1、本科毕业设计（20_届）橘子及其加工制品中的赤霉素检测所在学院专业班级食品质量与安全学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录1引言111橘子及其加工制品的进出口现状112赤霉素的作用113赤霉素的检测现状1131高效液相色谱法1132液相色谱串联质谱法2133气相色谱法和GCMS法214研究的目的与意义22实验材料与方法321仪器与设备322试剂和材料323实验步骤4231提取4232净化4233检测424色谱条件4241液相色谱参考条件4242质谱参考条件525结果计算5251计算赤霉素的回收率6252计算橘子样品中赤霉素的残留量63结果与讨论631前处理方法的优化6311提取液的确定63
2、12提取过程的条件优化6313固相萃取柱的选择732色谱条件的优化9321流动相的选择9322进样量的大小的确立933检测仪器的改进9331高效液相色谱法9332液相色谱串联质谱法10333超级液相色谱串联质谱法1034标准曲线的绘制及最低检测限1135回收率及变异系数的测定1236橘子样品的检测134结论13致谢错误未定义书签。参考文献13摘要本论文提出了在橘子及其加工制品中检测赤霉素残留的高效液相色谱串联质谱方法。橘子样品采用90的丙酮溶液提取，经MAX柱净化，最后用甲醇定容检测。色谱柱为ATLANTISC18柱3M,21MM150MM；流动相为甲醇水及001MM的磷酸缓冲液；赤霉素质谱测
3、定的定量离子对为34502390，主要定性离子对分别为34501431、34502211以及3450831。赤霉素浓度在001G/ML01G/ML范围内，药物峰面积与浓度呈良好的线性关系，其相关系数为09991。该方法具有较好的回收率及稳定性，赤霉素的最低检测限为001G/ML定量下限可达2G/KG，低于美国、日本等国家和地区对赤霉素在水果蔬菜中的最高残留02PPM的规定。关键词橘子及其加工制品；赤霉素；液相色谱串联质谱；检测ABSTRACTAMETHODOFLCMSMSFORTHEDETECTIONOFGIBBERELLINRESIDUEINMANDARINORANGEANDITSPROCE
4、SSINGPRODUCESHASBEENDEVELOPEDSAMPLESWEREEXTRACTEDWITH90ACETONEWATERSOLUTIONBEFOREBEINGPURIFIEDBYMAXSOLIDPHASEATLAST,USINGMETHANOLTOMAKETHEVOLUMECONSTANTTHESOLUTIONWASSEPARATEDONAC18REVERSEDPHASECOLUMN3M,21MM150MM,USINGMETHANOLWATERCONTAINING001MMPHOSPHATEASTHEMOBILEPHASEQUALITATIVEIONOFSRMWAS3450239
5、0FORGA3,ANDITSMAINQUALITATIVEIONSWERE34501431,34502211AND3450831GOODLINEARITIESWEREFOUNDWITHINTHERANGESOF00101G/MLFORGA3,ITSRELATIVECORRELATIONCOEFFICIENTWAS09991THERESULTWITHGOODRECOVERYANDSTABILITYSHOWEDTHATTHISMETHODWASVERYSUITABLETHELIMITOFDETECTIONWAS001G/MLANDTHELOWERLIMITOFQUANTIFICATIONWAS2G
6、/KGITHASBEENUNDER02PPMWHATISDEMANDEDTOFRUITSANDVEGETABLESFORGA3INTHELAWOFCOUNTRIESLIKEUSAANDJAPANANDOTHERREGIONSKEYWORDSMANDARINORANGEANDITSPROCESSINGPRODUCESGIBBERELLINLCMSMSDETECTION11引言11橘子及其加工制品的进出口现状橘子含水量高、营养丰富，含大量维生素C、枸橼酸及葡萄糖等十余种营养物质。食用得当，能补益肌体，特别对患有慢性肝炎和高血压患者，多吃蜜橘可以提高肝脏解毒作用，加速胆固醇转化，防止动脉硬化。橘子及
