1、本科毕业设计（20_届）大黄鱼冷冻精子细胞结构损伤的研究所在学院专业班级水产养殖学学生姓名学号指导教师职称完成日期年月2目录引言11材料与方法111实验材料112实验方法1121精子的超低温冻存以及解冻1122鲜精与冻精的活力测定2123鲜精与冻精的活力测定213数据处理22结果与分析221大黄鱼鲜精及冻精的活力222大黄鱼鲜精及冻精的超微结构2221形态结构正常的精子2222形态结构异常的精子23结论3致谢4参考文献43摘要以025ML的麦细管为冻存管、CORTLAND溶液为稀释液，10DMSO为抗冻剂，两步降温法超低温冻存大黄鱼精子，并用透射电镜技术研究了冻精的超微结构损伤。结果显示，大黄
2、鱼冻精的激活率、运动时间及寿命分别为（8700245）、（899024）MIN及（1311065）MIN，冻精的活力与鲜精相比无显著差异。鲜精及冻精在形态结构上均有不同程度的损伤，但损伤程度差异不大，鲜精中有285的精子形态结构异常，冻精中有37的精子形态结构异常。形态结构正常的精子表现为质膜与核膜结构完整、无膨胀现象，轴套、轴丝及中心粒结构正常，线粒体形态完整、嵴较发达。形态结构上损伤的精子表现为质膜破裂、脱落，质膜膨胀，核膜破裂、脱落，核局部受损伤，线粒体膨胀、嵴退化或消失，线粒体移位或脱落。研究表明，CORTLAND溶液加DMSO（10）为抗冻液对大黄鱼精子具有较好的抗冻保护作用。关键词
3、大黄鱼；精子；超低温冻存；精子活力；超微结构ABSTRACTINTHEPRESENTSTUDY,WEHAVEINVESTIGATEDTHECRYOPRESERVATIONOFPSEUDOSIAENACROCEASPERMUSED10DMSOASCRYOPROTECANT,CORTLANDSOLUTIONSASEXTENDERIN025MLSTRAWS,ALSOANALYSEDTHEULTRASTUCTUREOFCRYOPRESERVATEDBASEDONTRANSMISSIONELECTRONMICROSCOPYSCOPYTHERESULTSDEMONSTRATEDTHATTHEREWEREN
4、OSIGNIFICANTDIFFERENCESBETWEENFROZENTHAWEDSPERMANDFRESHSPERMINMOTILITYANDTHEACTIVATIONRATE,MOVINGTIMEANDLIFESPANOFCRYOPRESERVATEDSPERMWERE8700245,899024MINAND1311065MIN,RESPECTIVELYBOTHTHEFRESHSPERMANDCRYOPRESERVATEDSPERMHADSOMEULTRASTRUCTURALDAMAGEINVARIOUSDEGREETHESPERMMAINTAINEDNORMALMORPHOLOGYWA
5、SOBSERVEDASFOLLOWSTHEPLASMAMEMBRANCEANDNUCLEARMEMBRANCEINTACTEDTHESLEEVE,AXONEMEANDCENTRIOLEOBTAINEDNORMALTHEMITOCHONDRIONOBTAINEDINTEGRITYANDTHECRISTAEFLOURISHEDONTHECONTRARY,THESPERMCRYODAMAGESWEREOBSERVEDASFOLLOWSTHEPLASMAMEMBRANCEANDNUCLEARMEMBRANCESWELLEDORDISINTEGRATEDTHENUCLEUSDAMAGEDPARTIALL
