1、,实验八 产淀粉酶菌种的鉴定,实 验 目 的,1.了解微生物分类与鉴定中的基本程序和常规实验技术与方法；2.熟悉16S rRNA基因PCR扩增进行细菌鉴定的基本原理并初步掌握PCR的操作技术；3.初步学会网上的有关网站的微生物资源信息和数据库的使用并利用其进行细菌鉴定分析。,实 验 原 理,细菌分类鉴定的方法：形态学特征的鉴定生理生化特征的鉴定分子特征的鉴定,形态学的鉴定,固体平板菌落，固体斜面，液体的培养特征；显微镜下的细胞形状，革兰氏染色反应，抗酸性染色，是否具有芽孢（芽孢在细胞内的位置）、荚膜和鞭毛（鞭毛着生的位置）等。,分子鉴定,16SrDNA 是编码原核生物核糖体RNA小亚基16Sr
2、RNA 的基因，与细菌整个基因组的变化相比，它具有高度的保守性，其变化的概率与细菌的变异和进化程度是一致的，所以有助于细菌的鉴定和分类。结合完善的数据库，16SrDNA 序列分析可以快速准确的对细菌进行种属鉴定，确定细菌在进化中的位置。16SrDNA 序列包含10个可变区和与之相间的11个恒定区。根据恒定区的保守性可以设计出细菌的通用引物，并且扩增出所有细菌的16SrDNA 片段。可变区因细菌而异，能够揭示生物物种特征核酸序列，是种属鉴定的分子基础。扩增细菌的16SrDNA 基因需要其染色体DNA 作为模板进行PCR， 可以提取细菌染色体DNA 作为模板，也可以直接挑取平板上经过活化的菌落做P
3、CR 以达到快速简便的目的。,PCR的原理和步骤,原理 PCR是一种由引物介导的选择性体外扩增DNA的方法。步骤1. 变性（Denature）：目的双链DNA片段在95下解链；2. 退火（Anneal）：两种引物在适当温度（59 左右）下与模板上的互补序列通过氢键配对；3. 延伸（Extension）：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。 由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些合成的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25-35轮循环就可使DNA扩增达106 倍。,琼脂糖凝胶电泳的原理,原理： 带电颗粒在电场的作用下，
4、向着与其电性相反的电极泳动的现象。 在本实验中，DNA分子带负电荷，向正极泳动。影响泳动率的因素： 电荷效应和分子筛效应（即DNA分子本身的大小和构型）。 在本实验中，分子量越小，泳动越快。,实验器材,1. 产淀粉酶的待检菌的平板菌落（提前24小时划线接种）；2. 革兰氏染色全套试剂，载玻片，酒精灯，接种环，光学显微镜；3. PCR反应试剂：Taq酶，反应缓冲液，dNTP，16S rRNA 基因上下游引物，模板（菌落）；4. 琼脂糖，溴化乙锭，凝胶电泳仪，水平电泳槽，紫外检测灯，TAE电泳缓冲液；5. 微量移液枪，枪头，PCR管，PCR仪。,实验步骤,（一）提前24h进行菌种活化 1.提前一天
5、挑取单菌落，划线淀粉培养基平板一块（二）产淀粉酶待检菌的培养特征与形态特征观察与鉴定 1.培养特征的观察：菌落形状与大小，边缘，表面，隆起形状，透明度，菌落与培养基颜色等； 2.细菌的革兰氏染色：按照实验二的操作方法进行（设立标准的革兰氏阳性和阴性菌为对照）。 3.细菌细胞的显微观察：细胞形状是杆状（长杆或短杆）还是球状？有无芽孢？,（三）菌种保藏,从淀粉划线平板上挑取PCR的单菌落，转接固体斜面试管一支，至30培养24h.,用灭菌白枪头在一平板单菌落边缘挑取少许菌体，刮蹭于PCR管壁底部。 反应体系：在一个PCR管中用微量移液枪加入下列物质的混合液25l，置于冰上备用。 Taq buffer
6、（10） MgCl2（25mM） dNTP（2.5 mM） Primer Forward（50 mM） Primer Reverse（50 mM） rTaq（2U/l） ddH2O 震荡，将菌体和反应体系充分混匀 PCR反应条件：95预变性5 min后，95变性1 min，59退火1min，72延伸2min，共25个循环，72延伸10min, 4 保存。,混合液25l,（四）细菌的16S rRNA分子鉴定,（五）琼脂糖凝胶电泳（下次实验做） 1.制胶：配制1%琼脂糖溶液20mL，用1TAE电泳缓冲液做溶剂，加热溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待胶凝固； 2.制样：PCR反应结束后，取出PC
7、R管，用微量移液枪吸取5ul与1ul 6样品Buffer混合后全部点入浸于TAE电泳缓冲液中的琼脂糖凝胶的样品孔中; 3.电泳：100V电泳20分钟； 4.染色：将凝胶置于样品染料溴化乙锭中染色；10min，然后将凝胶置于紫外灯下进行检测，当在凝胶上出现预期大小的DNA条带（约1.5Kb），则认为是PCR阳性，这时将与此电泳样品对应的PCR反应管放置冰箱短期保存。,（六）PCR扩增片段测序 获得的PCR阳性样品由专人送往测序公司进行测序，大约一周后测序结果可以返回，然后在电脑的相关软件上进行读序。（七）序列比对分析 使用NCBI 网站对待测菌的16SrDNA 序列与数据库中各种菌的16SrDN
8、A 序列进行比对。登陆http:/www.ncbi.nlm.nih.gov 美国国立生物技术信息中心网站，使用BLASTn 在GeneBank+EMBL+DDBJ+PDB 基因库中进行同源性搜索。从Genebank 中选择近与待测菌目的基因序列同源性最高的已知分类的菌株的16SrRNA基因序列, 初步确定待测菌的分类位置。用Clustal软件将已知分类菌株的16SrRNA序列与待测菌的16SrRNA序列进行多序列比较。,http:/www.ncbi.nlm.nih.gov,实验结果记录,1.描述你所分离菌的形态学特征：菌落特征，细胞形态和革兰氏反应等结果；2.根据PCR产物的测序以及网上比对的结果，分离菌可以归类到哪一种菌？,
