1、本科毕业设计（20_届）甲基茉莉酸对雨生红球藻虾青素积累的影响及其分子机理的研究所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月0目录摘要ABSTRACT1引言12材料与方法121实验材料1211实验藻种1212培养基1213实验常用仪器2214实验常用试剂222培养方法2221雨生红球藻细胞的培养2222甲基茉莉酸浓度设置323测定方法3231雨生红球藻细胞密度与光密度值（OD）关系的测定3232雨生红球藻细胞密度的测定3233虾青素含量的测定3234数据处理324雨生红球藻DXS基因的表达分析3241ACTIN基因检测3242目的基因的表达4243MEJA诱导条件下雨生红球藻虾
2、青素含量和DXS基因表达量的相关性分析53结果与分析531雨生红球藻细胞密度与光密度值的回归方程532MEJA对雨生红球藻生长的影响533MEJA对雨生红球藻总虾青素产量的影响734MEJA对雨生红球藻虾青素含量的影响835MEJA诱导下雨生红球藻虾青素含量和DXS基因表达量的关系94讨论105小结10致谢错误未定义书签。参考文献11附录错误未定义书签。1摘要本文研究了不同浓度甲基茉莉酸MEJA对雨生红球藻细胞生长和虾青素含量的影响。结果表明，MEJA抑制雨生红球藻细胞的生长和总虾青素含量的积累，但MEJA能促进雨生红球藻单位细胞虾青素的积累，雨生红球藻单位细胞虾青素含量随着MEJA浓度的增加
3、呈先升高后降低的趋势。研究不同浓度MEJA诱导下雨生红球藻细胞DXS基因的表达水平，结果表明，合适浓度的MEJA处理能够增强DXS基因的表达水平。对雨生红球藻虾青素含量和DXS基因表达的相关分析，结果表明，MEJA处理下的雨生红球藻虾青素含量和DXS基因表达量呈线性关系，从而可以确定DXS基因是雨生红球藻虾青素合成过程中的一个关键酶基因。关键词雨生红球藻甲基茉莉酸虾青素DXSABSTRACTTHEEFFECTSOFDIFFERENTCONCENTRATIONSOFMETHYLJASMONATEMEJAONTHECELLGROWTHANDASTAXANTHINCONTENTOFHAEMATOCO
4、CCUSPLUVIALISWASRESEARCHINTHISPAPERTHERESULTSSHOWEDTHAT,DIFFERENTCONCENTRATIONSOFMEJARESTRAINTHECELLGROWTHOFHPLUVIALIS,ANDTHETOTALASTAXANTHINACCUMULATIONOFTREATMENTGROUPSWITHTHEDIFFERENTCONCENTRATIONSOFMEJABUTMEJATREATMENTSCANPROMOTEUNITCELLASTAXANTHINACCUMULATION,WITHTHEINCREASEDMEJACONCENTRATIONS,
5、THEUNITCELLASTAXANTHINCONTENTSHOWEDTHETRENDENCYTHATWASFIRSTINCREASEDANDTHENDECREASEDTHEEFFECTSOFDIFFERENTCONCENTRATIONSOFMEJAONTHEDXSGENEEXPRESSIONLEVELOFHPLUVIALISWERESTUDIEDTHERESULTSHOWEDTHATAPPROPRIATECONCENTRATIONSOFMEJACOULDENHANCETHEDXSGENEEXPRESSIONLEVELFURTHERMORE,THEASTAXANTHINCONTENTOFHPL
6、UVIALISANDTHEAMOUNTOFDXSGENEEXPRESSIONWASINPOSITIVECORRELATION,THUSITCANBEDETERMINEDTHATTHEDXSGENEEXPRESSIONLEVELCANREALLYREFLECTTHEASTAXANTHINCONTENTOFHPLUVIALIS,ANDDXSGENEWASAKEYENZYMEGENEOFASTAXANTHINSYNTHESISOFHPLUVIALISKEYWORDSHAEMATOCOCCUSPLUVIALISMETHYLJASMONATEASTAXANTHINDXS11引言雨生红球藻HAEMATOC