7、橘子罐头是中国的大宗出口产品，已成为部分地区主要的经济来源。十年前，凭借着原料价格和人力资源的相对优势，中国橘子罐头就迅速占领了日本市场和欧美市场，成了进口商的抢手货，成交额约占世界贸易量的80以上。2002年中国橘子罐头的出口约占世界贸易量的三分之一。中国罐头行业的出口强势引起了西班牙的不满，以往该国产品也主要销往欧美市场，是与中国竞争市场份额的惟一对手。西班牙不甘心自己的失利，向欧盟委员会提出申请，希望对原产于中国的橘子罐头采取保障措施1，欧盟将研究上调该产品的关税或采取限额进口的做法。浙江省是橘子罐头生产大省，占全国产量的80，全世界产量的70，对欧盟的出口量也在全国各省份中居于首位。据
8、宁波检验检疫局统计，2007年，宁波地区共出口桔子罐头9238968吨，金额730620万美元，比上年分别增长072和372，约为全国出口桔子罐头总量的三分之一，成为全国出口桔子罐头最多的城市。据象山检验检疫局统计，2010年前10个月，象山地区共出口橘子罐头1026批、2943374吨、货值32815万美元，同比分别增长162、197和14。12赤霉素的作用赤霉素是一种广谱性植物生长调节剂，几乎在植物生长、发育的各个阶段都起着调节作用。赤霉素在植物体内的形成部位一般是嫩叶、芽、幼根以及未成熟的种子等幼嫩组织。1926年日本病理学家黑泽在水稻恶苗病的研究中发现水稻植株发生徒长是由赤霉菌的分泌物
9、所引起的。1935年日本薮田从水稻赤霉菌中分离出一种活性制品，并得到结晶，定名为赤霉素（GA）。第一种被分离鉴定的赤霉素称为赤霉酸（GA3），化学式见下图1。目前，已从高等植物和微生物中分离出70余种赤霉素。图1赤霉素化学结构式赤霉素中生理活性最强、研究最多的是GA3。它能显著地促进植物茎、叶生长，特别是对遗传型和生理型的矮生植物有明显的促进作用；能代替某些种子萌发所需要的光照和低温条件，从而促进发芽；可使长日照植物在短日照条件下开花，缩短生活周期；能诱导开花，增加瓜类的雄花数，诱导单性结实，提高坐果率，促进果实生长，延缓果实衰老。除此之外，GA3还可用于防止果皮腐烂；在棉花盛花期喷洒能减少蕾
10、铃脱落；马铃薯浸种可打破休眠；大麦浸种可提高麦芽糖产量等等。13赤霉素的检测现状131高效液相色谱法2高效液相色谱是目前应用最多的色谱分析方法。在70年代末，高效液相色谱开始逐步用于检测除乙烯以外的植物激素。国外研究者那时也开始研究用高效液相色谱仪来分离检测赤霉素GA3组份的含量了。REEVE等人在把赤霉素各组份的羧基酯化后，再用高效液相色仪来分离其酯化衍生物。LINJT等则是用反相高效液相色谱技术来直接分离赤霉素各组份。实验证明2高效液相色谱对赤霉素的定性、定量测量是准确可靠的。目前，高效液相色谱除了可以有效地分离植物内的各个赤霉素同系物，同时还可以用于赤霉素的定量检测。朱曙东等3在研究赤霉
11、素的定量检测方法时，运用RPHPLC成功地将GA3与其它组分分离，建立了精确测定GA3含量的新方法。其优越性全面超出各传统分析方法，可望成为赤霉素质量分析的标准方法。黄红林等4研究建立了固相萃取高效液相色谱SPEHPLC法来分析测定番茄中赤霉素GA3残留量。132液相色谱串联质谱法随着联用技术的日趋完善，HPLCMS逐渐成为最热门的分析手段之一。HPLCMS作为已经比较成熟的技术，目前己在生化分析、天然产物分析、药物和保健食品分析以及环境污染物分析等许多领域得到了广泛的应用。利用HPLCMS分析混合样品，和其他方法相比具有高效快速，灵敏度高，只需品进行简单预处理或衍生化，尤其适用于含量少、不易
12、分离得到或在分离过程中易的组分。梁沛等5采用固相萃取技术对样品进行处理，以液相色谱串联质谱为检测手段，建立了测定水果中赤霉素GA3残留的新方法，可以为确定赤霉素残留标准提供实验依据。刘艳琴等6也采用高效液相色谱一串联四极杆质谱联来测定水果和蔬菜中赤霉素，并建立了相关的检测方法。该法具有样品处理简单、测定周期短等优点，适用于大量样品的快速筛选、测定。王骏等7建立用HPLCMS测定猕猴桃中赤霉素和脱落酸残留量的方法。盛杰厚等8则是采用固相萃取和液质联用仪，同时检测小麦种的赤霉素、吲哚乙酸和脱落酸，并获得了较高的回收率。133气相色谱法和GCMS法近年来，质谱仪的出现为检测果蔬中的赤霉素创造了条件。
