的NAOH溶液调节至PH70，121高压灭菌25MIN，冷却至55加入25MG/ML氨苄青霉素溶液200L，4保存备用。TRYPTONE
12、、YEASTEXTRACT、NACL、NAOH和琼脂粉均购于上海生工生物工程3技术服务有限公司；氨苄青霉素购于上海生物工程技术服务有限公司；2质粒提取液IEDTA浓度10MMOL/LPH80，50MMOL/L的葡萄糖，TRISHCL浓度25MMOL/L的PH80，采用高压蒸气锅灭菌15MIN，贮存于40；3质粒提取液IINAOH浓度02MO1/L使用前为10MOL/L贮存液，使用时再稀释，1的SDS；4质粒提取液III285M1的水，乙酸钾浓度为60M15MOL/L，乙酸根的终浓度为5MOL/L，钾离子的终浓度为3MO1/L，5ML冰乙酸；570的乙醇取70ML的无水乙醇加蒸馏水定容到100M
13、L。无水乙醇为AR级，购于宁波奥博科学仪器；6异丙醇采购公司为宁波奥博科学仪器有限公司；有限公司。113主要耗材15ML离心管、各型号枪头均购自江苏省通州市南兴申海玻璃仪器厂。114主要仪器1REVCD13863V型超低温冰箱购于美国的REVCD公司；2吉尔森可调精密移液器PEPETMAN购于法国的GILSON公司；3HZ9211K恒温振荡器购于太仓市科教器材厂；4BIOFUGEFRESCO高速台式冷冻离心机购于美国的SORVALL公司；5DELTA320PH计购于梅特勒托利多仪器有限公司（上海）；6TCL16B高速台式离心机上海安亭科学仪器厂；7LX100手掌型离心机江苏海门市其林贝尔仪器制
14、造有限公司。12方法121质粒提取1将转化后的大肠杆菌接种到LB液体培养基，在37温度下振荡培养，1216小时后长出菌落。2将长出的菌落接种与96孔板上，接着每孔加入1ML的培养物，在37下过夜培养。接着在室温下离心5MIN（3000RPM），然后倒掉上清液，然后倒置晾干。3加SOLUTIONI液200L，封膜，用振荡器振荡充分至板底无沉淀。然后加SOLUTIONII液200L，胶带封口后轻轻颠倒5次勿剧烈振荡。4再加入冷的SOLUTIONIII液200L，胶带封口后也反复颠倒15次。离心20MIN（4000RPM），上清转入另一96孔深孔板中。5每个深孔板孔加异丙醇450L，胶带封口后反复颠
15、倒5次，再离心20MIN（4000RPM），使得DNA沉淀出来。6去掉上清液，加乙醇600L（70），硅胶垫封口后振荡充分，离心5MIN（4000RPM）。7重复上一步的操作。8晾干后用超纯水30L溶解DNA，在20温度下储存备用。9加溴芬兰3L，质粒3L，将6L的混合液体全部点入加样孔进行电泳检测。电压200V，电泳时间为20MIN。122EST序列测序EST即表达序列标签（EXPRESSEDSEQUENCETAGS,ESTS）。随机选择一个CDNA克隆菌，对其进行3端或5端的单一测序。经一轮测序得到CDNA的一个短部分序列，这个序列就代表一个完整基因的一小部分。获得生物体的EST信息通常是
16、先构建其某个代表性组织的CDNA文库。随机对大黄鱼肌肉组织CDNA全4长文库克隆菌的质粒进行EST测序。首先进行第一轮测序，是用载体上的M13的正向通用引物，得到5端的的一轮序列约700BP。然后将测得的EST序列在网上进行BLAST比对，因为不同物种PTTG基因的EST数据具有很大的同源性，就可鉴定出大黄鱼CDNA文库中哪些EST代表PTTG基因。EST测序步骤（）先将文库菌在LB培养基上进行扩大培养。（）随机选取一批大黄鱼肌肉组织CDNA全长文库的克隆菌，提取质粒。先用M13载体上的通用引物M13/PUCSEQUENCINGPRIMER21，5DTGTAAAACGACGGCCAGT3，从重