7、OCCUSPLUVIALIS是一种单细胞绿藻，是自然界生产虾青素（ASTAXANTHIN）最多的一类生物之一。虾青素是一种高效、优质、安全的天然抗氧化剂和着色剂，能提高动物的存活率和免疫力，还能增加动物产品的色泽外观和营养价值，并且对人体绝对安全1,2。不仅可以作为食品添加剂、水产养殖的饲料添加剂，而且在化妆品、药品以及高级营养保健品等领域也有巨大的发展潜力3,4。因此，采用各种途径提高雨生红球藻虾青素含量一直是国内外研究的热点。甲基茉莉酸METHYLJASMONATE,MEJA是高等植物体内的一种内源生长调节物质，在植物次生代谢过程中起着信号传导的作用，从而有利于提高植物次生代谢产物的含量5
8、。GONG等的研究表明，MEJA对调控银杏GINKGOBILOBA细胞中银杏内酯的合成有显著效果，能够提高银杏细胞中银杏内酯的含量6,7。余龙江等8研究也表明，在红豆杉TAXUSMAIREI胚性细胞培养的第10D、20D加入100MOL/LMEJA，从而使紫杉醇产量提高了1402和1377。朱颖等研究也表明，MEJA能诱导杜氏盐藻胡萝卜素含量9。近年来，对于雨生红球藻虾青素积累的影响因子的研究，主要集中在光照、缺氮、温度和PH等1013，而诱导因子MEJA对雨生红球藻虾青素含量的影响尚未见相关报道。虾青素属于四萜衍生物类次生代谢产物，在细胞质体中合成。最新研究证实了一条独立于细胞质甲羟戊酸MV
9、A途径的萜类合成途径，即2C甲基D赤藻糖醇4磷酸（MEP）途径，植物中大多数的单萜、二萜和少数倍半萜都由这条途径合成14。1脱氧D木酮糖5磷酸合成酶1DEOXYDXYLULOSE5PHOSPHATESYNTHASE，DXS是MEP途径中的第一个酶，同样也是此途径中的第一个关键酶15。有研究表明，超量表达DXS基因能明显提高类胡萝卜素、萜类化合物和萜类吲哚生物碱等的含量在生物体内的积累1618。目前，王丽丽等采用首次从雨生红球藻中克隆了DXS基因核心片段19，但MEJA对雨生红球藻虾青素合成基因DXS表达的影响还未见报道。针对雨生红球藻虾青素在应用上的巨大潜力，研究MEJA对雨生红球藻细胞生长和
10、虾青素含量的影响，为雨生红球藻虾青素的规模化生产提供理论基础。研究MEJA胁迫下虾青素合成关键酶基因DXS表达的影响，为探明雨生红球藻虾青素积累的分子机制研究提供基础。2材料与方法21实验材料211实验藻种雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS，藻种由宁波大学海洋生物工程重点实验室微藻实验室提供。212培养基用于雨生红球藻培养的是BBM培养液，其基本配方（G100ML1）为大量元素浓度微量元素浓度其他浓度NANO350CONO326H2O00098MGSO47H2O15NACL05CUSO45H2O00314CACL22H2O05K2HPO415MNCL24H2O00288FE
11、SO47H2O01KH2PO435ZNSO47H2O01764H3BO3373MOO300142EDTA10三种母液各取5ML用蒸馏水定容至1L，PH调到80，分装后121灭菌20MIN。2213实验常用仪器SWCJ2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司MSL3750型自动高压蒸汽灭菌器三洋信贩株式会社RXZ型智能光照培养箱宁波海曙赛福实验仪器厂AB104N型电子分析天平梅特勒托利多仪器上海有限公司722型分光光度计鑫茂科技（深圳）有限公司NEOFUGE15R型台式高速冷冻离心机力康发展有限公司台式酸度计新加坡优特（EUTEOH）仪器公司XS212型显微镜JNOEC南京江南永新光学有限
12、公司磁力加热搅拌器常州国华电器有限公司XBK25型血球计数板上海沪江医疗器材有限公司MDFU5411超低温冰箱日本SANYO公司JUNYI600双控电泳仪北京君意东方电泳设备有限公司BIOFUGEFRESCO台式高速冷冻离心机德国KENDRO公司ALPHAIMAGER2200凝胶图像处理系统美国ALPHAINNOTECH公司吉尔森可调精密移液器PIPETMAN法国GILSON公司PX2THERMALCYCLERPCR自动分析仪美国THERMO公司NANODROP1000超微量核酸定量光谱仪美国THERMO公司THZD恒温振荡器太仓市实验设备厂214实验常用试剂甲基茉莉酸（MEJA）SIGMAA