13、采用GC和GCMS等仪器进行分析检测，灵敏度高，重复性好，尤其适用于痕量植物样品的测定。气相色谱常被用于检测植物果蔬中的各种农药残留，特别适用于挥发性的物质的检测。付磊9研究草莓中外源植物激素GA3时采用气相色谱进行检测分析，建立了一种采用530M大口径毛细管色谱柱、不经衍生化处理而直接测定植物生长素GA3的气相色谱方法。许庆琴等10对不同固定相的大口径毛细管柱进行了考察，发现赤霉素在非极性固定相毛细管柱中不仅灵敏度高、出峰速度快，而且重现性好。采用太口径毛细管色谱柱，无需衍生化处理，直接进样测定样品中赤霉素含量结果令人满意。为了更加准确地对赤霉素进行定性分析，很多研究中往往采用灵敏度高、检测
14、限较低的质谱仪，特别能适用于在植物中含量本身就比较微量的赤霉素。黄红林等11采用固相萃取代替传统的液液萃取，研究了样品在C18萃取柱上的保留行为，纯化效果显著。采用HP1的色谱柱，无需柱前衍生化，直接进样GCMS测定，选择离子监测SIM克服了样品基体干扰，灵敏度较全谱扫描高。并建立了固相萃气相色谱质谱选择离子SPEGCMS直接分析果品中赤霉素GA3残留量的方法。马焕普12已将GCMS方法用于检测苹果种子层积过程中GA7的变化，并获得了相关的检测数据。吴萍等13先借助生物试法对芥蓝中的赤霉素进行必要的分离纯化，并采用质谱法进行检测，从而实现了对芥蓝种子中GAS的定性、定量分析。14研究的目的与意
15、义我国加入世贸组织后，在外贸进出口方面，从我国出口的食品由于杂质、农药残留14及食物添加剂含3量高、标签不清等问题而屡有退货，不仅损害我国农产品出口，也给国家形象和信誉带来了负面影响。作为技术壁垒之一，欧盟成员国已开始高度关注中国橘子罐头的农药残留问题，鉴于目前没有确凿证据，不能采取保护措施，为此把目光转向了反倾销条款，以对付中国橘子罐头的外销。赤霉素作用广泛15,16，但属于低毒植物生长调节剂，当大量使用时会产生一定毒性。根据日本肯定列表最终数据查询2006年5月29日起实施暂定菠菜、菠萝、草菇、草莓、橙包括脐橙、葱包括韭葱大白菜、大蒜、豆瓣菜、鳄梨、番木瓜、番茄、番石榴、繁殖洋葱等使用的最
16、高限量MRL为02PPM。美国USA允许苹果中的农药残留限量要求（1999年3月15日）联邦法律条款（40CFR120）赤霉素残留限量（TOLERANCE,PPM）为05。中国台湾2007年2月1日公布了有关食品内杀虫剂残留限量草案以及拟撤消杀虫剂最大残留限量MRLS遗漏名单中的杀虫剂，草案对芹菜内的赤霉素GIBBERELLICACID也规定了最大残留限量。随着橘子罐头出口量的不断增长，势必对橘子罐头的相关农药残留等的检测也会越来越严格。为提升出口罐头食品安全卫生质量，相关监督检验机关要紧抓源头监管、辅料添加剂使用管理、产品质量安全管理体系等关键环节，对基地实施区域化管理模式，有效运行食品农产
17、品风险管理系统，大大促进橘子罐头的质量提升。目前我国产品标准的制定，修订相对滞后，与国际标准和国外先进标准差距较大，从而带来了检验检疫的标准水平的差距。据相关资料显示，我国现在对于赤霉素检测的标准只有以下两个SN03501995出口水果中赤霉素残留量检验方法（METHODFORTHEDETERMINATIONOFGIBBERELLICACIDRESIDUESINFRUITSFOREXPORT）。此为行业标准，主要采用方法为荧光分光光度计法。DB11T3792006豆芽中4氯苯氧乙酸钠6苄基腺嘌呤2,4滴赤霉素福美双的测定17，此为北京地方标准，主要采用方法为HPLCDAD法。本文的研究目的就是