17、组质粒的5端进行一轮EST的单向自动测序，获得650BP的碱基序列。（3）测出第一次的EST序列后，同网上已有的其它物种PTTG基因的EST数据进行比较。由于不同物种的PTTG基因的EST具有同源性，因而可以初步筛选出哪些EST代表大黄鱼的PTTG基因。（4）初步筛选出大黄鱼PTTG基因的EST后，在已测出的EST序列上设计引物。即在600620BP上设计20BP的引物5D（AGGAACGGAGAGTGGAGAGG），作为下一轮测序的引物，获得654BP的EST。（5）进过两轮自动化测序就可以将大黄鱼肌肉组织CDNA全长文库测通。对每一轮测出的EST进行首尾重复片段拼接，可得到1254BP的完
18、整大黄鱼肌肉组织CDNA序列。123目的基因的生物信息学分析通过NCBI网站（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/）上的BLASTP，对大黄鱼PTTG蛋白与其他物种的同源性比较图，条带越长说明该物种中存在的PTTG蛋白与大黄鱼的PTTG蛋白相似性越大；条带越短说明该物种存在的PTTG蛋白（或存在一种蛋白）与大黄鱼PTTG蛋白的同源性越小。用NCBI网站上的BLASTP，将大黄鱼PTTG基因的氨基酸序列与其它物种进行同源性比较。同时查找了另外十四个物种，用CLUSTALW（HTTP/WWWEBIACUK/）对各物种编码的PTTG蛋白进行同源性比较。参与同源性比较的物种有OSMERUSMO
19、RDAX（胡瓜鱼，ACO092011），SALMOSALAR（大西洋鲑，ACM082661），ANOLISCAROLINENSIS（安乐蜥，XP_0032220151），ICTALURUSPUNCTATUS（斑点叉尾鮰，NP_0011877571），XENOPUSLAEVIS（非洲爪蛙，NP_0010892411），ESOXLUCIUS（白斑狗鱼，ACO144031），ONCORHYNCHUSMYKISS（虹鳟鱼，ACO084941），GALLUSGALLUS（原鸡，XP_4186462），HOMOSAPIENS人类，BAF828281，BOSTAURUS牛，NP_0010400591。通过C
20、LUSTALW（HTTP/WWWEBIACUK/）对各物种编码的PTTG蛋白进行同源性比较。参与比较的物种有PSEUDOSCIAENACROCEA（大黄鱼），OSMERUSMORDAX（胡瓜鱼），SALMOSALAR（大西洋鲑），ANOLISCAROLINENSIS（安乐蜥），ICTALURUSPUNCTATUS（斑点叉尾鮰），XENOPUSLAEVIS（非洲爪蛙），ESOXLUCIUS（白斑狗鱼），ONCORHYNCHUSMYKISS（虹鳟鱼），GALLUSGALLUS（原鸡），HOMOSAPIENS人类，BOSTAURUS牛，MUSMUSCULUS（小家鼠），RATTUSNORVEGICU
21、S（褐鼠），MUSTELAPUTORIUSFURO（雪貂），HYLOBATESLAR（白掌长臂猿）。系统进化树分析是根据同源性状的分歧来评估物种或分子之间的进化关系，以邻位相连法（NEIGHBORJOINING）构建进化树等生物信息学方法分析大黄鱼PTTG基因。我们通过利用CLUSTALX及MEGA21软件来构建系统进化树。以大黄鱼（PSEUDOSCIAENACROCEA）、胡瓜鱼（OSMERUSMORDAX）、大西洋鲑（SALMOSALAR）、安乐蜥（ANOLISCAROLINENSIS）、斑点叉尾鮰（ICTALURUSPUNCTATUS）、非洲爪蛙（XENOPUSLAEVIS）、白斑狗鱼（
22、ESOXLUCIU）、虹鳟鱼（ONCORHYNCHUSMYKIS）、原鸡（GALLUSGALLUS）、人类HOMOSAPIENS、牛BOSTAURUS、白掌长臂猿（HYLOBATESLAR）、小鼠（MUSMUSCULUS）、褐家鼠（RATTUSNORVEGICUS）、雪貂（MUSTELAPUTORIUSFURO）15物种的PTTG蛋白来构建进化树。52结果与分析21大黄鱼PTTGCDNA序列测定经过两轮测序获得PTTG基因CDNA的EST，每轮EST首尾重复片段进行拼接后得到大黄鱼PTTG基因的CDNA完整序列（图1）。大黄鱼PTTG基因的CDNA全长1254BP，其中156704BP为该基因
