1、本科毕业设计（20_届）福尔马林固定大黄鱼的DNA提取方法的探索所在学院专业班级水产养殖学学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录引言51材料与方法511试验材料512试验方法错误未定义书签。121第一组处理方法错误未定义书签。1211样品的预处理错误未定义书签。1212基因组DNA的提取错误未定义书签。122第二组处理方法错误未定义书签。1221样品的预处理错误未定义书签。1222DNA的提取错误未定义书签。123第三组处理方法错误未定义书签。1231样品的预处理错误未定义书签。1232DNA的提取错误未定义书签。2结果与分析721中性缓冲液对结果的影响722梯度酒精处理对结果的影响723与
2、新鲜材料提取的比较73讨论831从福尔马林溶液中提取DNA的制约条件8311福尔马林的浓度及PH对DNA提取的影响8312标本保存的时间对DNA提取的影响8313标本保存的温度对DNA提取的影响932结语9摘要从福尔马林保存的标本中提取DNA，其质量可能会受到许多种因素的影响，如保存过程中福尔马林溶液的温度、PH等因素；还有可能是从动物死亡到放进福尔马林溶液中耽搁的时间过长。笔者在探索从福尔马林固定的大黄鱼中提取可以用于遗传分析的DNA时，参考前人研究从福尔马林固定的标本中提取DNA进行的试验时所改进的试验条件，对自己所用方法进行改进。关键词福尔马林；大黄鱼；DNA提取ABSTRACTFORM
3、ALINPRESERVEDSPECIMENSFROMTHEEXTRACTEDDNA,ITSQUALITYMAYBEAFFECTEDBYMANYKINDSOFFACTORS,SUCHASTHEPRESERVATIONPROCESSOFFORMALINSOLUTIONTEMPERATURE,PHANDOTHERFACTORSTHEREMAYBEDEATHTOPUTWELFAREFROMANIMALERMALINSOLUTIONTOOLONGDELAYEDTHEAUTHOREXPLOREDFROMFORMALINFIXEDLARGEYELLOWCROAKERCANEXTRACTDNAFORGENET
4、ICANALYSIS,THEREFERENCETOPREVIOUSSTUDIES,FORMALINFIXEDSPECIMENSFROMTHEEXTRACTEDDNATESTSCONDUCTEDBYTHEIMPROVEDEXPERIMENTALCONDITIONS,THEIRTHEMETHODISIMPROVEDKEYWORDFORMALINCURRENTRESISTENCEEXTRACTINGDNA引言在分子生物学的研究中，获取足够的含有遗传信息的生物样本是首先要做到的。理想的情况自然是能够在自然界中获得足够的鲜活样本。但在实际的工作当中，要想获得足够的样品是非常困难的，比如对种群小、濒危、分
5、布区狭窄的动物来说，采集到足够的样本是不太现实的；况且有些研究还需要从以前保存的样品中提取的DNA。因此，怎样从馆藏标本中得到需要分析的遗传物质，成为了分子生物学研究亟待解决的问题。第一，馆藏标本是经过研究人员多年的积累，标本收藏比较齐全，可以通过花费少量的人力、物力就可以得到分子系统学研究所需样品；其次，可以减少对现有动物的干扰，尤其对濒临灭绝的珍稀动物是极为重要的；第三，通过对馆藏标本中遗传物质的研究，可以排除由于遗传物质的转移、物种迁徙等引起的系统分析的混乱。而且，从标本的类型来讲，模式标本、地膜标本等在遗传系统学的研究中的作用差别很大，前者也更具有说服力。所以,如能从馆藏标本中直接得到
6、实验样品,将对动物系统学的研究极大的意义。DNA的分离和纯化是分子生物学研究中极为重要的基础技术,现在已经探索出的DNA提取与纯化方法一般只能适用于新鲜的动物组织,当然对于一些较为特殊的材料的DNA提取已找出一些对应的方法,可是对于长期保存在福尔马林中的生物标本基因组DNA的提取至今还是一个需要解决的问题。福尔马林作为生物标本的保存液,其优点在于渗透力强、防腐杀菌效果好、固定速度快,而具有可以快速杀死生物细胞来固定生物大分子的功能。因此，在过去的许多年中,世界各国生物学家采集的大量生物标本都保存于福尔马林中,也正是这些标本在研究系统进化、物种起源、特定物种基因资源保护和生物多样性等方面课题时做