18、建立一种简单、灵敏的检测橘子及其加工制品中赤霉素的方法。2实验材料与方法21仪器与设备AGILENT1100高效液相色谱仪（AGILENT公司，美国）；API3000液质联用仪，配ESI源（APPLIEDBIOSYSTEMS公司,美国）；电子天平（PL2002型，中国上海）；冷冻离心机（SIGMA3K30，西格马公司）；台式分散仪（PTMR2100型，瑞士）；氮吹仪（ORGANOMATIONASSOCIATES,美国JNC公司）；旋涡混合仪（VOTEXGENIE2型，德国）；超声波清洗器（250LH型，KUDOS公司）；超纯水器MILLIQ（MILLIPORECO公司，美国）；多功能食品粉碎机
19、（HL2070型）；固相萃取装置（SUPELCO）；固相萃取柱（WATERS公司，OASISMAX150MG，6CC；ZYMARK，HOPKINTON，MAX）；广范PH试纸（上海三爱思试剂有限公司）；22试剂和材料实验中用到的主要试剂如下，如非特别说明，所列试剂均为分析纯，水为蒸馏水。丙酮（分析纯，中国杭州化学试剂有限公司，浙江）；甲醇（色谱纯，PRODUCTOFTEDIA，UNITEDSTATEOFAMERICA）；4甲酸（色谱级，MADEINUSA；CAS64186）；氨水（分析纯；浓度25；上海国药试剂集团有限公司）；磷酸（分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司）。甲酸甲醇溶液10。准确
20、吸取甲酸溶液50ML，用甲醇定容到500ML，临配临用。磷酸溶液001MM。准确称取098G，用水定容到1000ML，超声混合后用于液相色谱流动相。丙酮水溶液（91体积比）移取100ML体积水加到900ML丙酮溶液中，混匀备用。赤霉素标准品纯度98；CAS号77065。标准品储备液及工作液准确称取10001MG标准物质，用甲醇水溶液（82）溶解于10ML棕色容量瓶中于超声波清洗器数分钟促进溶解，定容后配成为1000G/ML浓度的标准储备液；将储备液置于4冰箱中保存备用；使用期6个月。准确吸取100L标准储备液，用甲醇水溶液（82）配成浓度为100NG/ML，根据具体需要再做进一步稀释配置，临配
21、临用。实验样品橘子购自宁波大学农贸市场，打样后冷冻保存，实验中所用橘子均采用此。橘子罐头来自宁波检验检疫局食品分中心抽检样品。23实验步骤231提取准确称取制备均匀的试样约5G左右（精确至001G）于离心管中，加入水50ML；然后加入90的丙酮水溶液35ML，充分旋涡混合1MIN，超声提取15MIN；4000R/MIN高速离心10MIN后，将提取液转入150ML鸡心瓶收集,再用丙酮水溶液20ML同样复提取一遍，合并滤液。将提取液旋转蒸发至低于30ML，转入另一干净的50ML塑料离心管，并加入丙酮水溶液补足至30ML后，往上述初步浓缩提取液中加入约05ML氨水，混合均匀后用精密PH试纸确认溶液P
22、H9，否则需要继续用氨水调节溶液PH。232净化采用固相萃取小柱0ASISMAX净化将提取步骤所得的30ML提取浓缩液上样，控制过柱滴出液排放速度在12滴/秒左右；完成后分别用5ML水、5ML甲醇过柱淋洗。小柱抽干后，用8ML的10甲酸甲醇溶液进行洗脱。将收集到的洗脱溶液40下氮气吹至近干，准确加入10ML甲醇水（82）溶液，待测。233检测设置好相关的色谱条件和质谱条件，用API3000液质联用仪对待测的样品进行检测。24色谱条件241液相色谱参考条件色谱柱WATERSATLANTISC18柱3M,21MM150MM，或相当者；柱温30；流速250L/MIN；进样量10L；流动相001MM磷
23、酸溶液，液相梯度见表1。表1液相色谱流动相梯度表TABLE1THEGRADIENTOFHPLCMOBILEPHASE时间TMINA甲醇（）B001MM磷酸溶液流速L/MIN500040012001400190015858515158515158585250250250250250242质谱参考条件离子源ESI电离源；扫描方式负离子扫描（）；检测方式多反应离子监测（MULTIPLEREACTIONMONITORING，MRM）；电喷雾电压（IONSPRAYVOLTAGE，IS）4000V雾化气（NEBULIZERGAS；NEB）相对开放流量14ML/MIN；气帘气（CURTAINGAS；CUR）
