镉胁迫对香鱼肝蛋白质组学的影响【优秀毕业设计】.doc

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1、本科毕业设计（20_届）镉胁迫对香鱼肝蛋白质组学的影响所在学院专业班级水产养殖学学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录摘要1关键词11引言22材料和方法221实验材料2211实验鱼2212试剂与仪器222实验方法3221染毒分组及取样3222蛋白质样品的制备3223蛋白质双向电泳3224图象获得及分析5225蛋白质切胶及质谱分析53结果与讨论531对照组与实验组差异蛋白点的筛选及比较532CD胁迫条件下表达量上调的蛋白质733CD胁迫条件下表达量下调的蛋白质734讨论7341氧化应激7342甲基代谢8343核酸代谢8344金属代谢8345其他代谢84小结8致谢错误未定义书签。参考文献9附录

2、错误未定义书签。1摘要镉是一种对生物组织器官有着广泛的毒性损伤作用的化学污染物。对香鱼PLECOGLOSSUSALTIVELIS进行急性镉胁迫5MG/L处理。经对肝组织的蛋白样品通过双向电泳进行分离，并通过PDQUEST软件分析，找出27个差异点，经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱MALDITOFMS或液相色谱串联质谱LCMS/MS分析以后，成功鉴定23个蛋白。这些蛋白基因包括在多种生理过程中。热休克蛋白70、谷胱甘肽转移酶、醛脱氢酶三个蛋白主要包括在镉诱导的氧化应激过程中，且蛋白表达量都为上升；铁传递蛋白和碳酸酐酶包括在金属代谢过程中；甲硫氨酸腺苷转移酶和甜菜碱高半胱氨酸S甲基转移酶包括在甲

3、基代谢中；2氧代4羟基4羧基5脲基咪唑啉脱羧酶包含在核酸代谢中，以及其他蛋白涉及葡萄糖等生理代谢。这些基因可以进一步研究做为镉污染的生物标记。关键词镉；香鱼；蛋白质组学；双向电泳ABSTRACTCADMIUMCDISSUCHATOXICHEAVYMETALTODISRUPTAVARIETYOFPHYSIOLOGICALPROCESSESTHELIVERPROTEOMEOFPLECOGLOSSUSALTIVELISWASANALYZEDTHROUGHTWODIMENSIONALGELELECTROPHORESIS2DEAFTERACUTECDSTRESSAT5MG/LPROTEINSPOTSOB

4、TAINEDFROMCDSTRESSANDCONTROLGROUPWERESEPARATEDANDANALYZEDBYPDQUESTTHEEXPRESSIONSOF27SPOTSEXPRESSEDDIFFERENTIALLYOFLOWTEMPERATURESTRESSGROUPVARIEDSIGNIFICANTLYAFTERCHALLENGE23PROTEINSWEREIDENTIFIEDTHROUGHMALDITOFMSORLCMS/MSANDDATABASESEARCHTHEUPREGULATIONOFHEATSHOCKPROTEIN70HSP70,GLUTATHIONESTRANSFER

5、ASEGST,ANDALDEHYDEDEHYDROGENASESALDHWASRELATEDWITHACUTECDINDUCEDOXIDATIVESTRESSINAYULIVERTRANSFERRINTFANDCARBONICANHYDRASESWEREINVOLVEDINTHEMETALMETABOLISMMETHIONINEADENOSYLTRANSFERASEMATANDBETAINEHOMOCYSTEINESMETHYLTRANSFERASEBHMTINVOLVEDINTHELIVERMETHYLATIONCYCLE2OXO4HYDROXY4CARBOXY5UREIDOIMIDAZOL

6、INEDECARBOXYLASEURADWASINCLUDEDINTHEPURINEMETABOLISMOTHERPROTEINSWEREINVOLVEDINTHEMETABOLISMOFGLUCOSEANDOTHERSTHESEGENESCANBEFURTHERDEVELOPEDASABIOMARKEROFCADMIUMCONTAMINATIONKEYWORDSCADMIUM,AYU,PROTEOMICS,TWODIMENSIONALGELELECTROPHORESIS21引言香鱼PLECOGLOSSUSALTIVELIS系鲑形目、香鱼科、香鱼属，一年生降海洄游性鱼类，又称油香鱼，为我国重要

7、的小型名贵鱼类。随着工业的快速发展，我国多个水域环境重金属镉污染日益严重，河流和河口是污染物的重要接受水体，含有丰富的重金属。香鱼作为浙江省重要经济鱼类其产量受到严重影响。金属可能对鱼类物种引起严重后果，包括生长阻滞、繁殖率下降和增加疾病敏感性LANGSTONETAL2002。近年有研究标明，继汞、铅之后镉将是污染人类环境、威胁人类健康的第三个重要金属元素。1993年世界肿瘤研究机构IARC定义镉为人类致癌物GROUPI。虽然国际上早已优先研究的食品污染物镉，但由于镉在体内的半衰期长达几十年，性质稳定且缺乏特效药，因此镉中毒的治疗困难。CD能对各种生理过程造成干扰KOIZUMIETAL1995