13、LDRICHBIOTECHNOLOGYLPANDSIGMAALDRICHCO氯化钠宁波市化学试剂有限公司硝酸钠上海精化科技研究所磷酸二氢钾广东省化学试剂工程技术研发中心硫酸镁浙江省温州市东升化工试剂厂磷酸氢二钾宜兴市第二化学试剂厂硼酸宜兴市第二化学试剂厂氯化锰中国医药集团上海化学试剂有限公司乙二胺四乙酸中国医药集团上海化学试剂有限公司硫酸锌中国医药集团上海化学试剂有限公司硫酸铜中国医药集团上海化学试剂有限公司硝酸钴中国医药集团上海化学试剂有限公司硫酸亚铁中国医药集团上海化学试剂有限公司氯化钙上海展云化工有限公司氧化钼中国上海胶体化工厂二甲基亚砜浙江杭州双林化工试剂厂22培养方法221雨生红球藻
14、细胞的培养藻种先于光照度8000LX，24，12H/12H侧光照静止培养10天，至培养到对数生长期待用。接种前将3分装好培养基的500ML锥形瓶灭菌，用BBM培养基进行培养，接种时，锥形瓶每瓶接入25ML藻液，用纸盖好瓶口，用棉绳扎紧。置于光照度12000LX，24，24H连续侧光照培养，每天手摇35次。222甲基茉莉酸浓度设置MEJA质量浓度梯度设置为1个对照组6个处理组共7个水平，分别为对照组0MOL/L，处理组50，100，200，400，800和1600MOL/L，每个浓度梯度分别设3次重复，每隔3D取样一次，用于测定雨生红球藻的细胞密度，每隔6D取样一次，用于测定雨生红球藻虾青素的含
15、量。23测定方法231雨生红球藻细胞密度与光密度值（OD）关系的测定收集对数期藻液，置于离心管中离心，用二倍稀释法做1、2、4、8、16、32倍稀释，然后于680NM波长处测定光密度值OD680，再用血球计数板分别对OD值相对应的藻液进行细胞计数。根据所得到结果绘制细胞密度光密度标准曲线，并进行回归分析，算出其回归方程。232雨生红球藻细胞密度的测定从处于诱导阶段中的样品中每隔3天定时取样在680NM处测定其光密度值（OD值），以不加藻种的BBM培养基为调零管。然后根据231步骤所得到的回归方程，计算出培养液中雨生红球藻细胞密度。233虾青素含量的测定每隔6天分别从每瓶藻液中取出25ML藻液，
16、用离心机5000R/MIN离心10MIN，弃去上清液得到雨生红球藻藻细胞沉淀。在收集到的藻细胞沉淀中加入5ML5KOH和30CH3OH的混合液，然后置于70水浴中处理5MIN，用来破坏叶绿素。然后再5000R/MIN离心5MIN，去上清液。将收集到的藻体在液氮下进行研磨5MIN，再加入3ML二甲基亚砜，置于70水浴中处理10MIN，摇匀，然后在高速离心机中以5000R/MIN离心3MIN，取上清液。用二甲基亚砜抽提23次直至藻体发白，取上清液于490NM下测定OD值。按公式C（MG/L）（45A490VA）/VB计算虾青素含量15。其中A表示OD值，VA表示二甲基亚砜的体积，VB表示藻液体积。
17、234数据处理根据实验数据，对结论进行方差分析及相关的处理。24雨生红球藻DXS基因的表达分析用BIOZOL法提取不同浓度MEJA处理雨生红球藻总RNA，采用ONESTEPRTPCR方法来测定目的基因DXS基因的表达。在ONESTEPRTPCR中，以ACTIN蛋白基因（上游引物ACTINF5GAGCAACTGGGATGATATGGC3，下游引物ACTINR5ATTTCGCTTTCAGCAGTGGTT3）作为内标来调整RNA的用量以及循环数，使内标基因在不同浓度MEJA诱导下的表达丰度一致，并在此条件下扩增不同浓度MEJA处理雨生红球藻DXS的表达情况，并且用光密度值的差异来表示目的基因在不同浓
18、度MEJA诱导下的表达量。241ACTIN基因检测分别用不同浓度MEJA处理过的雨生红球藻所提取的RNA为模板，以ACTINF和ACTINR为上下游引物来扩增内标基因，RTPCR扩增反应体系如下21STEPBUFFER125LPRIMESCRIPT1STEPENZYMEMIX1L4ACTINF05LACTINR05LTEMPLATERNA1LRNASEFREEDH2O95LTOTAL25L反应程序设置如下循环次数温度时间15030MIN1942MIN289450S5550S721MIN30S17210MIN14HOLD242目的基因的表达根据已得到的雨生红球藻DXS基因的核心序列，利用PRIM