23、开放型阅读框ORF，ORF长549BP编码182个氨基酸。在北京华大基因公司完成该测序工作，大规模测序采用ABI3730测序仪。用M13的正向通用引物从PTTG基因的CDNA的5端测取。大黄鱼PTTG基因的CDNA序列如下，其中，下划线的核苷酸分别代表起始密码子和终止密码。图1大黄鱼PTTG基因的CDNA序列22大黄鱼PTTG蛋白序列分析221大黄鱼PTTG蛋白同源性比较通过NCBI网站（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/）上的BLASTP，将大黄鱼PTTG基因的氨基酸序列与其它物种进行同源性比较（图2）。得出PSEUDOSCIAENACROCEA（大黄鱼）PTTG蛋白与OSMERU
24、SMORDAX（胡瓜鱼）的同源性最高达到96，与SALMOSALAR（大西洋鲑）同源性达95，与ANOLISCAROLINENSIS（安乐蜥）达94（表1）。显示出大黄鱼PTTG蛋白与胡瓜鱼，大西洋鲑和安乐蜥的PTTG蛋白有较高的同源性。大黄鱼PTTG蛋白与HOMOSAPIENS人类的同源性只有80，与BOSTAURUS牛的同源性最低只有75。说明大黄鱼的PTTG蛋白与人类和牛的PTTG蛋白同源性较低（表1）。通过CLUSTALW（HTTP/WWWEBIACUK/）对15种物种编码的PTTG蛋白进行同源性比较（图3）。参与6比较的物种PSEUDOSCIAENACROCEA（大黄鱼），OSMER
25、USMORDAX（胡瓜鱼），SALMOSALAR（大西洋鲑），ANOLISCAROLINENSIS（安乐蜥），ICTALURUSPUNCTATUS（斑点叉尾鮰），XENOPUSLAEVIS（非洲爪蛙），ESOXLUCIUS（白斑狗鱼），ONCORHYNCHUSMYKISS（虹鳟鱼），GALLUSGALLUS（原鸡），HOMOSAPIENS人类，BOSTAURUS牛，MUSMUSCULUS（小家鼠），RATTUSNORVEGICUS（褐鼠），MUSTELAPUTORIUSFURO（雪貂），HYLOBATESLAR（白掌长臂猿）。可以发现，14种物种与大黄鱼的PTTG蛋白的相似性较高，可能这15种
26、物种的PTTG基因属于同一基因家族。表1大黄鱼PTTG蛋白与其他物种的同源性分析登录号（NCBINO）物种（SPECIES）与大黄鱼PTTG的相似性（PSEUDOSCIAENACROCEA）ACO092011OSMERUSMORDAX（胡瓜鱼）96ACM082661SALMOSALAR（大西洋鲑）95XP_0032220151ANOLISCAROLINENSIS（安乐蜥）94NP_0011877571ICTALURUSPUNCTATUS（斑点叉尾鮰）90NP_0010892411XENOPUSLAEVIS（非洲爪蛙）90ACO144031ESOXLUCIU（白斑狗鱼）89ACO084941ON
27、CORHYNCHUSMYKIS（虹鳟鱼）81XP_4186462GALLUSGALLUS（原鸡）81BAF828281HOMOSAPIENS人类80NP_0010400591BOSTAURUS牛75图2大黄鱼PTTG蛋白PTTG蛋白与其他物种的同源性比较图7深红色的条带说明该物种的PTTG蛋白与大黄鱼的PTTG蛋白同源性分值大于等于200，玫红色的条带说明该物种的PTTG蛋白与大黄鱼的PTTG蛋白同源性分值在80200之间。黑色条带说明同源性分值小于40。图3用CLUSTALW做的15个物种的PTTG蛋白同源性比较图其中“”表示该列氨基酸完全一致，“”和“”表示该列都含有保守氨基酸，其中前者保
28、守性大于后者。8222系统进化树分析系统进化树分析是根据同源性状的分歧来评估物种或分子之间的进化关系，以邻位相连法（NEIGHBORJOINING）构建进化树分析大黄鱼PTTG蛋白。我们通过利用CLUSTALX及MEGA21软件来构建系统进化树（图4）。系统进化树主要分两个进化支链。SALMOSALAR（大西洋鲑），ONCORHYNCHUSMYKIS（虹鳟鱼），ESOXLUCIU（白斑狗鱼），PSEUDOSCIAENACROCEA大黄鱼，OSMERUSMORDAX（胡瓜鱼），ICTALURUSPUNCTATUS（斑点叉尾鮰），XENOPUSLAEVIS（非洲爪蛙），ANOLISCAROLINE