8、。重金属胁迫下，镉可以直接作用于金属硫蛋白MT基因的启动子，从而诱导肝脏和肾脏的MTMRNA的大量合成刘伟成等,2005。RANALDI等发现镉胁迫在耳石中有累积现象RANALDIETAL,2009，但镉被吸收进人血液后，大部分存在于红细胞中，与金属硫蛋白结合镉随血液流动选择性多储存于肝、肾刘伟成等,2005。多有关于镉胁迫对鱼类肝组织特定蛋白的影响的研究，如低浓度镉对鮸鱼肝组织中的过氧化物岐化酶SOD起诱导作用导致“毒物兴奋效应”，高浓度镉对鮸鱼、鲢鱼肝组织SOD活力起抑制作用刘敏海等,2007吕景才等,2002，镉对鲫鱼肝组织中金属硫蛋白和大弹涂鱼肝组织中黄嘌呤氧化酶、抗氧化酶的影响周彦锋

9、等,2008刘伟成等,2005。近几年，随着双向电泳在蛋白质组学研究领域的普及，已有低温胁迫大黄鱼李明云等,2010、镉胁迫牙鲆黄清育等,2008等肝组织蛋白质组的分析。受镉胁迫影响，肝组织的各种蛋白含量有所变化，以期最大程度减少镉对机体的损伤。然而，目前尚无镉胁迫对香鱼肝组织蛋白质组的报道。而将香鱼作为实验对象是研究镉胁迫对洄游鱼类肝组织蛋白的变化，有助于将香鱼肝组织蛋白质作为生物标记对水域环境污染情况作进一步评估。这项研究结果有助于分析现场收集的香鱼肝组织，进一步分析香鱼在污染水域中的受污染情况，并为水产品中的CD污染进行深入研究和监控提供参考。现有的生物监测技术侧重于研究各类生物有机体对

10、重金属的富集量和表达单一蛋白质指示物的规律，而蛋白质双向凝胶电泳有助于更为全面的分析镉胁迫对香鱼肝组织蛋白质组学的影响黄清育等,2008。在区分野生鲟鱼、养殖鲟鱼以及腌制鲟鱼MARTINEZETAL2007，急性镉胁迫牙鲆鳃组织蛋白的变化及脑组织运铁蛋白含量的变化ZHUJYETAL2006LINGXP,2009，中华绒螯蟹急慢性镉胁迫下前鳃蛋白质变化SILVESTREETAL2006，镉胁迫下大黄鱼肝组织中运铁蛋白和铁调素基因表达的变化CHENJETAL2008，以及不同盐度胁迫下香鱼载脂蛋白含量的变化CHENJETAL2009等方面进行过基于双向电泳技术的蛋白质组学研究。因此，本课题拟将通过

11、双向凝胶电泳实验从蛋白质组的角度了解镉胁迫对肝组织蛋白质的影响，优化分离受氯化镉污染前后香鱼肝蛋白质组，构建差异蛋白质组的电泳图谱，其技术可为今后连续监测流动水体中各类重金属污染程度及危害性提供可行性分析技术。2材料和方法21实验材料211实验鱼实验香鱼采自浙江宁波宁海，在实验室淡水暂养7天以适应实验室养殖环境，再选取健康活泼的个体作为实验对象。暂养期间每天早晚换水喂食一次，各水箱全天不间断充气。每天三次定时测定并记录水温，使温度均保持在201。实验前24H停止喂食，避免饲料中的重金属组分产生干扰，影响测定结果的可靠性。212试剂与仪器试剂BRADFORD工作液考蓝G25035MG；磷酸50M

12、L，乙醇25ML加水至500MLBSA标准蛋白用牛血清蛋白配置1MG/ML的标准蛋白蛋白裂解液7M尿素，2M硫脲，4W/VCHAPS，1W/VDTT，02V/V载体两性电解质和蛋白酶抑制剂混合物3水化上样缓冲液尿素7M，硫脲2M，CHAPS4，DTT65MM，BIOLYTE02W/V现加，溴酚蓝0001，分装成10小管，每小管1ML，20冰箱保存1SDSPAGE电泳缓冲液25MMTRIS，192MMGLYCINE，01SDS，PH83胶条平衡缓冲液I尿素6M，SDS2W/V，TRISHCL0375MPH88，甘油20，DTT2W/V，充分混匀，现配胶条平衡缓冲液II尿素6M，SDS2W/V，T