19、ERPREMIER50软件，设计一对特异性引物上游引物（FDXS1）5AACGAGGTGAAGAGTGCGGAGACC3下游引物（RDXS1）5CGTCAAACACTCGCTCAGGGTAGC3此引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成此引物能扩增得到304BP片段大小的目的基因，用于检测不同浓度MEJA处理条件下的表达情况。用经MEJA处理过的雨生红球藻所提取的RNA为模板，以FDXS1和RDXS1为上下游引物，扩增目的基因，RTPCR扩增反应体系如下21STEPBUFFER125LPRIMESCRIPT1STEPENZYMEMIX1LFDXS105LRDXS105LTEMPLATERNA
20、1LRNASEFREEDH2O95LTOTAL25L反应程序设置如下循环次数温度时间515030MIN1942MIN289430S5830S721MIN17210MIN14HOLD243MEJA诱导条件下雨生红球藻虾青素含量和DXS基因表达量的相关性分析利用GENESCOPE软件将不同质量浓度MEJA诱导下雨生红球藻细胞DXS基因的表达量转换成相对光密度值，与相同条件下的雨生红球藻虾青素含量进行一元线性回归分析，以研究不同质量浓度MEJA诱导下雨生红球藻虾青素含量和DXS基因表达量之间的线性关系。3结果与分析31雨生红球藻细胞密度与光密度值的回归方程用血球计数法得到的细胞密度与其在680NM的
21、光吸收值的回归分析发现，雨生红球藻细胞数量与680NM处的OD值呈线性相关（图1），回归方程为OD68000434X00481，式中X为每毫升藻液的细胞个数，此方程的相关系数为09811。由此可以得出结论，OD680可以反映雨生红球藻细胞的生长情况。Y00434X00481R0981100500000005001000150020002500300035004000246810细胞密度（105个/ML）OD680图1雨生红球藻细胞密度与光密度（OD680）的标准曲线FIG1THESTANDARDCURVEOFCELLDENSITYANDLIGHTDENSITYINHAEMATOCOCCUSPL
22、UVIALIS32MEJA对雨生红球藻生长的影响研究不同浓度MEJA处理的雨生红球藻细胞生长的情况，结果表明图2。雨生红球藻细胞的生长量随着培养时间的延长逐渐增加。对照组即不添加MEJA的培养基藻细胞生长迅速；添加了不同浓度MEJA的培养基，雨生红球藻细胞生长相比于对照组受到了一定的抑制，而当MEJA浓度为1600MOL/L，藻细胞基本不生长，受到了明显的抑制。研究不同浓度MEJA处理的雨生红球藻，比较其对数生长期18D的细胞密度。结果表明图3，添加了MEJA处理组的藻细胞密度均低于对照组，MEJA会抑制雨生红球藻细胞的生长。当MEJA浓度为0MOL/L6时，即对照组的藻细胞密度最高，达到了1
23、029106CELLS/ML。方差分析如表1所示。单位MOL/L0020406080100120140160180200036912151821242730诱导时间/D细胞密度/105CELLSML10501002004008001600图2MEJA对雨生红球藻细胞生长的影响FIG2THEEFFECTOFMEJAONTHECELLGROWTHOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS1029071755652670975061451816000204060801001200501002004008001600MEJA质量浓度/MOLL1细胞密度/105CELLSML1图3不同质量浓度ME