29、NSIS（安乐蜥）这八个物种位于同一分支。GALLUSGALLUS（原鸡）、MUSMUSCULUS（小鼠）、RATTUSNORVEGICUS（褐家鼠）、HYLOBATESLAR（白掌长臂猿）、HOMOSAPIENS人类、BOSTAURUS牛、MUSTELAPUTORIUSFURO（雪貂）这七个物种位于进化树的另一分支。从进化树可以看出不同物种编码的PTTG蛋白存在差异。大黄鱼编码的PTTG蛋白与胡瓜鱼（OSMERUSMORDAX）、安乐蜥（ANOLISCAROLINENSIS）、斑点叉尾鮰（ICTALURUSPUNCTATUS）、非洲爪蛙（XENOPUSLAEVIS）、白斑狗鱼（ESOXLUC
30、IU）的亲缘关系较近，与原鸡（GALLUSGALLUS）、人类HOMOSAPIENS、牛BOSTAURUS、白掌长臂猿（HYLOBATESLAR）、小鼠（MUSMUSCULUS）、褐家鼠（RATTUSNORVEGICUS）、雪貂（MUSTELAPUTORIUSFURO）亲缘关系都较远，均处于不同的分支上。SALMOSALARONCORHYNCHUSMYKISESOXLUCIUPSEUDOSCIAENACROCEAOSMERUSMORDAXICTALURUSPUNCTATUSXENOPUSLAEVISANOLISCAROLINENSISGALLUSGALLUSMUSMUSCULUSRATTUSN
31、ORVEGICUSHYLOBATESLARHOMOSAPIENSBOSTAURUSMUSTELAPUTORIUSFURO964119449910055996378576202图4大黄鱼PTTG蛋白与其他物种的进化树比较23大黄鱼PTTG蛋白结构分析231一级结构分析蛋白质的一级结构是蛋白质多肽链中氨基酸残基的排列顺序。在EXPASYPROTEOMICSSERVER软件上对大黄鱼PTTG蛋白的分子量和等电点进行估算，分别为206390DA和868，氨基酸数量为182个。232二级结构分析蛋白质的二级结构是蛋白质多肽链助于氢键沿一维方向排列成具有周期性结构的构象，是多肽链局部的空间构象，主要包括螺
32、旋、折叠、转角等几种形式，它们是构成蛋白质高级结构的最基本要素。大黄鱼PTTG蛋白二级结构分析图5。9图5大黄鱼PTTG蛋白二级结构其中H代表螺旋，C代表无规则卷曲，T代表转角，E代表随即延伸链。由图5中可以看出，14，2026，5660，7274，9094，98102，107119，167168位氨基酸是即延伸链片段56，105108为氨基酸的构像单元是折叠；711，2747，5355，6172，7584，8689，94，120132，169180位的构像单元是无规则卷曲；1219，4852，56，8586，9597，103104，133166，181182位的氨基酸的构像单元是螺旋。图6大
33、黄鱼PTTG蛋白二级结构中各构象单元所占比例从图6中可以知道大黄鱼PTTG蛋白二级结构中，螺旋占3132，无规则卷曲占4396，折叠占275，随即延伸链占2198。说明大黄鱼PTTG蛋白中以无规则卷曲和螺旋为主。103讨论垂体瘤转化基因PTTG是一种很强的肿瘤转化基因，通过多种机制参与肿瘤的发生，在促进细胞转化及肿瘤形成中起着重要作用。本实验采用EST技术来测通大黄鱼的PTTG基因。基本路线是先提取大黄鱼肌肉组织中的总MRNA，由于MRNA中含有POLYA尾巴，所以用OLIGODT作为引物，加入逆转录酶进行RTPCR合成总的CDNA。接着选择载体PDNRLIB构建大黄鱼肌肉组织CDNA全长文库