13、RISHCL0375MPH88，甘油20，碘乙酰胺25W/V，充分混匀，用时现配30聚丙烯酰胺贮液丙烯酰胺150G，甲叉双丙烯酰胺4G，加MILLIQ水至500ML滤纸过滤后，棕色瓶4冰箱保存PH88的15MOL/LTRIS碱TRIS碱9075G，加MILLIQ水至400ML用HCL调PH至88，最后加MILLIQ水定容至500ML。4冰箱保存。10SDS称取SDS10G加MILLIQ水至100ML混匀后，室温保存。10APS称取AP01G加MILLIQ水至1ML溶解后，4冰箱保存，现用现配仪器等电聚焦仪；垂直电泳系统；扫描仪GS800和PDQUEST分析软件等购自BIORAD美国22实验方法

14、221染毒分组及取样将氯化镉CDCL25/2H2O配成CD2浓度为5G/L的母液在常温下保存。用此兑换成急性胁迫组5MG/L，参考国家渔业水质标准中所规定的镉离子浓度为0005MG/L，急性胁迫组为标准浓度的1000倍，设两个重复组，每组放置14尾香鱼。试验用塑料水箱规格为604050CM，每个水箱装水70L。每天更换相同浓度CD2淡水，温度均保持在201，PH773左右。试验期间每天投喂用水泡过的市售鱼饲料。本实验5MG/L浓度组作为急性镉胁迫实验组，暴露24H后取样。对香鱼样品进行体长测量，平均体长约21CM，活体解剖香鱼，快速取出实验所需的肝组织，放在预先准备好的做有标记的离心管里，并立

15、即将其丢入液氮中。等样品全部取完后进行分组，标注后放70冰箱中保存待用。222蛋白质样品的制备制样前将台面用酒精棉球擦干净，研钵、滤纸、酒精棉球、液氮、剪刀、镊子、蛋白裂解液、预冷的PBS缓冲液等准备充分。取出保存好的香鱼肝组织3份，在预冷的PBS中清洗两遍去除血迹，迅速放进液氮预冷的研钵中进行研磨，研磨过程中不断加入液氮以防组织反复冻融直至组织被研磨成粉末状；用15ML的离心管收集称量，样品粉末可达到0203G。研磨好的样本加135一般15ML裂解液36水浴1H；12000G，4离心1H，取中间层于新的15ML离心管中；15000G，4离心1H，取中间层于新的15ML离心管中；取10L用于测

16、定蛋白浓度，其余分装后于70保存备用。223蛋白质双向电泳2231蛋白浓度的测定蛋白浓度测定采用BRADFORD法1976，以牛血清白蛋白为标准蛋白，根据表1，作BSA蛋白浓度标准曲线。混匀后，室温下2025放置3MIN，于A595下测定标准品的吸光值OD。表1蛋白标准曲线制作TAB1MAKINGOFPROTEINSTANDARDCURVE试剂REAGENT加样量VOLUME10MG/ML牛血清蛋白/L10MG/MLBSA/L0510152025双蒸水/LDDH2O/L300295290285280275布拉德福工作液/MLBRADFORDWORKINGSOLUTION/ML3333334图1

17、为以牛血清白蛋白为标准蛋白制作的标准曲线，其中蛋白含量为横轴，吸光度为纵轴。曲线方程为Y00476X00007；R209995。Y00476X00007R209995005000501015020250303504012345678蛋白浓度G/MLPROTEINCONCENTRATION/ML吸光度595NMABSORBANCE595NM图1蛋白标准曲线FIG1THESTANDARDCURVEOFPROTEIN根据所得曲线测得所制对照组样品浓度为2201G/L，处理组为2209G/L。每次测蛋白浓度时均要同时做相应的蛋白标准曲线。2232第一向等电聚焦IEF等电聚焦电泳主要按照GRG的描述的方

18、法GRGETAL2000，同时参照BIORAD仪器系统操作指南，以及吴海庆等吴海庆等,2009的双向电泳优化方法。首先，从20冰箱中取出IPG干胶条在室温中平衡10MIN；根据上样量1MG取不同体积的制备好的香鱼肝组织蛋白样品与上样缓冲液充分混合，均匀加入等电聚焦槽中。撕去IPG干胶条的保护膜，调整正负极，胶面朝下放入，注意胶条下面的溶液不能有气泡。在胶条上面覆盖2ML矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发注极限电流为3050UA/根；等电聚焦温度为恒温20。本实验所用的17CM胶条上样量为1MG，在通用型17CM聚焦盘内50V主动水化12小时，250V线性除盐1H，500V线性除盐1H，100