24、JA对雨生红球藻细胞生长的影响18DFIG3THEEFFECTOFDIFFERENTCONCENTRATIONMEJAONTHECELLGROWTHOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS18D7表1不同质量浓度MEJA处理雨生红球藻细胞密度的方差分析（18D）TABLE1THEVARIANCEANALYSISOFTHECELLDENSITYOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISTREATEDWITHDIFFERENTCONCENTRATIONOFMEJA18D离差来源离差平方和自由度均方F比因素133632622272FA1422F0016,14446误差219331415
25、67总和1555652033MEJA对雨生红球藻总虾青素产量的影响研究不同浓度MEJA处理的雨生红球藻总虾青素产量的情况，结果表明图4，雨生红球藻总虾青素产量随着培养时间的延长逐渐增加。当MEJA浓度为1600MOL/L时，总虾青素产量最低，可能是因为藻细胞死亡而不能积累虾青素。而当MEJA浓度分别为0，50，100，200，400，800MOL/L时，雨生红球藻虾青素总量随着时间的延长呈对数增长的趋势。研究不同浓度MEJA处理的雨生红球藻，比较其对数生长期18D的总虾青素产量。结果表明图5，添加MEJA处理组的总虾青素产量均低于对照组，说明MEJA抑制总虾青素产量。当MEJA的处理浓度为0M
26、OL/L时，即对照组的总虾青素产量最高，达到了1466MG/L。单位MOL/L00051015202530350612182430诱导时间/D总虾青素产量/MGL10501002004008001600图4MEJA对雨生红球藻总虾青素产量的影响FIG4THEEFFECTOFMEJAONTHETOTALASTAXANTHINPRODUCTIONOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS814661000111409601100131301130002040608101214160501002004008001600MEJA质量浓度/MOLL1总虾青素产量/MGL1图5不同质量浓度MEJA诱
27、导条件下雨生红球藻的总虾青素产量18DFIG5THEINDUCEMENTOFDIFFERENTCONCENTRATIONMEJAONTHETOTALASTAXANTHINPRODUCTIONOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS18D34MEJA对雨生红球藻虾青素含量的影响根据已经测得的雨生红球藻总虾青素产量和细胞密度，计算得到不同浓度MEJA处理后的雨生红球藻在其对数生长期18D的虾青素含量，代表雨生红球藻的虾青素生物合成能力。研究结果表明图6，雨生红球藻单位细胞虾青素含量随着MEJA浓度的增加呈先升高后降低的趋势。当MEJA的处理浓度为800MOL/L时，雨生红球藻细胞虾青素的合
28、成能力最强，达到了175109MG/CELLS，与对照组比较142109MG/CELLS增加了2324。方差分析如表2所示。142E04139E04137E04170E04164E04175E04782E05000E00400E05800E05120E04160E04200E040501002004008001600MEJA质量浓度（MOL/L）虾青素含量（MG/105CELLS）图6不同质量浓度MEJA诱导条件下雨生红球藻单位细胞的虾青素含量（18D）FIG6THEINDUCEMENTOFDIFFERENTCONCENTRATIONMEJAONTHEUNICELLULARASTAXANTHI
29、NCONTENTOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALIS18D910000919055314861377216204950005101520250501002004008001600MEJA质量浓度MOL/L相对光密度值表2不同质量浓度MEJA处理雨生红球藻虾青素含量的方差分析（18D）TABLE2THEVARIANCEANALYSISOFTHEASTAXANTHINCONTENTOFHAEMATOCOCCUSPLUVIALISTREATEDWITHDIFFERENTCONCENTRATIONOFMEJA18D离差来源离差平方和自由度均方F比因素193E086322E09FA454F0