34、，进行两轮一次性自动化测序，就是EST序列的产生过程。构建CDNA全长文库的优势只需通过1次阳性筛选，就可以得到基因的全长序列，大大缩短了测通基因全长的时间23。31EST的应用EST的作用表现在1进行基因表达水平的大规模分析。利用差减杂交的CDNA文库和未标准化EST分析某一特定组织的基因表达谱。2EST参与绘制基因图谱。ESTS对绘制人和植物基因组物理图谱构建具有重要作用。EST在构建基因图谱的优点无内含子的存在，在CDNA模板中其PCR扩增产物的大小相同；3UTRS序列的保守性较差，因此容易将单个基因与基因家族成员分开。3EST与基因识别。这是EST技术中最常见的用途。GENBANK中E
35、STS的数据比其它的核苷酸序列多，因此在EST数据库中找到新基因就更容易。可以在同一物种中寻找基因家族的新成员；也可以在不同物种间搜寻功能相同的基因；如今，ESTS数据量正在大规模地递增。32ESTS数据的不足表达基因丰度低就不易获得；由于ESTS没给出完整的序列，即比较短；而且出错率会比较高，因为只是一轮的测序结果，不够精确；有时会有基因组或是核外MRNA来源的CDNA污染；有时出现序列的冗余或是镶嵌克隆，因此所需要处理的数据量很大。4小结与展望41小结本实验对大黄鱼肌肉组织CDNA重组质粒进行EST测序，得到大黄鱼PTTGCDNA序列全长。通过CLUSTALW比对从比较结果可以看出，PTT
36、G基因在不同鱼类中较为保守。42展望PTTG是一种新型的原癌基因。在大鼠垂体瘤细胞中发现的，约396BP的DNA片段，且当时基因库中无同源序列。做成探针后去检测垂体肿瘤细胞，检测到一个高表达的MRNA长约13KB，而在正常垂体细胞中则不表达。后来又在大鼠垂体瘤CDNA文库中分离出一条CDNA克隆，长约974BP的，该CDNA被定义为为垂体瘤转化基因PITUITARYTUMORTRANSFORMINGGENE，PTTG4。胎儿肝细胞组织CDNA文库中也分离出PTTG，称为HPTTG2。进过研究发现HPTTG的基因家族至少含有3个成员HPTTG1、HPTTG2、HPTTG3。且各自定位于染色体的不
37、同位置。HPTTG1有5个外显子4个内含子；HPTTG2及HPTTG3均无内含子，HPTTG与HPTTG1的核苷酸有94的同源性，HPTTG3与HPTTG1的核苷酸有89的同源性。发现HPTTG1、HPTTG2及HPTTG3在多种正常增生性组织和肿瘤组织中表达具有差异性。并发现PTTG在细胞内的分布主要存在于细胞质，部分定位于细胞核。表明这些基因与肿瘤发生有关，肿瘤组织以HPTTG1表达增加为主，因而HPTTG1在肿瘤发生及发展中起着关键性作用56。在促使肿瘤形成的过程中，PTTG通过一系列的反应来诱发肿瘤的形成。PTTG能通过激活原癌基因，11生长因子等致癌。并且PTTG的能诱导细胞转化。一
38、般而言细胞出现完全转化需要2个互补的基因的协同作用，但是，PTTG单独作用即可导致细胞转化，并不需要互补癌基因的协同，显示了强大的细胞转化作用4。另外，PTTG与肿瘤血管生成也密切相关7。研究表明过表达野生型人PTTGWTHPTTG转染到NIH3T3细胞，该NIH3T3细胞体能够产生一种介质WTHPTTGCM，这种介质与人类肿瘤血管的形成分布密切相关。与未转染PTTG的NIH3T3细胞产生的CM相比较，WTHPTTGCM介质引起碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）浓度明显上调。在血管形成的调控中，BFGF起着关键作用。BFGF能促进血管内皮细胞分裂并形成管状结构，还诱导产生血纤维蛋白溶解酶原激活
39、因子，直接诱导血管和毛细血管的形成8。PTTG过表达和非整倍染色体的形成有关,安全子蛋白在有丝分裂期可维持姐妹染色单体的结合。PTTG为SECURIN的人类同源体，能抑制姊妹染色单体分离，干扰细胞的分裂，引起异倍体产生和基因的不稳定性,从而导致原癌基因数量增加和抑癌基因杂合性丢失的积累，细胞出现增生性凋亡失控，肿瘤形成。推测PTTG是由于细胞形成非整倍体，原因在于姊妹染色单体不能分离，导致肿瘤形成910。KIM等11检测过甲状腺癌患者发现，染色体稳定性与PTTG表达有一定的关系。PTTG诱导肿瘤发生的又一重要机制是形成细胞非整倍体。PTTG具有细胞凋亡和染色体非整倍体性的双重作用，同时PTTG