6、YTHEMITOCHONDRIONSWELLED,DISLOCATEDORDISARTICULATEDTHECRISTAEDEGENERATEDORVANISHEDKEYWORDSPSEUDOSIAENACROCEASPERMCRYOPRESERVATIONSPERMVITALITYULTRASTRUCTURE1引言精子活力及细胞结构损伤程度是精子质量评价的重要依据，对精子超低温冻存前后的激活率、运动时间及寿命进行测定，并对冻精的损伤程度进行检测分析，有助于了解超低温冻存对精子质量的影响，进而改进或优化精子超低温冻存技术。精子的超微结构损伤观测是冻精损伤程度检测的方法之一，已被应用于红鳍东方鲀
7、（TAKIFUGURUBRIPES）1，海鲈（MORONESAXATILIS）2，西伯利亚鲟（ACIPENSERBAERII）3，美洲大绵鳚（MACROZOARCESAMERICANUS）4，鲤鱼（CYPRINUSCARPIO）、团头鲂（MEGALOBRAMAAMBLYCEPHALA）、鲢（HYPOPHTHALMICHTHYSMOLITRIX）及草鱼（CTENOPHARYNGODONIDELLUS）5，尖吻重牙鲷（DIPLODUSPUNTAZZO）6等鱼类的冻精质量检测中。大黄鱼的精子由头部和尾部鞭毛两部分组成。头部结构较为独特。其腹侧有一较大的细胞核,背部有中心粒复合体。头部的后端是袖套。细
8、胞核的腹面稍向外突出,背面则稍向内凹。细胞核中的染色质浓缩成致密的团块状。团块状的染色质之间分布着松散的纤维状染色质。植入窝位于细胞核的背部表面,由细胞核背面向内凹陷而成,呈一沟状,其走向与精子的长轴平行。中心粒复合体位于植入窝内。近端中心粒的长轴与精子的长轴垂直,基体的长轴与精子的长轴平行。基体的头端呈筒状,由电子致密物质构成,其间分布着少量的微管。基体的尾端,筒状结构分裂成九束。袖套中分布着线粒体和一些囊泡。近袖套内膜的细胞质中存在着一层与袖套内膜平行并且比它薄的膜。尾部从袖套腔中伸出。尾部细长,分为主段和末段。主段的中心结构是轴丝。轴丝外仅有少许细胞质。轴丝与基体的尾端相连。轴丝起始端的
9、结构较为特殊。该处无中央微管对,九组外周二联管仅具雏型,A小管和B小管的管腔呈电子致密状,也无动力蛋白臂附于二联微管之上。在主段的末端,构成轴丝的微管螺旋成篓状结构。一小部分微管从篓状结构延伸进入末段。鱼类精子长期冷冻保存的研究和探索,不仅对进一步理解基本的生命进程具有重要意义,而且对鱼类新品种培育和鱼类养殖业也将产生巨大的深远影响。众所周知,由于低温能抑制生物体内的生化反应,因而在长期保存时不发生变异,而且不需要复杂的温度和湿度调节。鱼类精子超低温冷冻保存的研对于鱼类种质资源,尤其是对于那些濒危、珍稀鱼类的种质资源能起到有效的保护作用,同时也可使生物多祥性得到保护。鱼类精子长期冻存的实现对鱼
10、类种质保存和优良品种的培育具有决定性的影响。首先,鱼类精子的长期冻存可被广泛应用于优良鱼类种质资源的保存。目前,许多国家的学者正在对一些重要经济鱼类和濒临灭绝鱼类的精子进行冷冻保存研究以求建立这些鱼类的精子库,达到保护和保存这些鱼类资源的目的。其次,鱼类精子的长期冻存可以解决鱼类育种过程中的诸多实际问题,如满足不同地区对不同鱼类品系精子量的需求、克服杂交育种中不能自然交配的困难、解决人工繁殖过程中所遇到的雌雄亲鱼成熟时间差、扩大杂交组合的选择范围等。大黄鱼（PSEUDOSIAENACROCEA）是中国名贵海产经济鱼类及东南沿海重要的养殖种。开展大黄鱼精子的超低温冻存，建立优良种质的精子库，是种