30、016,14446误差992E0914709E10总和292E082035MEJA诱导下雨生红球藻虾青素含量和DXS基因表达量的关系通过研究不同浓度MEJA诱导下雨生红球藻DXS基因的表达情况，结果表明图7，雨生红球藻DXS基因表达随着MEJA浓度的增加，呈先增加后降低的趋势，当MEJA的处理浓度为800MOL/L时，雨生红球藻DXS基因的表达最强。图7不同质量浓度MEJA诱导下雨生红球藻细胞DXS基因的表达水平FIG7THEINDUCEMENTOFDIFFERENTCONCENTRATIONMEJAONTHEDXSGENEEXPRESSIONLEVELOFHAEMATOCOCCUSPLUVI
31、ALIS通过不同浓度MEJA诱导下的雨生红球藻虾青素含量和DXS基因表达量之间相关性的比较，结果表明，雨生红球藻虾青素含量随着DXS基因表达水平增强而提高；同样，雨生红球藻虾青素含量随着DXS基因表达水平减弱而降低，两者呈现正相关系。通过回归分析发现，MEJA处理的雨生红球藻虾青素含量和DXS基因表达量呈线性相关，回归方程为Y5105X9105式中Y为虾青素含量，X为DXS基因表达量，该方程的相关系数R0981。由此可以得出结论，DXS基因表达水平可以较准确反映雨生红球藻的虾青素含量，从而可以得出DXS基因是雨生红球藻虾青素合成过程中的一个关键酶基因。104讨论外源性茉莉酸类化合物能刺激植物次
32、生代谢物的生物合成2223，可引起植物次生代谢产物的迅速积累，其作用具有广泛性，能诱导包括萜类、黄酮类、生物碱类等化合物的积累。桂连友等24应用外源MEJA处理烟草NICOTIANATABACUM可诱导烟草从头合成烟碱，使整株烟草的烟碱含量提高210倍。杨英等25以胀果甘草GLYCYRRHIZAINFLATEBAT悬浮细胞为材料，在对数期第11D添加200MOL/LMEJA时，黄酮含量和产量最大，达1127MG/G和9018MG/L，分别为对照的360和339倍。王学勇等26研究发现，丹参SALVIAMILTIORRHIZA毛状根经MEJA处理后2，6，9D后其隐丹参酮的含量分别是对照的22，
33、85，238倍。本研究表明，添加了MEJA的处理组均抑制了雨生红球藻细胞的生长，可能是由于MEJA营造了一个不适合雨生红球藻生长繁殖的胁迫条件，导致细胞密度降低。但MEJA能够促进雨生红球藻单位细胞虾青素的合成。经200800MOL/LMEJA处理后，雨生红球藻内的虾青素含量均有不同程度的提高，其中，当MEJA浓度为800MOL/L时，单位细胞虾青素含量最高，达175109MG/CELLS，相比对照组（142109MG/CELLS）增加2324。与前人在其它植物和藻类中的研究结果一致。DXS是MEP途径上的第一个酶，也是第一个关键酶，其作用是催化丙酮酸和G3P生成1脱氧D木酮糖5磷酸，该步骤是
34、植物萜类合成的第一步限速步骤2728。GONG等6研究表明，用甲基茉莉酸处理银杏细胞后，银杏内酯含量与银杏DXS的表达水平成正比，表明由DXS催化的酶促反应是银杏内酯生物合成的重要调节步骤，DXS是实现银杏内酯代谢工程的重要候选功能基因。本研究结果也表明，雨生红球藻虾青素含量与DXS基因表达量成正比，与其它植物报道结果一致。5小结1）MEJA处理不利于雨生红球藻的生长。通过方差分析表明，不同浓度MEJA处理的雨生红球藻细胞的生长有极显著差异P001。当MEJA的处理浓度为0MOL/L时，雨生红球藻细胞密度最高，达到了10290105CELLS/ML。2）MEJA处理降低雨生红球藻的总虾青素产量
35、。添加了MEJA处理组的总虾青素产量均低于对照组。当MEJA的处理浓度为0MOL/L时，即对照组，总虾青素产量最高，达1466MG/L。3）MEJA处理下，雨生红球藻虾青素含量呈先升高后降低的趋势。通过方差分析表明，不同浓度MEJA的处理对雨生红球藻虾青素含量的影响有极显著差异P001。当MEJA的处理浓度为800MOL/L时，虾青素含量最高，达到了175104MG/105CELLS，与对照组比较（142104MG/105CELLS）增加2324。4）通过不同浓度MEJA诱导下的雨生红球藻虾青素含量和DXS基因表达量之间相关性的比较，结果表明，雨生红球藻虾青素含量随着DXS基因表达水平增强而提