24、相对开放流量7ML/MIN；离子源温度（TEMPERATURE，TEM）500；碰撞池出口电压/V（COLLISIONEXITPOTENTIAL，CXP）6V；选择离子驻留时间（DWELL）50MSEC；碰撞池入口电压（ENTRANCEPOTENTIAL，EP）100V；碰撞气COLLISIONGAS，CAD相对开放流量8ML/MIN；辅助气流压力（ACCESSORIALAIRFLOWPRESSURE）60PSI；去簇电压（DECLUSTERPOTENTIAL，DP）50V；焦环聚焦电压（FOCUSINGPOTENTIAL，FP）150V；喷雾器放电针电流（NEBULIZERCURRENT，N
25、C）2A；其他仪器参数（DETECTORPARAMETERSPOSITIVE）DF2000V；CEM23000V。赤霉素的定性离子对、定量离子对6、碰撞能量见表2。表2赤霉素的中英文名称、定性离子对、定量离子对、碰撞能量TABLE2THECHINESENAMEANDENGLISHNAMEOFGA3,QUALITATIVEIONANDQUANTITATIVEIONSFORGA3化合物中文名称化合物英文名称提取离子对/M/Z碰撞能量（CE）/V赤霉素GIBBERELLICACID3450/239003450/143103450/221103450/8310036213137注“”标识为提取离子中的
26、方法定量离子对。NOTETHEIONWHICHISWITH“”ISTHEQUANTITATIVEIONINTHEEXTRACTEDIONS25结果计算6251计算赤霉素的回收率XACSV/ASM式中X药物的回收率（）A加标橘子样品测定出的峰面积CS标准液中药物的浓度NG/MLV橘子样品前处理最后定容所用甲醇的体积MLAS标准液中药物的峰面积M所加入的药品量（NG）注计算结果需扣除空白值。252计算橘子样品中赤霉素的残留量YACSV/ASM式中Y样品中赤霉素的残留NG/GA在样品中测定出的峰面积CS标准液中赤霉素的浓度NG/MLV样品前处理最后定容所用甲醇的体积MLAS标准液中赤霉素的峰面积M样
27、品的称取量G注计算结果需扣除空白值。3结果与讨论31前处理方法的优化311提取液的确定赤霉素能溶于醇类、丙酮、乙酸乙酯，难溶于水，不溶于石油等有机溶剂。相关文献报道赤霉素的提取剂一般为甲醇、丙酮，黄红林等4经实验研究结果表明丙酮一水体系提取效果最佳。因此，本实验采用丙酮水溶液作为提取液。实验中选择70，80，90等不同浓度的丙酮水溶液进行提取，结果表明丙酮水（VV/91）体系时的回收率较高，提取效果最佳。312提取过程的条件优化减慢转速，降低水浴温度。通过多次的实验观察发现，经90丙酮水溶液提取后的滤液沸点较低，在旋转蒸发过程中，溶液易发生剧烈沸腾，不少液滴会溅到鸡心瓶瓶口，甚至溅出瓶外，从而
28、造成待测物质的流失。因此，在实验过程中要随时观察旋转蒸发过程中鸡心瓶中的状况，出现上述情况应立即停止旋蒸；要将提取液集中放入容量较大的鸡心瓶中，同时，适当减慢旋转的速度，控制水浴锅的温度低于40，从而减少或避免上述情况的出现。用蒸馏水定容，减少有机溶剂的使用。在旋转蒸发至溶液体积小于20ML时，停止旋蒸，将浓缩液全部转移至离心管中，加90丙酮溶液进7行洗涤，并全部转移至离心管，定容至30ML。实验结果表明，用蒸馏水进行定容并不会影响最终的测定结果。因此，本实验采用蒸馏水对浓缩液进行定容，以减少有机溶剂的使用量，降低检测成本，减少环境污染。根据SPE小柱性质，调节溶液酸碱度。不同的固相萃取柱对溶
29、液的PH值有不同的要求，尤其是MAX柱和MCX柱。同时由于赤霉素在不同的PH值下的稳定性不同，因此，在净化前需要添加酸（盐酸）溶液或碱（氨水）溶液进行PH的调节，并用PH试纸进行测定。实验结果表明，MAX小柱的净化效果最佳，因此每次都要对浓缩液进行酸碱度的调节。313固相萃取柱的选择针对待检样品所含的成分的不同，挑选适当的固相萃取柱对样品进行净化处理。根据相关文献4表明，使用C18小柱对番茄样品能起到了好的净化效果，特别是对样品提取液中色素、可溶性糖、酯的去除。王骏等人7在测定猕猴桃中的赤霉素等成分时，采用兼有阴离子交换和反相机理的MAX固相萃取柱再次净化，可以选择性的保留赤霉素和脱落酸阴离子