7、出了巨大的贡献。如果不能提取足够的DNA,就会给从分子水平上研究这类生物带来很大的障碍。从福尔马林保存的标本中提取的DNA，其质量可能会受到许多种因素的影响。福尔马林会导致DNA与蛋白质之间、蛋白质与蛋白质之间、DNA与DNA之间的交联,标本在福尔马林中保存的时间以及保存温度,保存样本的大小及部位等都可能会导致提取的标本DNA质量下降,从而使PCR扩增产物的生成及后续的分子生物学分析变得相当困难。可也有研究者认为,在福尔马林中保存的标本含有的DNA数量实际上要明显多于在酒精中保存的标本。原位杂交实验表明核酸在福尔马林并没有消解,只是变得难以提取。为了让标本中DNA的质量能够达到PCR成功扩增的
8、要求,很多研究者都尝试着完善和优化从福尔马林保存标本中提取DNA的方法。本试验也奔着这个目标主要从预处理方面进行了改进和对比。1材料与方法11试验材料试验材料是保存在福尔马林中的野生大黄鱼腹部肌肉和骨骼。取自宁波大学生命科学与生物工程学院实验室，大黄鱼于1989年放入福尔马林溶液中。12试验方法取浸泡于福尔马林溶液中的大黄鱼肌肉标本适量，用无菌剪刀剪碎后均分为三组，记为第一、第二、第三组。然后将这三组分别进行以下处理121第一组处理方法1211样品的预处理（1）将第一组样品置广口称量瓶中，用70乙醇冲洗2次。（2）用灭菌牙签将组织分成03CM3左右的小块，分装在几只15ML灭菌离心管中。（3）
9、接下来按照以下程序进行处理PBS磷酸盐缓冲液缓冲液处理24H70乙醇处理12H无水乙醇处理12H1/2PBS处理24H灭菌水清洗1次GTE甘氨酸缓冲液处理24H1/2PBS处理24H灭菌水清洗1次最后用蒸馏水清洗至少3次，弃去处理液并用滤纸吸水备用。1212基因组DNA的提取（1）将已经预处理的标本组织分别置于15ML离心管中，在每只离心管中先加入600LDNA抽提缓冲液，机械碎裂组织块直至粉末状，颠倒混匀后放于37水浴锅里水浴1H。（2）取出离心管，每只各加1520L蛋白酶K浓度为L0G/L，然后55水浴，消化3H甚至过夜，其间应不时混匀。（3）加入等体积TRIS饱合酚,温和摇动10MIN；
10、10000RPM，4离心10MIN，将上清液转移至另一只干净离心管中，加入等体积TRIS饱合酚再抽提12次。（4）然后加入等体积酚氯仿11抽提和氯仿抽提各1次。（5）上清液用无水乙醇20沉淀DNA约30MIN。（6）70乙醇漂洗2次。无水乙醇沉淀5MIN,4稍离心。（7）室温干燥后用适量无菌水溶解DNA，标记为第一组，然后置于70低温冰箱保存备用。122第二组处理方法1221样品的预处理（1）取第二组样品，用PBS溶液仔细冲洗,用灭菌的吸水纸将其揩干,于超净工作台内用无菌剪刀将其剪成50MG的小块。（2）放入PBS液浸泡1224H后再转入70的乙醇中浸泡1224H。（3）依次换入下列梯度酒精中
11、处理80乙醇,2H,重复一次90乙醇,2H,重复一次95乙醇,2H,重复一次无水乙醇,1H,重复一次然后将材料放入1/2倍的PBS液中浸泡12H,其间更换一次溶液。1222DNA的提取（1）将预处理后的样品组织加入消化缓冲液400L进行56消化。消化缓冲液为TRIS10MMOL/L，EDTA1MMOL/L，SDS1，DTY20MMOL/L，蛋白酶K20L20MG/ML。（2）24H后视组织消化程度再加蛋白酶K适量，消化时间也适当延长，直至组织消化较彻底，此过程中要不时缓慢颠倒混匀以利于充分消化。（3）之后进行DNA常规酚氯仿抽提纯化，再加入1/10体积3MOL/L醋酸钠和两倍体积无水冷乙醇20
12、沉淀10H以上，沉淀经70乙醇洗涤、室温干燥后用DDH2O溶解，标记为第二组后备用。123第三组处理方法1231样品的预处理（1）取第三组样品，将组织浸入10MLGTE100MMOL/L氨基乙酸；10MMOL/LTRIS,PH801MMOL/LEDTA缓冲液中,用来置换出组织中的福尔马林液。每隔24H换GTE缓冲液一次,浸泡72H；（2）用消毒剪刀将样品剪成小碎块,将剪碎的组织块放入15ML的离心管中,加入700L70酒精,然后将离心管放置在摇床振荡80R/MIN24H在第12H更换酒精一次；（3）在3000R/MIN下离心2MIN,倒掉上清液后加入700L100酒精,摇床振荡80R/MIN2