36、高；同样，雨生红球藻虾青素含量随着DXS基因表达水平减弱而降低，两者呈现正相关系。由此可以得出结论，DXS基因表达水平可以较准确反映雨生红球藻的虾青素含量，从而可以得出DXS基因是雨生红球藻虾青素合成过程中的一个关键酶基因。11参考文献1RICHMONDAHANDBOOKOFMICROALGALCULTUREBIOTECHNOLOGYANDAPPLIEDPHYCOLOGYMIOWA,USABLACKWELLSCIENCELTD,20042812882SHIBATAA,KIBAY,ALATIN,ETALMOLECULARCHARACTERISTICSOFASTAXANTHINANDBETACAR
37、OTENEINTHEPHOSPHOLIPIDS,MONOLAYERANDTHEIRDISTRIBUTIONSINTHEPHOSPHOLIPIDSBILAYERJCHEMISTRYPHYSICSLIPIDS,2001,1111223殷明炎,刘建国,张京浦,等雨生红球藻和虾青素研究述评J海洋湖沼通报,1998,253624魏东,藏晓南大规模培养雨生红球藻生产天然虾青素的研究进展和产业化现状J中国海洋药物,2001,5485GUNDLACHH,MULLERMJ,KUTCHANTM,ETALJASMONICACIDISASIGNALTRANSDUCERINELICITORINDUCEDPLANTCEL
38、LCULTURESJPROCNATLACADSCIUSA,1992,89238923926GONGYF,LIAOZH,CHENM,ETALMOLECULARCLONINGANDEXPRESSIONPROFILEANALYSISOFGINKGOBILOBADXSGENEENCODING1DEOXYDXYLULOSE5PHOSPHATESYNTHASE,THEFIRSTCOMMITTEDENZYMEOFTHE2CMETHYLDERYTHRITOL4PHOSPHATEPATHWAYJPLANTAMEDICA,2006,723293357KANGSM,MINJY,KIMYD,ETALEFFECTSOF
39、METHYLJASMONATEANDSALICYLICACIDONTHEPRODUCTIONOFBILOBALIDEANDGINKGOLIDESINCELLCULTURESOFGINKGOBILOBAJINVITROCELLDEVBIOLPLANT,2006,42144498余龙江,朱敏,刘幸福,等MEJA对中国红豆杉胚性细胞紫杉醇生物合成的影响J武汉植物学研究,1999,1743713749朱颖,王丽丽,柴芸彬,等茉莉酸甲酯对杜氏盐藻胡萝卜素含量的影响宁波大学学报,2010，231131710陈兴才,黄伟光,欧阳琴雨生红球藻的培养及虾青素累积条件的探讨J福州大学学报自然科学版,2005,33
40、225926311苗凤萍,李夜光,耿亚红温度对雨生红球藻HAEMATOCOCCUSPLUVIALIS生物量和虾青素产量的影响J武汉植物学研究,2005,231737612蒋霞敏,柳敏海,任凯来化学因子对雨生红球藻诱变株虾青素积累的调控J宁波大学学报理工版,2005,18330631213董庆霖,赵学明,邢向英,等碳和氮代谢被抑制诱导雨生红球藻细胞内虾青素的合J化学工程,2006,34124648,5714LIAOZH,CHENM,GONGYF,ETALISOPRENOIDBIOSYNTHESISINPLANTSPATHWAYS,GENE,REGULATIONANDMETABOLICENGINE