19、0V线性升压1H，8000V线性升压6H，8000V快速聚焦至88KVH。之后保持电压在500V至胶条取出。2233IPG胶条的平衡平衡过程将导致蛋白丢失，同时造成图谱分辨率降低。但不经平衡，蛋白质将得不到充分的变性，因而会影响蛋白质的转移，导致高分子量蛋白的纹理现象，并且等电聚焦凝胶会粘在SDS胶上。缩短平衡时间可以减少扩散，但会减少向第二向的转移。因此，有必要对IPG胶条进行两步平衡，时间至少210MIN，不要超过215NIM，以免过度平衡引起蛋白的过多降解和扩散。聚焦结束后取出胶条，进行IPG胶条的两次平衡1用准备好湿润滤纸吸去IPG胶条上残余矿物油及多余样品可有效减少纵条纹的产生；2将

20、IPG胶条放入水化盘中，加入2ML的平衡缓冲液，再放置于水平摇床上振荡15MIN打开二硫键，使蛋白还原更完全；3从平衡缓冲液中，将IPG胶条取出移入加有2ML平衡缓冲液水化盘中，置水平摇床上再振荡15MIN。加入的碘乙酰胺可去除多余的DTTDTT过多会导致点拖尾；4取出IPG胶条，浸入1SDSPAGE电泳缓冲液中漂洗5S，将胶条的边缘置于滤纸上几秒，以除去多余的缓冲液。再将胶条移到准备好的SDS凝胶上。2234第二向聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳SDSPAGESDSPAGE主要是根据蛋白质分子量的大小，在竖直方向上分离各种蛋白质。聚丙烯酰胺浓度越大，5凝胶孔径越小，本实验采用浓度为12的聚丙烯酰胺凝胶

21、进行第二向的垂直凝胶电泳。根据比例将胶灌制好倒入制胶仪，用水压面直到胶面与水面被压出一条很明显的直线，说明胶已凝固。小心倾斜倒去水，用小片滤纸吸取多余水分。然后进行胶条的转移将IPG胶条小心的转移到置备好的SDS凝胶上，用预溶的05低熔点琼脂糖封胶，轻压IPG胶条支持面，使其与SDS凝胶充分接触，排除其间小空泡，在4冰箱中静置，直到低熔点琼脂糖凝固。将胶条正负极和电泳槽的正负极相对应，在将凝胶转移到电泳槽中。加入1SDSPAGE电泳缓冲液。接通电源，设定电泳运行条件起始电压为80V，30MIN，之后170V，恒温20。当溴酚蓝指示剂到达胶底部边缘时，停止电泳约5H，拆下玻璃板准备染色。2235

22、凝胶染色及脱色考马斯亮蓝G250染色固定液固定2H，考蓝G250染液1考马斯亮蓝G250，40乙醇，10乙酸染色12H，脱色液40乙醇10乙酸脱色一天至蛋白点清晰，最后用蒸馏水清洗至背景干净。224图象获得及分析采用GS800扫描仪扫描脱色后的凝胶，并采用PDQUEST2D分析软件VERSION740,BIORADHEALTHCARE对扫描图谱处理分析。蛋白点检测采用对自动检定的蛋白点加以人工校对的半自动模式。225蛋白质切胶及质谱分析软件处理分析后，以TOTALQUANTITYINVALIDSPOT指所有检测出的蛋白点的浓度总和做为标准，选取差异在2倍或2倍以上的蛋白点进行标记，然后从胶上切

23、取放进标记好的离心管中，以便送样分析。切割差异蛋白质点置于离心管中，送往上海杰众质谱公司进行串联质谱LCMSMS分析或肽指纹图谱MALDITOFMS分析。最后应用MASCOT软件在脊索动物蛋白质公共数据库NCBI、SWISSPROT中搜寻，获得蛋白质的相关信息。3结果与讨论31对照组与实验组差异蛋白点的筛选及比较经PDQUEST软件分析，香鱼肝脏蛋白点主要集中在20100KDA。每块凝胶的蛋白点约540个，图谱蛋白质点匹配率达90以上，表明图谱可作进一步分析研究。经对比，共有27个蛋白点在盐度胁迫后表达量发生明显变化见图2、图3。与对照组相比，CD胁迫组肝中111，27号蛋白表达量上调，其余表

24、达量下调。27个蛋白点中有23个点得到成功分析，通过MASCOT软件在数据库中搜索得到的蛋白信息见表2。图2处理组香鱼肝脏蛋白质组双向电泳图谱AFIG2TWODIMENSIONALELECTROPHORETICGELOFLIVERPROTEOMEINCDTREATEDAYUA6图3对照组香鱼肝脏蛋白质组双向电泳图谱BFIG3TWODIMENSIONALELECTROPHORETICGELOFLIVERPROTEOMEINHEALTHYCONTROLAYUB表2急性镉胁迫香鱼肝脏差异蛋白点表达TAB2PROTEINSDIFFERENCESINLIVEROFAYUEXPOSEDTOACUTECD序