13、4H在第12H更换酒精一次；4在3000R/MIM下离心2MIN,倒掉上清液后加入700LGTE缓冲液,摇床振荡80R/MIN24H在第12H更换酒精一次；5在3000R/MIN下离心2MIN,倒掉上清液后在真空机中干燥20MIN；6加入500LGTE缓冲液后,95左右水浴中加热15MIN,然后在室温下冷却5MIN。1232DNA的提取（1）在3000R/MIN下离心2MIN,倒掉上清液后加入100L蛋白酶K50MG/ML,50L10十二烷基硫酸钠SDS和50L1MMOL/L二硫苏糖醇DTT。在60下消化24H,期间手动摇匀消化液几次；（2）再加入100L蛋白酶K50MG/ML和20L1MMO
14、L/LDTT。然后在60下再消化24H,期间混匀消化液几次。如果组织在48H后仍未完全消化,加入25L蛋白酶K50MG/ML继续消化24H；（3）当所有组织消化后,冷却样品至室温,然后将样品放入冰中5MIN；（4）在消化液中加入500L苯酚,振荡混匀10MIN,11000R/MIM下离心10MIN,然后将上清液转移到另一个15ML离心管中,重复此步骤2到3次；（5）加入25倍体积无水乙醇和05倍体积1MOL/LNH4AC,轻轻振荡混匀,在20下沉淀24H；（6）6000R/MIN下离心10MIN后,倒掉上清液；（7）用50L70酒精清洗,在真空离心机中干燥20MIN；8加入40LTE缓冲液50
15、0MMOL/LTRIS200MMOL/LEDTA10MMOL/LNACL,PH80溶解DNA，标记为第三组后备用。2结果与分析将三个实验组所得DNA经08琼脂凝胶电泳检测。如图1所示，第一组可以看到条带，而第二、第三组没能看到。但和在同等条件下新鲜组织（如图2）提取的DNA质量相比较差。21中性缓冲液对结果的影响福尔马林会导致组织核蛋白质与DNA复合体之间形成交联生物分子与DNA之间形成交联将阻碍蛋白质被蛋白酶K完全消化，导致提取DNA的产量下降。可形成交联的蛋白质包括纤维蛋白和可溶性蛋白质，甲醛与核酸单体之间的反应分两步第一步形成NCH2OH，第二步为NCH2OH作用于氨基，在两个氨基酸之间
16、形成亚甲基，通常第二步持续时间较长。福尔马林导致的DNA与蛋白之间的交联，会使大部分的大片段DNA在抽提过程中随蛋白质一起被抛弃，造成提取的DNA浓度较低和片段较短。第一组试验与第二组相比，第一组在预处理方面，加入了中性缓冲液。中性缓冲液可以减轻DNA与蛋白质之间的交联程度，提高了DNA的质量。22梯度酒精处理对结果的影响在提取过程中由于福尔马林对蛋白质水解酶有着很强的抑制作用，因此提取标本DNA之前的预处理，其目的便在于去除标本组织细胞中的福尔马林的各种成分，该程序是提取标本DNA成败的关键。而第三组与第一组相比，预处理方面少了酒精梯度处理。由试验结果来看，经过酒精梯度处理的预处理方法比没有
17、经过处理的方法要较好的除去组织残留的福尔马林。图1福尔马林固定的大黄鱼DNA提取液电泳图FIG1THEELECTROPHORESISCHARTOFCURRENTRESISTENCEFORMALINFIXEDEXTRACTDNA1第一组样品所得DNA（THEFIRSTGROUPOFSAMPLEINCOMEDNA）2第二组样品所得DNA（THESECONDGROUPOFSAMPLEINCOMEDNA）3第三组样品所得DNA（THETHIRDGROUPOFSAMPLEINCOMEDNA）MMARKD23与新鲜材料提取的比较但是，从试验结果来看，图1显示的DNA条带并不如图2中的那样清晰。虽然这样的处