41、ERINGJJBIOLSCI,2006,6120921915ROHMERMTHEDISCOVERYOFAMEVALONATEINDEPENDENTPATHWAYFORISOPRENOIDBIOSYNTHESISINBACTERIA,ALGAEANDHIGHERPLANTSJNATPRODREP,1999,1656557416BOUVIERF,DHARLINGUEA,SUIREC,ETALDEDICATEDROLESOFPLASTIDTRANSKETOLASESDURINGTHEEARLYONSETOFISOPRENOIDBIOSYNTHESISINPEPERFRUITSJPLANTA,1998
42、,1171423143117CHAHEDK,OUDINA,GUIVARCHN,ETAL1DEOXYDXYLULOSE5PHOSPHATESYNTHASEFROMPERIWINKLECDNA12IDENTIFICATIONANDINDUCEDGENEEXPRESSIONINTERPENOIDINDOLEALKALOIDPRODUCINGCELLSJPLANTPHYSIOLBIOCHEM,2000,3855956618LOISLM,RODRGUEZCONCEPCINM,GALLEGO,ETALCAROTENOIDBIOSYNTHESISDURINGTOMATOFRUITDEVELOPMENTREG
43、ULATORYROLEOF1DEOXYDXYLULOSE5PHOSPHATESYNTHASEJPLANTJ,2000,22650351319王丽丽、龚一富雨生红球藻虾青素合成关键酶基因DXS的克隆及生物信息学分析J广东省研究生学术论坛论文集,2008,14415120陈晓飞,严小军红球藻虾青素含量测定方法的探讨J宁波大学学报理工版,2007,20444144521袁志发,周静芋试验设计与分析M高等教育出版社,20001728822MUELLERMJ,BRODSCHELMW,SPANNAGLESIGNALINGINTHEELICITATIONPROCESSISMEDIATEDTHROUGHTHE
44、OCTADECANOIDPATHWAYLEADINGTOJASMONICACIDJPROCNATLACADSCIUSA,1993,907490749423TAMOGAMIS,RAKWALR,KODAMOPHYTOALEXINPRODUCTIONELICITEDBYEXOGENOUSLYAPPLIEDJASMONICACIDINRICELEAVESORYZASATIVALISUNDERTHECONTROLOFCYTOKININSANDASCORBICACIDJFEBSLETT,1997,412616424桂连友,刘树生,陈宗懋外源茉莉酸和MEJA诱导植物抗虫作用及其机理J昆虫学报,2004,47
45、450751425杨英,郑辉,何峰不同浓度茉莉酸甲酯对悬浮培养的胀果甘草细胞合成甘草总黄酮的影响J云南植物研究,2008,30558659226王学勇,崔光红,黄璐琦,等诱导子对丹参毛状根中丹参酮类成分积累影响J中国中药杂志,2007,321097697927KOBAYASHIM,SAKAMOTOYSINGLETOXYGENQUENCHINGABILITYOFASTAXANTHINESTERSFROMTHEGREENALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISJBIOTECHNOLLETT,1999,2126526928金蓉,朱长青,徐昌杰1脱氧木酮糖5磷酸合成酶（DXS）及其编码基因
46、J细胞生物学杂志,2007,2970671229MAKIOK,YOSHIROKANDYASUNOBUTLIGHTINDEPENDENT,ASTAXANTHINPRODUCTIONBYTHEGREENMICROALGAHAEMATOCOCCUSPLUVIALISUNDERSALTSTRESSJBIOTECHNOLOGYLETTERS,199750750930LETICIASANCHEZESTUDILLO,YOLANDAFREILEPELEGRIN,RENATARIVERAMADRID,ETALREGULATIONOFTWOPHOTOSYNTHETICPIGMENTRELATEDGENESDURINGSTRESSINDUCEDPIGMENTFORMATIONINTHEGREENALGA,DUNALIELLASALINAJBIOTECHNOLLETT,2006,28787791