27、682256833620007甲硫氨酸腺苷转移酶GI|16391485354844121004酯水解酶GI|22936612860135522004NMYC下游调节基因1GI|20915438264942426025铁传递蛋白GI|28876878665875927200谷胱甘肽S转移酶GI|37362126763259A蛋白点顺序号，切取的点与图3点相对应，蛋白点差异值为两倍及两倍以上，所有数值符合单项检验方差P005B倍数，表示为镉胁迫组和对照组的胶上相对应蛋白的光密度比值与对照组相比732CD胁迫条件下表达量上调的蛋白质苯丙氨酸4羟化酶PHENYLALANINE4HYDROXYLASES

28、点1,2是苯丙氨酸代谢中的限速酶。酸性核糖体蛋白P060SACIDICRIBOSOMALPROTEINP0,RPLP0点3是位于真核生物核糖体60S大亚基上的三种核糖体磷酸化蛋白RPLP0，RPLP1，RPLP2中的一种，通过维持核糖体稳定性和活性以及与延伸因子作用参与蛋白合成延伸阶段的调节来参与蛋白质合成的调节。苹果酸脱氢酶MALATEDEHYDROGENASE,MDH点4利用NAD在苹果酸向草酰乙酸转变的可逆氧化反应中起催化作用。醛脱氢酶ALDEHYDEDEHYDROGENASES,ALDHS点5,11在脂质过氧化生成醛类的解毒方面发挥重要作用。热休克蛋白70HEATSHOCKPROTEI

29、N70,HSP70点6作为分子伴侣，具有高度保守性，是一种普遍存在的应激反应表达蛋白。碳酸酐酶CARBONICANHYDRASES点7,9是一种锌金属酶，能够催化二氧化碳的可逆水合反应。胰蛋白酶原TRYPSINOGEN,TRY点8是丝氨酸蛋白酶家族中胰蛋白酶的前体。细胞色素C还原酶CYTOCHROMECREDUCTASE,CCR点10是呼吸链的重要组成成分，通过产生质子电化学梯度从而穿透细胞质膜合成ATP。谷胱甘肽转移酶GLUTATHIONESTRANSFERASE,GST点27，是二聚体同功酶家族，具有多种生理功能。能够通过催化细胞内谷胱甘肽与各种内源或外源的亲电子有毒分子结合形成水溶性非共

30、轭聚合物排出体外，从而达到解毒目的。33CD胁迫条件下表达量下调的蛋白质糖磷酸变位酶PHOSPHOGLUCOMUTAS,PGM点13催化葡萄糖1磷酸向葡萄糖6磷酸转换。角蛋白KERATIN点14是一种杂肽蛋白，是中间纤维骨架的组成成分。2氧异缬氨酰化脱氢酶2OXOISOVALERATEDEHYDROGENASE点15在亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸分解代谢的第二个主要步骤起催化作用。载脂蛋白AIAPOLIPOPROTEINAI,APOAI点16是血清中高密度脂蛋白的主要组成部分，参与从组织分泌到肝脏胆固醇的逆向运输。甜菜碱高半胱氨酸S甲基转移酶BHMT点17是一种胞液酶，催化将N甲基组从

31、甜菜碱转移到高半胱氨酸，分别得到二甲基甘氨酸和甲硫氨酸产物。2氧代4羟基4羧基5脲基咪唑啉脱羧酶2OXO4HYDROXY4CARBOXY5UREIDOIMIDAZOLINEDECARBOXYLASE,URAD点18催化尿酸的氧化降解，产物为S尿囊素，这是嘌呤代谢的后期阶段。3羟氨苯甲酸3,4加氧酶3HYDROXYANTHRANILATE3,4DIOXYGENASE,HAD点19催化2氨基3羟基苯甲酸合成喹啉酸。甲硫氨酸腺苷转移酶METHIONINEADENOSYLTRANSFERASE,MAT点20催化ATP的腺苷基向甲硫氨酸转移，从而产生三聚磷酸钠和S腺苷甲硫氨酸ADOMET。这是大多数生物