11、质保存的有效途径，并在育种生产上具有应用价值。有关大黄鱼精子的超低温冻存及冻精损伤的研究已见报道，如林丹军和尤永隆以甘油及DMSO为抗冻剂超低温冻存大黄鱼精子获得成功；林丹军等在亚显微水平上检测了以20甘油为抗冻剂的大黄鱼冻精的超微结构损伤8，但以DMSO为抗冻剂、超低温冻存大黄鱼精子的超微结构损伤的研究未见报道。本研究，以025ML的麦细管为冻存管、CORTLAND溶液为稀释液，10DMSO为抗冻剂，两步降温法超低温冷冻大黄鱼精子，并用透射电镜观察了冻精的超微结构损伤，旨在为大黄鱼精子超低温冻存技术的改进及冻精质量的评价提供参考。1材料与方法11实验材料实验用大黄鱼亲鱼于2010年3月取自浙
12、江象山港湾苗种繁育中心育苗场，挑选性成熟度好的雄鱼10尾，个体重500800G，供实验用。12实验方法121精子的超低温冻存及解冻先将精液稀释液（CORTLAND溶液NACL725G/L，KCL038G/L，CACL2018G/L，NAHCO3100G/L，MGSO47H2O023G/L，NAH2PO42H2O041G/L，C6H12O6100G/L，PH700）与抗冻2剂（DMSO）按一定比例混合配制成抗冻液，置于冰箱（4）预冷，然后进行采精。用洁净的毛巾擦干大黄鱼生殖孔周围体表，轻压鱼腹使精液自然流出，获得无尿污的精液于培养皿中，置于冰浴上。将采得的精液与抗冻液按13比例混匀成精液稀释液混
13、合物（使DMSO占10），于4下平衡1015MIN。将平衡过的精液稀释液混合物分装入体积为025ML的麦细管中（每支装约02ML），用自制简易降温装置两步降温法超低温冻存精子，解冻时将麦细管从液氮中快速取出，于40水浴中摇动溶化。122鲜精与冻精的活力测定按江世贵等的方法测定鲜精与冻存15D后精子的活力（激活率、运动时间及寿命）。精子的激活率指精液与激活液（盐度27的过滤海水）混合后，于显微镜下观察运动精子的数量占全部精子数量的百分比，精子的运动时间指精子自激活开始至90的精子原地颤动为止的时间，精子的寿命指精子自激活开始至90的精子停止运动所经历的时间。实验重复3次。123鲜精与冻精的超微结
14、构观察取鲜精与冻融精液，用25的戊二醛（4）固定12H，然后用1锇酸（4）后固定12H，乙醇梯度浓度脱水，EPON812环氧树脂渗透、包埋，LKB型超薄切片机切片，经醋酸铀和柠檬酸铅染色后，在日立H7650型透射电镜下观察与拍照。在鲜精及冻精的电镜观察过程中，随机观察200个精子的形态结构，统计形态结构正常及异常精子的比例。13数据处理试验数据分析采用SPSS115完成，统计结果以平均值与标准差（X_SD）表示。2结果21大黄鱼鲜精及冻精的活力鲜精及超低温冻存15D后的大黄鱼精子的活力（激活率、运动时间及寿命）测定结果见表1。统计分析表明，鲜精与冻精的活力相比差异不显著（P005）表1大黄鱼鲜
15、精及冻精的活力（N3，X_SD）TABLE1RHUBARBFINESEAFOODANDTHEVITALITYOFFROZENSEMENN3,X_SD大黄鱼PSEUDOSIAENACROCEA激活率（）ACTIVATIONRATE运动时间（MIN）MOVINGTIMEMIN寿命（MIN）LIFESPANMIN鲜精91002589330491396102冻精8700245899024131106522大黄鱼鲜精及冻精的超微结构鲜精及冻精的超微结构观察表明，鲜精中有285的精子形态结构异常，冻精中有37的精子形态结构异常。221形态结构正常的精子大黄鱼精子结构上由头部与尾部组成。头部主要是细胞核，有
16、背腹面之分，核位于腹面；近、远端中心粒位于核背面，远端中心粒向后延伸出轴丝；头部后端为袖套，中央是轴套腔及轴丝，轴套内的线粒体排列成环形；精子尾部为细长的鞭毛，由“92”微管结构的轴丝外包质膜构成（图版I1，5，6，7）。电镜观察显示，大黄鱼鲜精及冻精中形态结构正常的精子表现为质膜与核膜结构完整、无膨胀现象，轴套、轴丝及中心粒结构正常，线粒体形态完整、嵴较发达（图版I18）。222形态结构异常的精子鲜精和冻精中精子形态结构异常表现在质膜、核膜及核内部结构、线粒体外膜及内嵴、尾部鞭毛结构等的变异上。3精子质膜结构异常体现在质膜间断破裂、脱落（图版II1，3，5，8），质膜整体或局部膨胀、脱离核周