30、，而有效去除其他的杂质，净化效果显著。本实验分别采用MAX柱、MCX柱、HLB柱及C18柱进行净化，检测得到的样品色谱图（见图25）。实验结果表明，MCX柱由于要求碱性上样而破坏了赤霉素结构，所以经MCX柱净化后的加标样品中无法检测出赤霉素。利用反相C18柱净化后能获得较好的色谱峰，赤霉素色谱峰的分离效果较好。本实验结果表明MAX柱的净化效果最佳，反相C18柱的净化效果比HLB柱的净化效果好。由于橘子样品基质较脏，而含有较多的色素，采用C18柱的过柱速度较慢，不适合快速检测。图2采用MAX小柱净化后得到的色谱图FIG2CHROMATOGRAMOFBEINGPURIFIEDBYMAXSOLIDP
31、HASE8图3采用MCX小柱净化后得到的色谱图FIG3CHROMATOGRAMOFBEINGPURIFIEDBYMCXSOLIDPHASE图4采用HLB小柱净化后得到的色谱图FIG4CHROMATOGRAMOFBEINGPURIFIEDBYHLBSOLIDPHASE图5采用C18小柱净化后得到的色谱图FIG5CHROMATOGRAMOFBEINGPURIFIEDBYC18SOLIDPHASE综合净化过程中滤液的流动速度及最终样品色谱图中赤霉素的分离情况等因素，最终确定实验所用的固相萃取小柱为净化速度较快且净化的效果也比较好的MAX柱。932色谱条件的优化321流动相的选择根据赤霉素的性质，能溶
32、于醇类、丙酮、乙酸乙酯，难溶于水，不溶于石油等溶液，因此，可以选择醇类、丙酮、乙酸乙酯等作为流动相。根据相关的文献18资料报道，用甲醇一水作为流动相时，色谱峰型不好，拖尾程度较严重。唐根源等19在流动相中加入甲酸、乙酸、磷酸等酸后，使峰型得到改善。赤霉素在酸性条件下较稳定，因此在流动相中加入适当的酸（H3PO4溶液）有利于赤霉素的检测。顾觉奋等20选用甲醇、水、磷酸，对流动相配比进行优化，实验发现当甲醇浓度为为66，加入001MMOL/ML的磷酸时能得到最佳色谱峰。GROLAMYSCASTILLO等21采用含001MMH3PO4的甲醇溶液作为流动相用于GA3和GA1的分离，不需要通过衍生反应，
33、也得到了很好的分离效果。因此，本实验在研究过程中采用了80甲醇水溶液和001MM磷酸溶液作为流动相。由于橘子样品成分较多，基质比较脏，因此采用梯度法，更便于赤霉素色谱峰的分离检测。322进样量的大小的确立进样量的大小直接影响出峰效果，过小会使标准系列中低浓度峰难以分离清晰，过大会使色谱柱不易被清洗干净，基线平衡时间过长，也有可能影响下一次进样结果。本实验设置了不同的进样量8L、10L、20L分别进行测定，结果表明，当进样量为20L时，色谱峰不对称，出现了明显的拖尾现象；当进样量为8L时，得到的色谱峰响应值与添加的浓度不成比例；而以10L进样时，色谱峰的峰型较好，同时响应值也较高。因此，实验选择
34、进样量为10L。33检测仪器的改进331高效液相色谱法高效液相色谱法HPLC具有灵敏度高、专一性强和重复性好等特点，谢君22曾采用HPLC内标法测定GA3和ABA，但内标物必须和测定物具有相似的结构和性质，因而确定内标物难度较大。但是由于赤霉素在植物中的含量较少，因此前处理很关键。王若仲等23用HPLC测定GA3和ABA，在样品提取过程中连续经过了三种分离柱PVPP，DEAE和SEPPAKC18，前处理十分复杂。张有林等24也采用HPLC法对GA3和ABA进行分离和测定，前处理采用乙酸乙酯萃取浓缩，获得了较高的回收率和精密度。而GROLAMYSCASTILLO和SERVANDOMARTINEZ
35、21则采用反相C18高效液相色谱法，不需要通过衍生反应，对发酵的鱼肉汤中的GA3和GA1直接使用UV进行检测，获得了较低的检测限。葛雅琨等25使用HPLC法对蔬菜中的农药GA3残留进行分析检测，采用液液萃取与SPEPAKC18固相萃取相结合的前处理方法来纯化GA3，有效地提高赤霉素的分离度。本实验最初采用高效液相色谱仪进行检测，根据相关的文献，确定了前处理方法及基本的色谱条件。实验采用90丙酮溶液对赤霉素进行提取，经超声振荡溶解，离心取上清液，反复提取后用旋转蒸发仪进行浓缩。同时，为了更好地去除样品中的其他成分，还采用固相萃取小柱对浓缩液进行净化。然后用氮气吹至近干，最后用流动相甲醇定容。根据