32、甲基化的主要甲基来源。酯水解酶ESTERHYDROLASE点21是一种锌含水解酶，催化酯键的水解。NMYC下游调节基因1NMYCDOWNSTREAMREGULATEDGENE1,NDRG1点22是近年来发现的一种分化相关基因，多种生理或病理因素的刺激可诱导NDRG1的表达，但其确切的生物学功能尚不完全清楚。铁传递蛋白TRANSFERRIN,TF点26是血液循环中主要的血清铁结合蛋白，在肝细胞中合成后并分泌到血液中。34讨论鱼组织和体液的蛋白组成和含量的变化都与生理生活环境密切相关KYETAL2007。本实验采用蛋白质组学方法监测香鱼肝脏蛋白质组，研究CD胁迫对香鱼肝组织相关蛋白表达量的影响。实

33、验结果表明相关蛋白主要涉及到镉诱导的氧化应激、甲基代谢、金属代谢和核酸代谢等。341氧化应激在香鱼肝急性CD诱导的氧化应激反应中，HSP70，GST和ALDH表达量上调。根据应激反应与鱼类生理状态的密切相关，可以定量测定某一生物所受到的环境胁迫强度。HSP70是鱼类中研究最广泛且含量最为丰富的一类热休克蛋白，作为分子伴侣协助新生多肽链的折叠，蛋白质复合体的装配，以及调节、修复和降解变性的蛋白质方面起着重要作用祝璟琳等,2007。HSP70已经在生物监测和环境毒理学中得到广泛的应用MUKHOPADHYAYETAL2003，沈骅等探讨了HSP70作为重金属污染条件下生物标记物的潜力沈骅等,2004

34、。有研究早已表明，CD胁迫能够引起HSP70表达量的上调SALMINENETAL1996。已经证实在CD胁迫鱼类中HSP70的存在LINGXPETAL2009WILLIAMSETAL2006。ALI等发现在正常鲤鱼的肌肉和脑组织中不能检测出HSP70MRNA的表达，其肝、肾组织中的表达很有限，但用高温、CD对普通鲤鱼进行体内胁迫后，其表达明显升高，与时间和浓度呈正相关ALIETAL2003。在那宏坤等人镉胁迫实验中，CDCL210MG/L污染的环境中连续饲养72H的牙鲆肝脏中发现，HSP70含8量上调那宏坤等,2009。高浓度、时间长的CD胁迫实验中CD2可能因对鲫鱼肝脏组织造成病理损伤，影响

35、正常的生长代谢，从而使HSP70几乎停止了表达沈骅等,2004。本实验中，香鱼镉胁迫肝组织的HSP70表达上调，说明镉胁迫促使香鱼肝的氧化应激反应。GSTS对环境污染物有一定的解毒功能。研究发现，CD胁迫能够促进小鼠肝细胞、栗酒裂殖酵母BAEETAL2004、中华绒螯蟹SILVESTREETAL2006、暗纹东方豚KIMETAL2010、香鱼本实验中GSTS表达的活性CASALINOETAL2004。在急性CD处理的香鱼肝中GST表达量上调与河豚相一致KIMETAL2010。ALDH是另外一种催化脂源性醛解毒的酶，目的是为了减少其对生物体的潜在危害。已经发现在某些环境胁迫下，鱼类ALDH表达量

36、会上调，包括低温IBARZETAL2010、环境污染物WILLIAMSETAL2003和渗透胁迫CHENJETAL2009。本实验急性CD胁迫引起ALDH表达量的上调，可能是抗氧化过程中对GST路径的补充。342甲基代谢MAT和BHMT，是肝甲基化循环中的两种代谢酶，在本研究中的香鱼急性CD胁迫实验组中表达下调。MAT是在甲基化循环中通过消耗甲基形成腺苷甲硫氨酸ADOMET的必须酶。BHMT是唯一已知的利用甜菜碱作为底物介导甲基化作用的酶PAJARESETAL2006。甜菜碱是鱼类体内一个重要的合成甲硫氨酸的甲基供体SIMONETAL1999。MAT和BHMT表达量的下调可能反应了肝脏中ADO

37、MET的含量的下降。在急性CD胁迫诱导氧化应激的过程中，DNA的甲基化是一个重要的过程TAKIGUCHIETAL2003HUANGDETAL2008。DNA甲基转移酶的反应机理包括直接从ADOMET到DNA甲基化的甲基转移过程ARANDAETAL2010。研究发现，急性CD胁迫处理后的香鱼肝中MAT和BHMT表达量的下调可能是由于ADOMET含量的降低导致的DNA甲基化过程的紊乱。343核酸代谢本研究中，我们首次发现CD胁迫香鱼肝中的URAD表达量上调。由于嘌呤代谢包含URAD，URAD的表达紊乱现象较为合理。在嘌呤分解代谢中，尿酸作为一键化合物降解为S尿囊素，由URAD催化产生CENDRON