17、及线粒体（图版II2，4，6），核外周的质膜全脱落（图版II7）。精子核膜结构异常体现在核膜间断或局部破裂、脱落（图版II1，3，5，6，8）；核内部结构异常表现为核局部受损伤、染色质变松散（图版II6）；线粒体结构异常表现为线粒体外膜破裂，线粒体膨胀、嵴退化或消失，线粒体移位或脱落（图版II1，2，59）；鞭毛结构异常表现为包被在轴丝外周的质膜膨胀或脱落（图版II1013）。3结论试验表明，以CORTLAND溶液为稀释液、10DMSO为抗冻剂，两步降温法超低温冻存大黄鱼精子后的活力与鲜精相比下降不明显。鲜精及冻精均有一定比例的精子形态结构上有不同程度的损伤，表现在质膜破裂、脱落，质膜膨胀，核
18、膜破裂、脱落，核局部受损伤，线粒体膨胀、嵴退化或消失，线粒体移位或脱落。精子质膜及膜性细胞器对外环境变化十分敏感，在外环境突变（如冻存等）的情况下容易受到损伤；但精子的细胞核及尾部的非膜性结构的抗冻伤能力较强，不容易受损伤。林丹军等以20甘油为抗冻剂、液氮快速冷冻大黄鱼精子，电镜观察冻融精子有部分形态结构出现异常，畸形率达2913，精子结构异常体现在质膜膨胀或破损、核膜消失、染色质解体、线粒体嵴消失、轴丝断裂成许多段等等，与本研究的大黄鱼冻精损伤情况类似。于海涛等以10DMSO为抗冻剂，分段冷冻法保存红鳍东方鲀精子，液氮中保存24H后解冻，电镜观察受损伤的精子的被膜膨胀、破裂、脱落，线粒体内嵴
19、变形、结构模糊甚至消失，鞭毛断裂或被膜膨胀脱落，导致精子活力下降。章龙珍等以18甲醇为抗冻剂，两步降温法液氮中保存西伯利亚鲟精子，冻精中有3015的精子超微结构上受到不同程度损伤，表现为顶体受损、内容物丢失，核膜囊泡化，核膜断裂，核内出现空泡，线粒体内嵴弥散，线粒体脱落，鞭毛外膜松弛与鞭毛脱离等。赵维信等用扫描电镜观察了以10DMSO为抗冻剂冻存的鲤鱼及团头鲂精子形态结构变化，经过冷冻的精子，一部分形态结构完好，头尾部轮廓清晰；另一部分形态结构上受损伤，表现为精子头部略微胀大，表面呈现凹凸不平，或头部膨大呈现泡状化，严重损伤者头部外膜破裂，头部内含物外溢；精子尾部外膜破裂，或精子尾部断落缺损等
20、。可见，尽管研究者研究的鱼的种类及采用的冻存条件不同，但冻精损伤主要集中在膜系统的损伤上。一般认为，导致冻精细胞结构改变的主要原因是细胞内冰晶的机械损伤及细胞外冰晶的渗透压或挤压作用虽然抗冻液稀释液抗冻剂对精子冷冻与解冻过程具有保护作用，但冻融精子仍然会发生一定程度的细胞结构损伤，尤其是膜性结构的损伤。细胞膜结构的损伤导致膜蛋白丢失或蛋白构象改变，细胞内物质渗漏、PH值变化、生理活动紊乱，影响细胞内外离子交换及精卵识别与受精。线粒体是精子运动的动力源，本研究发现，大黄鱼冻精中部分精子线粒体受损伤，其生理功能下降甚至丧失，这部分精子活力必然降低甚至失活；核膜及核内部结构的损伤会影响核遗传稳定性1
21、3，本研究发现，大黄鱼冻精受损伤的精子中有少部分精子核结构形态改变，是否会引起DNA断裂或突变，需进一步研究；尾部鞭毛是精子运动的重要细胞器，精子的运动必须依靠尾部鞭毛轴丝内微管的协调滑动和线粒体的供能作用，本研究发现，冷冻精子轴丝内微管结构未见明显改变，说明超低温冻存对微管结构的影响不明显。精子稀释过程及超低温冷冻及解冻过程都会造成精子超微结构损伤。LHANSTEINERD对超低温冻存后的茴鱼（THYMALLUSTHYMALLUS）精子结构损伤的研究后认为，精子稀释时会发生形态结构上的损伤，冷冻后精子质量明显下降，大约4050的精子结构不同程度的损伤，精子结构上保持完整性的比例占1020。B