36、得到的色谱图优化色谱条件，选择了甲醇、乙酸乙酯和磷酸溶液等多种溶液作为流动相进行实验。改变流速、进样量和色谱柱等对色谱条件进行优化，使赤霉素的色谱峰呈对称性，出峰时间适中。但实验结果表明，色谱峰的干扰物质较多，可见图6。10图6采用HPLC法检测赤霉素浓度为10PPM得到的色谱图FIG6CHROMATOGRAMOFHPLCFORTHEDETECTIONOFSAMPLEWITHACONCENTRATIONOF10PPMGA3采用高效液相色谱法检测橘子样品中的赤霉素，其最低检测限为2PPM，无法达到目前美国、日本等国家和地区所规定的最低限量值（02PPM）。因此，高效液相色谱法不适合用来检测橘子及
37、其加工制品中的赤霉素含量。332液相色谱串联质谱法目前实验室常用的检测仪器主要是液相色谱仪和气相色谱仪，随着质谱仪的出现，越来越多的实验研究58采用液相串联质谱仪或气相串联质谱仪对植物激素及其他成分进行检测。由于高效液相色谱法无法达到目前国外的一些国家和地区的最高残留量的检测要求，而质谱仪对成分的分析更加准确，灵敏度更高，因此在所得到的高效液相色谱检测条件的基础上进行改进，采用液相色谱串联质谱仪进行检测。实验结果表明，建立的LCMS/MS检测方法能很好地将赤霉素色谱峰与其他杂质峰分离。赤霉素在001G/ML01G/ML浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，其相关系数为09991。采用本仪器
38、建立的检测方法具有较好的回收率及稳定性，赤霉素的最低检测限可达001G/ML。同时，最低定量检测限为2G/KGS/N3）低于美国、日本等国家和地区对赤霉素在水果蔬菜中的最高残留02PPM的规定。333超级液相色谱串联质谱法根据实验室的实际情况，超级液相串联质谱仪的检测比LCMS/MS的检测速度更快，检测限量更低，灵敏度更低。因此，对样品的前处理进行了改进，并对超液相串联质谱仪的检测方法进行了一定的探究。样品的前处理按一般的农药残留的前处理方法对样品进行前处理，采用乙腈对赤霉素进行提取，用氯化钠、柠檬酸钠等盐进行去水，离心取上清液，用氮气吹至近干，最后用50的乙腈正己烷定容上样。采用色谱柱为WA
39、TERSXBRIDGEC18柱5M,100MM21MM；5甲醇水溶液为流动相进行检测。相对于高效液相色谱法和液相串联质谱法，UPLCMS/MS的前处理过程更为简单、快速，而且赤霉素的出峰时间更短，同时，基本无杂质峰干扰。但是，超液相串联质谱仪作为目前检测仪器中的高端设备，其价格较为昂贵，使用操作不够熟悉，因此无法作为快速简便地检测赤霉素的方法。当然，以后随着这种设备的普及，利用超液相串联质谱仪建立检测水果蔬菜中的各种激素或其他成分（包括赤霉素）的方法必将成为今后的研究方向和重点。1134标准曲线的绘制及最低检测限用不同浓度的赤霉素标准液进样，确立该药品的出峰时间。然后将向空白基质液里分别添加0
40、01G/ML、002G/ML、005G/ML、01G/ML赤霉素浓度，测定色谱峰的峰面积，根据浓度与峰面积确立标准曲线和回归方程。在建立的LCMS/MS色谱条件下，在样品中添加赤霉素在00101G/ML浓度下得到的回归方程为Y285X717（线性相关系数为09991）。实验结果表明，在工作液标准曲线范围内，添加的赤霉素浓度与峰面积呈现良好的线性相关，如图7。选择S/N3时的浓度为该方法的检出限，经分析计算可知本方法的检测限为001G/ML，说明该方法的灵敏度较高。实验结果表明，在所建立的LCMS/MS色谱条件下能很好地将赤霉素溶剂峰和其它组分完全分离开，样品经处理后色谱峰线中还有一些杂质峰，但