38、ETAL2007。因此，URAD表达量的下调部分反应了嘌呤代谢的紊乱，由此可以解释CD胁迫对DNA的破坏。在本实验中，急性CD胁迫导致香鱼肝生理过程中蛋白的选择性表达。本实验首次发现CD毒性对BHMT和URAD两种蛋白表达量的改变，这在一定程度上反应了DNA甲基化和嘌呤代谢的紊乱。某些蛋白表达水平的变化可作为水环境CD的鱼类生物标志物。344金属代谢对于组织来说，CD胁迫造成的另外一个效果是干扰金属离子的功能和新陈代谢，如FE、ZN。已发现相关鱼类经CD胁迫实验后，TF表达量会下调CHENJETAL2008ZHUJYETAL2006。本研究急性CD胁迫的香鱼肝组织的TF表达量下降，与目前相关调

39、查研究相符。由于CD与ZN很多相似处，所以CD在生物系统中可以替换ZN。碳酸酐酶是一种锌金属酶，在呼吸作用和酸碱平衡中扮演重要角色，电解质分泌，骨吸收，钙化及生物合成等反应中需要HCO3作为基质HENRY,1996。众所周知，在不同的生物体中，重金属会影响碳酸酐酶的活性和表达SOYUTETAL2008ROBERTOETAL2010。本实验发现，急性CD会导致碳酸酐酶在香鱼肝脏中的表达量上调。345其他代谢根据蛋白质组学分析，在CD胁迫处理组和对照组的肝，总共鉴定出20种差异表达的蛋白。以上列举的8种蛋白的选择性表达与应对急性CD胁迫的特殊反应相关，本研究反应并补充了CD胁迫的制毒机理。另外12

40、种蛋白，其他表达变化的蛋白质需要进一步研究它们在急性CD胁迫的生理意义。这些蛋白参与各种生理过程，包括葡萄糖代谢MDH和PGM，氨基酸和蛋白质代谢苯丙氨酸4羟化酶,RPLP0,TRY,2氧异缬氨酰化脱氢酶和HAD、脂质代谢APOAI和酯水解酶、呼吸链CCR、细胞分化NDRG1和细胞骨架角蛋白。4小结总的说来，香鱼肝脏中蛋白质的表达量的不同反应了香鱼在CD污染环境下体内的解毒反应。这些蛋9白质直接或间接的降低CD污染对生理机制的破坏的解毒过程中起到了重要作用。在急性镉胁迫下，如果CD污染水质对细胞产生的损伤不能被及时修复，香鱼体内环境的动态平衡就会被打破，当这种变化超过调节能力，就会引起香鱼的各

41、种生理反应，甚至死亡。因河流及河口是重金属污染物的主要承载者，有毒重金属均能使各种鱼类产生中毒症状，人们普遍认为鱼类是水环境重金属污染监测的重要模式生物。相关研究已有详细报道，并发现了一些适合于检测流动海淡水中重金属污染程度的标记蛋白质刘敏海等,2007吕景才等,2002及耳石RANALDIETAL,2009。由于香鱼生命周期跨越河流、咸淡水和海水，因此香鱼是可考虑的研究水生生物受重金属胁迫反应的鱼类模式生物。蛋白质作为生物机体物质基础和生命活动的执行者，当外界环境发生改变时，机体细胞基因组转录和RNA干扰水平也会随之改变，而最终影响到细胞蛋白质的表达冯德芹等,2006。在受镉污染后，香鱼肝脏

42、组织有27个差异蛋白质斑点，并有质和量的变化趋势，这种趋势有望以整体差异蛋白质组作为检测流动水体中镉污染程度的指示物，但还需进一步研究。与目前采用的单一的差异蛋白质或其他物质作为标志物更为可靠。可进一步结合生产实践为渔业生产和环境监测制定指导建议。完善的蛋白质标志物组和获取具有高度重复性的双向凝胶电泳图谱将有助于为今后实施蛋白质组图谱标准化提供可行性技术，只要获取蛋白质双向凝胶电泳标准图谱就可直接评价流动水体中各类污染源的污染程度及其对海洋动物的危害性，简化现有蛋白技术监测流动水体污染程度时所需的复杂分析步骤等。参考文献冯德芹,郭尧君双向电泳在畜牧业和渔业中的最新应用J现代科学仪器,2006,

43、53136黄清育,朱金勇,陈盈盈,等双向电泳技术研究镉诱导后牙鲆肝的差异蛋白质组J厦门大学学报自然科学版,2008,47A028790李明云,冀德伟,吴海庆,等大弹涂鱼肝脏蛋白质组双向电泳技术的建立及优化J生命科学仪器,2009,72932李明云,冀德伟,吴海庆,等低温胁迫下大黄鱼肝脏蛋白质组双向电泳分析J农业生物技术学报,2010,182323328刘敏海,罗海忠,陈波,等铜、镉对鮸鱼幼鱼鳃丝NAKATPASE和肝脏SOD酶活性的影响安全与环境学报,2007,7458刘伟成,李明云镉毒性毒理学研究进展J广东微量元素科学,2005,121215吕景才,宋晓阳,王凡,等镉污染对鲢抗氧化防御系统影