22、ALLARD等研究了稀释液及超低温冷冻过程对虹鳟精子超微结构的损伤，研究发现，精子稀释时精子结构会发生较小的变化，精子冷冻后精子细胞结构发生显著的变化。为防止冷冻精子细胞结构损伤，抗冻液（稀释液加抗冻剂）的选择显得尤为关键。本研究表明，CORTLAND溶液加10DMSO为抗冻液对大黄鱼精子的超低温冻存具有较好的抗冻保护作用，大黄鱼冻精与鲜精的活力及细胞结构损伤程度差异不大，冻精损伤主要集中在膜系统的损伤上。今后应结合高效液相色谱技术分析冷冻前后大黄鱼精子膜系统成分的变化，以便探讨超低温冻存精子细胞膜性结构损伤的机制。4参考文献1于海涛,张秀梅,陈超,等红鳍东方鲀精子超低温保存前后的超微结构观察
23、J海洋科学,2007,31217192HEDYEWOODSLCCHANGESINMOTILITY,ULTRASTRUCTURE,ANDFERTILIZATIONCAPACITYOFSTRIPEDBASSMORONESAXATILISSPERMATOZOAFOLLOWINGCRYOPRESERVATIONJAQUACULTURE,2004,2366776863章龙珍,刘鹏,庄平,等超低温冷冻对西伯利亚鲟精子形态结构损伤的观察J水产学报,2008，3245585654YAOZ,CRIMLW,RICHARDSONGF,ETALMOTILITY,FERTILITYANDULTRASTRUCTURALC
24、HANGESOFOCEANPOUTSPERMAFTERCRYOPRESERVATIONJAQUACULTURE,2000,18136113755赵维信,姜仁良,刘修英,等几种鲤科鱼类精子和胚胎冷冻损伤的扫描电镜研究J淡水渔业,1992,5356TADDEIAR,BARBATOF,ABELLIL,ETALISCRYOPRESERVATIONAHOMOGENEOUSPROCESSULTRASTRUCTUREANDMOTILITYOFUNTREATED,PREFREEZING,ANDPOSTTHAWEDSPERMATOZOAOFDIPLODUSPUNTAZZOCETTIJCRYOBIOLOGY,20
25、01,422442557林丹军,尤永隆大黄鱼精子生理特性及其冷冻保存J热带海洋报,2002,21469758林丹军,尤永隆,陈炳英大黄鱼精子冷冻复苏后活力和超微结构的变化J福建师范大学学报自然科学版,2006,22371769殷秀玲,雷建章,康文华人精子冷冻复苏后活动力和超微结构变化J河北医学院学报,1993,143747810LAHNSTEINERF,BERGERB,WIESMANNT,ETALCHANGESINMORPHOLOGY,PHYSIOLOGY,METABOLISMANDFERTILIZATIONCAPACITYOFRAINBOWTROUTSEMENFOLLOWINGCRYOPRE
26、SERVATIONJTHEPROGRESSIVEFISHCULTURIST,1996,5814915911FUIKAWAS,MIURAKPLASMAMEMBRANEULTRASTRUCTURALCHANGESCAUSEDBYMECHANICALSTRESSINTHEFORMATIONEXTRACELLULARBASIDIOMYCETESJCRYOBIOLOGY,1986,2337138212李赟,贺桂珍,王品虹超低温保存前后太平洋牡蛎精子超微结构观察J青岛海洋大学学报，2002，32452653213KOPEIKAJ,KOPEIKAE,ZHANGT,ETALEFFECTOFDNAREPAIRI