41、并不干扰赤霉素的检测。在样品中添加赤霉素浓度为001G/ML时，在800MIN附近能清晰地检测到赤霉素色谱峰，见图8。对其进行定性和定量离子对分析，可知该色谱峰确实为GA3。本次实验中样品的称样量为50G，经计算可知该方法定量下限为2G/KG。图7橘子中GA3在00101G/ML浓度下曲线LCMS/MSFIG7THECURVEOF00101G/MLGA3INMANDARINORANGELCMS/MS12图8添加002G/ML赤霉素后的橘子样品色谱图LCMSMS及赤霉素色谱峰的离子对分析图FIG8CHROMATOGRAMOFLCMSMSFORTHEDETECTIONOFSAMPLEWITHACO
42、NCENTRATIONOF002G/MLGA3ANDIONPEAKOFGA3ANALYSISDIAGRAM35回收率及变异系数的测定在橘子样品中分别添加2G/KG，4G/KG，10G/KG，20G/KG的赤霉素，按23的实验步骤对加标样品进行前处理，然后采用LCMS/MS仪器对橘子样品进行检测。测出标准使用液和加标样品中赤霉素色谱峰的峰面积，根据公式（见251）求出各加标样品的回收率，见表3。表3赤霉素的提取回收率和变异系数TABLE3THERECOVERYANDRSDOFGA3赤霉素的添加浓度CONCENTRATIONG/KG批次BATCH1234XSD变异系数CVCOEFFICIENTVA
43、RIATION批内批间211080010250110201076010708326304210200100801027010500102631771723958097001010096209750239245平均值10240247240411105010725112001084510955211193211200110851095011280111291441291331030010590101501035510349183177平均值10811179166101100601008099949940100190640642986098309744990298340670683996010040
44、994499209966052052平均值994006106120199401002010040988799720710712999010015995210110100170670673100009972101201010010048073073平均值10012070070从表中可以看到样品中赤霉素的回收率基本在958112之间，属于比较正常的回收率区间。同时，随着赤霉素添加浓度的增加，不同批次之间的RSD值都逐渐减小，均低于31。这说明建立的检测方法比较可靠，重复性较好，对于橘子样品中赤霉素的检测十分有效。36橘子样品的检测取13支50ML离心管做一组平行实验，前4管编号14，分别称取5G左
45、右橘子肉样品；在编号为58的离心管中分别称取5G左右的橘子皮样品；在编号为912的离心管中分别称取5G左右的橘子罐头样品；在编号为13的离心管中不加样品作为空白对照，所有的离心管均按上述的前处理方法处理样品，另需加一管标准液做对照，最后将这14个进样瓶上仪器检测。在对橘子（肉、皮）及橘子罐头等40个样品的检测，其中橘子肉和橘子罐头的样品中均未检出赤霉素。只有两个橘子皮样品中检测出微量的赤霉素，经计算其浓度分别为00059G/ML和000958G/ML，均低于目前规定的最低限量（02PPM）。同时，由于我们的食用部分为橘子肉，因此对橘子皮样品的检测只是做一个参考。通过检测得到的结果可知，这40个
46、样品中的赤霉素残留量均未超标。4结论本方法采用90的丙酮溶液提取，经MAX柱净化，甲醇定容，最后以LCMS/MS色谱法测定橘子及其加工制品中的赤霉素残留，取得了成功。赤霉素在001G/ML01G/ML浓度范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系，其相关系数为09991。采用本仪器建立的检测方法具有较好的回收率及稳定性，赤霉素的最低检测限可达001G/ML。同时，最低定量检测限为2G/KGS/N3）低于美国、日本等国家和地区对赤霉素在水果蔬菜中的最高残留02PPM的规定。参考文献1芬兰欧盟对我橘子罐头采取临保期限为154天JCHINAFRUITANDVEGETABLE,2004,3462王勇,程金芬
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