44、响研究J西南农业大学学报,2002,246491493,505那宏坤,黄清育,黄河清差速离心结合蛋白质组学技术研究受镉盐胁迫后的牙鲆肝差异蛋白质J分析化学,2009,3710191024沈骅,王晓蓉,张景飞,等低浓度PB2、CD2对鲫鱼肝脏组织中HSP70诱导的影响J环境污染与防治,2004,264244247沈骅,王晓蓉,张景飞应用应激蛋白HSP70作为生物标志物研究锌、铜及其联合毒性对鲫鱼肝脏的影响J环境科学学报,2004,245895899周彦锋,陈家长,杨光,等重金属镉胁迫下鲫鱼不同组织中金属硫蛋白的动态变化J安全与环境学报,2008,831821祝璟琳,王国良鱼类HSP70的研究进展

45、J宁波大学学报,2007,204446450ALIKS,DORGAIL,GAZDAGA,ETALIDENTIFICATIONANDINDUCTIONOFHSP70GENEBYHEATSHOCKANDCADMIUMEXPOSUREINCARPJACTABIOLHUNG,2003,54323344ARANDAJ,ROCAM,LOPEZCANUTV,ETALTHEORETICALSTUDYOFTHECATALYTICMECHANISMOFDNAN4CYTOSINEMETHYLTRANSFERASEFROMTHEBACTERIUMPROTEUSVULGARISJJPHYSCHEMB,2010,1148

46、4678473BAEW,CHENXPROTEOMICSTUDYFORTHECELLULARRESPONSESTOCD2INSCHIZOSACCHAROMYCESPOMBETHROUGHAMINOACIDCODEDMASSTAGGINGANDLIQUIDCHROMATOGRAPHYTANDEMMASSSPECTROMETRYJMOLCELLPROTEOMICS,2004,3596607CASALINOE,SBLANOC,LANDRISCINAV,ETALRATLIVERGLUTATHIONESTRANSFERASEACTIVITYSTIMULATIONFOLLOWINGACUTECADMIUMO

47、RMANGANESEINTOXICATIONJTOXICOLOGY,2004,2002938CENDRONL,BERNIR,FOLLIC,ETALTHESTRUCTUREOF2OXO4HYDROXY4CARBOXY5UREIDOIMIDAZOLINEDECARBOXYLASEPROVIDESINSIGHTSINTOTHEMECHANISMOFURICACIDDEGRADATIONJBIOLCHEM,2007,2821818218189CHENJ,SHIYH,HUHQ,ETALAPOLIPOPROTEINAI,AHYPEROSMOTICADAPTATIONRELATEDPROTEININAYUP

48、LECOGLOSSUSALTIVELISJCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDHYSIOLOGY,2009,1522196201CHENJ,SHIYH,LIMYCHANGESINTRANSFERRINANDHEPCIDINGENESEXPRESSIONINTHELIVEROFTHEFISHPSEUDOSCIAENACROCEAFOLLOWINGEXPOSURETOCADMIUMJARCHTOXICOL,2008,82525530CHENJ,WUHQ,SHIYH,ETALTHEEFFECTSOFENVIRONMENTALSALINITYONTRUNKKIDNEYPROTEOMEO

49、FJUVENILEAYUPLECOGLOSSUSALTIVELIS10JCOMPBIOCHEMPHYSIOLD,2009,4263267HENRYRPMULTIPLEROLESOFCARBONICANHYDRASEINCELLULARTRANSPORTANDMETABOLISMJANNUREVPHYSIOL,1996,58523538HUANGD,ZHANGY,QIY,ETALGLOBALDNAHYPOMETHYLATION,RATHERTHANREACTIVEOXYGENSPECIESROS,APOTENTIALFACILITATOROFCADMIUMSTIMULATEDK562CELLPROLIFERATIONJTOXICOLLETT,2008,1794347IBARZA,MARTINPEREZM,BLASCOJ,ETALGILTHEADSEABREAMLIVERPROTEOMEALTEREDATLOWTEMPERATURESBYOXIDATIVESTRESSJPROTEOMICS,2010,10963975GORGA,OBERMAIERC,BOGUTHGTHECURRENTSTATEOFTWODIMENSIONELECTROPHORESISWITHIMMOBILIZEDPHGRADIENTSELE

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