27、NHIBITOR3AMINOBENZAMIDEONGENETICSTABILITYOFIOACHEMBRYOSDERIVEDFROMCRYOPRESERVEDSPERMJTHEIROGENOLOGY,2004,6191661167314于德新,尤国才,徐正铨冷冻保存的人类精子超微结构变化J男性学杂志,1995,9314815115BALLARDRULTRASTRUCTUREOFTROUTSPERMATOZOACHANGESAFTERDILUTIONANDDEEPFREEZINGJCELLTISSUERES,1983,22820521816LAHNSTEINERF,WEISMANNT,PATZN
28、ERRAFINESTRUCTURALCHANGESINSPERMATOZOAOFTHEGRAYLING,THYMALLUSTHYMALLUS,DURINGROUTINECRYOPRESERVATIONJAQUACULTURE,1992,103738417郑跃平,刘鉴毅,谢从新等温度对中华鲟精子卵子短期保存的影响J吉林农业大学报,2006,28668268618KOPEIKAJ,KOPEIKAE,ZHANGT,ETA1EFFECTOFDNAREPAIRONGENETICSTABILITYOFIOACHEMBRYOSDERIVEDFROMCRYOPRESERVEDSPERMJTHEIROGENOL
29、OGY,2004,61916611673519黄巧珠,区又君,喻达辉PH对4种鲷鱼精子活力的影响J湛江海洋大学学报,1999，19（3）141620柳凌，刘宪亭，章龙珍等鱼类、水生生物配子及胎盘在低温下保存研究进展J淡水渔业,1997，273131721黄晓荣,章龙珍,乔振国抗冻剂对日本鳗鲡精子活力及运动时间的影响J海洋渔业,2007,29（3）19319922谭娟,张耀光,刘本祥等中华倒刺鲃、白甲鱼和岩原鲤精子的生理特性比较J淡水渔业,2006，36（6）3723赵钦,陈校辉,潘建林黄颡鱼精子低温保存方法的初步研究及应用J水产科学,2008,27（12）61561824闫文罡,章龙珍,日本黄
30、姑鱼精子生理特性及超低温冷冻保存研究J海洋渔业,2008,30214515125黄晓荣,章龙珍,庄平等超低温冷冻对日本鳗鲡精子酶活性的影响J海洋渔业,2008,34（4）297302图版IFIGI6图版I说明1精子纵切，示核及线粒体结构正常，核膜及质膜完整；2精子头部横切，示核形态正常、核膜、质膜完整；3精子头部横切，示核及近端中心粒结构正常、核膜、质膜完整；4精子头部横切，示核、轴套、轴丝及线粒体结构正常，核膜、质膜完整；5精子头部横切，示线粒体、轴套结构正常，质膜完整；6精子尾部鞭毛纵切，示轴丝结构正常，质膜完整；7精子纵切，示近、远端中心粒结构正常，质膜完整；8精子尾部鞭毛纵切，示“92
31、”轴丝结构正常，质膜完整（图1、图4、图5、图7为鲜精，图2、图3、图6、图8为冻精）7图版IIFIGII图版II说明1精子头部纵切，示质膜及核膜间段破裂、脱落，线粒体外膜破裂、嵴退化；2精子头部斜切，示质膜全部膨胀，线粒体移位；3精子头部横切，示质膜及核膜间段破裂、脱落；4精子头部横切，示质膜局部膨胀；5精子头部横切，示质膜及核膜间段破裂、脱落，线粒体膨胀、嵴退化；6精子头部横切，示质膜全部膨胀，核膜破裂脱落，核受损伤，线粒体移位、嵴退化；7精子头部横切，示线粒脱落；8精子头部横切，示质膜、核膜破裂，线粒体膨胀、嵴退化；9精子头部轴套横切，示线粒体膨胀、嵴退化；10精子鞭毛横切，示轴丝外质膜消失；1112精子鞭毛横切，示轴丝外质膜膨胀；13精子鞭毛纵切，示质膜膨胀，但微管结构正常。8