40、能通过阻断了细胞周期诱导细胞凋亡。随着对PTTG研究的深入，发现人的与鼠的PTTG有89的同源性，在大多数正常人体组织如结肠、胰腺、卵巢、大脑等，只有弱表达甚至检测不到，但在多种增生性活跃的组织，如胚胎肝、脾脏、睾丸等存在表达。在目前已经研究到的肿瘤细胞中如肺癌、膀胱癌、肝癌、垂体瘤、白血病、甲状腺癌等中高表达1213。PTTG不仅表达在多种肿瘤中,而且在体内高增殖性的组织中如胸腺亦有高度的活性,但是在大多数的正常组织中则活性低,因而可能成为肿瘤治疗的新的靶点。可采用RNA干扰技术（RNAI），引起靶向PTTG基因发生基因沉默，从而对一些肿瘤进行治疗。RNA干扰可以制造基因沉默的。它利用了由小
41、干扰RNASMALLINTERFERINGRNA，SIRNA引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默SILENCING现象，其本质是SIRNA与对应的MRNA特异结合、降解，从而阻止MRNA的翻译。近年来RNAI在开发应用于肿瘤的治疗方面也显示了良好的前景。如徐松柏等人研究了RNAI沉默PTTG基因对恶性胶质瘤U251细胞的影响。发现PTTGSIRNA表达载体可以特异高效地抑制胶质瘤U251细胞PTTG基因的表达，从而调控肿瘤细胞周期。抑制肿瘤细胞增殖14。来说明PTTG是一种极具潜在价值的肿瘤治疗靶点1417。在胶质瘤细胞系LNT229体外实验中通过对其进行RNAI靶向性干涉，发现一些细胞可增加
42、对肿瘤的识别能力，并且具有溶瘤作用。发现表达沉默可导致胶质瘤侵袭能力及迁移下降18。张方等人研究RNA干扰人PTTG表达对肺癌SPCA1细胞恶性表型的影响。发现人PTTG下调表达可增加SPCA1细胞染色体众数和平均数，伴有减轻染色体结构畸变的趋势；显著抑制SPCA1细胞增殖，增加细胞凋亡。人PTTG可能是肺癌治疗的新靶点。还有研究19证明设计的PTTGSIRNA能有效抑制体外培养PANC1细胞中PTTG的MRNA转录和蛋白表达水平，实现其基因沉默效应。PTTG与人胰腺癌的侵袭能力密切相关，其表达水平下降导致细胞侵袭能力降低20。但同时RNA干扰技术也存在风险，在干扰靶向PTTG基因的同时是否会
43、引起正常基因也同时发生基因沉默还有待更加深入地研究。总而言之，RNA干扰成为治疗肿瘤又一可能性的新方案。同时随着人类垂体肿瘤转化基因的基因组机构和启动子的不断研究，将可以降低PTTG的表达以控制PTTG在人类肿瘤中的表达21。12参考文献1李明云,张海琪,钟爱华大黄鱼基因组DNA的提取及其RAPD分析条件的探索J科技通报,2002,1853683732DELSENYM,COOLEK,RAYNAOLMTHEARABIDOPSISTHALIANACDNASEQUENCINGPROJECTJFEBSLETTER,1997,40332212243佘玮,邢虎成,秦占军,等兰麻茎皮CDNA文库的构建J中国
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47、41842210ORRWEAVERTLPERSPECTIVESCELLCYCLETHEDIFFICULTYINSEPARATINGSISTERSJSCIENCE,1999,285542634434511KIMD,PEMBERTONH,STRATFORDAL,ETALPITUITARYTUMORTRANSFORMINGGENEPTTGINDUCEGENETICINSTABILITYINTHYROIDCELL1JONCOGENE,2005,243048612TFELTHANSENJ,KANUPARTHID,CHATTOPADHYAYNTHEEMERGINGROLEOFPITUITARYTUMORT
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