18、理可以提取出DNA，但是，福尔马林对组织DNA的破坏很大程度上都是不可逆的。福尔马林对DNA分子可能有4种化学修饰作用1、核酸甲基化作用；2、由于甲基化作用而形成的交联；3、诱导形成嘌呤的二聚体；4、导致核酸中的磷酸二脂键断裂。这些修饰虽然可以通过试验前的预处理得以缓解，却无法根除，因此影响了DNA提取的结果。图2新鲜大黄鱼肌肉组织提取DNA的电泳图FIG2THEELECTROPHORESISCHARTOFFRESHCURRENTRESISTENCETISSUEEXTRACTDNAMMARKDN新鲜大黄鱼组织DNA（FRESHCURRENTRESISTENCETISSUEDNA）3讨论由于福尔
19、马林固定标本中的DNA相对脆弱，用常规的DNA提取方法难以提出能够用于遗传分析的DNA。本试验主要从预处理的方面展开讨论，加入缓冲液可以减少DNA的破坏程度，而且中性缓冲液可以减少DNA之间的交联。提取的过程中，也增加了蛋白酶K的用量，延长了消化时间，添加还原剂DDT等操作。另外福尔马林溶液的理化条件，保存条件及保存时间也对DNA提取有一定的影响。31从福尔马林溶液中提取DNA的制约条件311福尔马林的浓度及PH对DNA提取的影响福尔马林溶液的化学成分、PH值及浓度福尔马林的化学成分包括36甲醛,812甲醇,002离析物，少量氯化物、硫酸盐和重金属。福尔马林溶液的PH值对DNA质量也有影响。D
20、OUGLAS和ROGERS认为PH值较低的福尔马林溶液对DNA的破坏作用更大，他们发现PH30的福尔马林溶液固定的标本，其DNA平均突变率为112，而PH70的福尔马林溶液固定的标本，其DNA平均突变率仅为057。福尔马林溶液的浓度是影响DNA质量的又一因素，随着福尔马林固定液浓度的提高，所提取DNA的产量下降，同时DNA降解程度增强。312标本保存的时间对DNA提取的影响标本保存时间分为两部分固定延搁时间和固定保存时间。固定延搁时间即从样品死亡到用福尔马林浸泡保存之间的时间，对提取DNA的质量可能起相当重要的作用。DNA的化学性质极不稳定,在活体组织中,DNA的受损可以迅速而自动修复,而机体
21、死亡后发生的水解或氧化作用会导致DNA双链断裂,这个过程是不可逆的。固定延搁时间对于不同处理条件下标本的DNA产量和质量均有显著影响，随着标本固定延搁时间的增加，从标本中提取的DNA的OD260/OD280比值呈迅速下降趋势，也就是说标本DNA的降解程度也随之加速。固定保存时间对DNA质量的影响显而易见保存时间越长，DNA质量下降越明显，与固定延搁时间相比，固定保存时间对标本DNA的影响相对较小。DUBEAU等的研究表明，通过缩短固定延搁时间可以把利用标本DNA进行杂交分析的成功率由50提高到100。313标本保存的温度对DNA提取的影响研究发现，当福尔马林固定标本保存在较高的温度下会导致标本
22、中DNA降解加快。例如，小牛胸腺DNA用2福尔马林溶液保存在40时没有发生变化，当温度升高至60时DNA发生了改变。DNA在37时保持双链结构，随着温度的升高，DNA双链开始断裂，甲醛迅速地与变性DNA发生羟甲基化作用，阻止了温度下降后DNA链的重新连接，而单链DNA无法被限制性内切酶消化。32结语大黄鱼目前已成为我国特有的、重要的水产养殖品种。从福尔马林固定的大黄鱼标本中提取可以用于遗传分析的DNA对进行生物进化与系统发育和种群遗传学等方面的研究具有重要的意义。但是正如ARRIGHI所言“从福尔马林固定的组织中提取DNA比从任何其他固定剂固定的组织中提取DNA都难。”一方面，福尔马林会导致D
23、NA与蛋白质、DNA与DNA之间的交联，福尔马林溶液的化学成分、PH值及浓度、标本的保存时间及温度等原因也会造成DNA的降解，因此用常规的方法提取出的DNA质量难以保证。另一方面非常规的方法由于步骤繁多，原本脆弱的DNA无法承受高机械强度的操作而受损，以及长时间的缓冲液的处理导致的DNA污染严重。不过近些年来，经过研究者得不懈努力，已经得到了很大的进步。参考文献1杜世章,陈立桥从动物固定标本中提取DNA方法研究四川大学学报,2004,4148938952高天翔,张秀梅,曾晓起,渡边精一固定标本DNA提取及PCR扩增青岛海洋大学学报,20003022442483刘娟固定标本DNA提取方法优化的研
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