1、本科毕业设计（20_届）鲈鱼CPTI基因CDNA的克隆所在学院专业班级海洋生物资源与环境学生姓名学号指导教师职称完成日期年月摘要肉毒碱棕榈酰转移酶（CARNITINEPALMITOYLTRANSFERASES,CPT,EC2312）在脂酸的氧化中起重要作用，线粒体内细胞质一侧的脂酰COA由肉毒碱棕榈酰转移酶转移酶催化与肉碱结合形成脂酰肉碱，脂酰肉碱通过线粒体内膜的移位酶的作用穿过线粒体内膜，进入线粒体。在线粒体内基质的一侧的肉毒碱棕榈酰转移酶转移酶的催化下，脂酰肉碱上的脂酰基又转移到COA上，重新形成脂酰COA,成为氧化的底物。因此CPTI对鱼类多种代谢过程都有重要的调节作用，它不仅参与脂类代
2、谢的某些酶的代谢，还会影响某些脂肪细胞的生长、分化甚至凋谢。在鱼体中脂肪的含量和组成是影响鱼肉口味的主要因素。本实验通过逆转录PCR获得鲈鱼肝中CPTI基因核心片段，测序后，其大小为1023BP。使用CDNA末端快速扩增（5AND3RAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDS,RCAE）技术成功克隆出鲈鱼（LATEOLABRAXJAPOMCUS）CPTI3末端序列，其大小为1292BP，将核心序列和3末端序列拼接后得到大小为2162BP拼接体，经分析此序列能翻译560个氨基酸，包含有480BP的3端非翻译区，但是未成功克隆出5末端序列。本课题对今后深入研究脂肪代谢的相关因素，改善鱼
3、类的肉质和口味都有重要的意义，也能为将来研究CPTI基因的功能打下了必不可少的基础，最终为鲈鱼的最优养殖做指导。关键词鲈鱼；RTPCR；CPTI；肝；RACE技术ABSTRACTCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASESCPT,EC2312PLAYSANIMPORTANTROLEINTHEOXIDATIONOFTHEFATTYACIDTHEACYLCOAWHICHINTHEOUTERCYTOPLASMICSIDEOFMITOCHONDRIABINDWITHCARNITINETOFORMACYLCARNITINETHISPROCESSISCATALYTICEDBYCARNITI
4、NEPALMITOYLTRANSFERASESICPTITHENTHEACYLCARNITINEGOTHROUGHTHEMITOCHONDRIALMEMBRANEINTOTHEMITOCHONDRIAUNDERTHEACYLCARNITINETRANSLOCASEWITHTHECATALYTICEDBYCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASESIICPTII,ONTHEACYLCARNITINEANDACYLTRANSFERTOCOA,THEREFORMATIONOFACYLCOA,ASUBSTRATEOFOXIDATIONTHEREFORE,CPTIHASANIMPORTA
5、NTROLEINTHEREGULATIONINVIVOOFAVARIETYOFMETABOLICPROCESSES,WHICHNOTONLYINVOLVEDINCERTAINMETABOLICENZYMESOFTHELIPIDMETABOLISM,BUTALSOAFFECTEDTHEGROWTHOFCERTAINFATCELLS,DIFFERENTIATION,ANDEVENDIETHEFATCONTENTANDFATTYACIDCOMPOSITIONOFTHEFISHISAMAJORFACTORCONTRIBUTIONTOTHEFAVOROFTHEFISHINTHISSTUDY,WEOBTA
6、INEDCPTIGENECOREFRAGMENTSINLIVEROFLATEOLABRAXJAPOMCUSABSTRACTBYREVERSETRANSCRIPTIONPCR,ITSSIZEIS1023BPCLONEOFCPTI3TERMINALSEQUENCEGENEBYSMARTERRACECDNAAMPLIFICATIONAFTERSEQUENCEDANDITS1292BP,THESPLICERESULTOF3TERMINALSEQUENCEANDCORESEQUENCEOFCPTIIS2162BP,THEREISA480BP3UNTRANSLATEDREGION,BUTWECOULDNT
7、CLONETHE5TERMINALSEQUENCEGENETHESTUDYISBENEFITTOUNDERSTANDTHERELEVANTFACTORSFORFATMETABOLISMANDIMPROVETHEQUALITYANDTASTEOFLJAPONICUS,ANDALSOLAYAFOUNDATIONFORTHESTUDYOFTHEFUNCTIONOFCPTIGENEINTHEFUTURE,BECOMINGTHEBESTGUIDANCETOTHECULTIVATIONOFLJAPONICUSULTIMATELYKEYWORDSLATEOLABRAXJAPONICUSREVERSETRAN
8、SCRIPTIONPCRCPTILIVERRACETECHNOLOGY目录前言11材料和方法211实验材料、试剂和仪器设备2111实验材料2112实验试剂212实验方法3121总RNA提取3122CDNA合成3123PCR及凝胶电泳4124PCR产物回收4125感受态细胞的制备5126目的片段与载体的连接，测序6127RACE扩增62实验结果及分析721总RNA提取结果722鲈鱼CPTI基因CDNA的克隆83讨论12致谢14参考文献14附录1617前言随着天然自然资源的日益枯竭，许多水产品都是通过养殖来获得的，我国的水产业发展非常迅速，连续多年位居世界水产品总产量第一、水产养殖产量世界第一的大
9、国之位。而鱼类养殖占水产养殖很大的一部分比例。鲈鱼LATEOLABRAXJAPOMCUS肉质坚实，洁白细嫩，肉味鲜美，营养特别丰富，是人类优质的蛋白质来源，也是我国水产从业人员捕捞、养殖的主要高档水产品种，经济价值很高。不过在人们养殖技术还未完善，会出现很多效益上的问题。并且在通过养殖获得大量的蛋白质时也出现了很多的问题，养殖鲈鱼群体出现了经济性的衰退现象，如生长缓慢、性成熟提早、肉质变差等，尤其是鱼体脂肪含量越来越高，这不仅影响鲈鱼的肉质和风味，而且大大降低了饲料转化率，严重影响到鲈鱼的产量、销售和商品价格，成为严重制约鲈鱼养殖业发展的因素。肉毒碱棕榈酰转移酶（CARNITINEPALMIT
10、OYLTRANSFERASES,CPT,EC2312）是脂肪酸的氧化中主要的限制酶，丙二酸单酰辅酶A是其主要抑制剂。该酶系统由两种类型组成肉毒碱棕榈酰转移酶I（CPTI）和肉毒碱棕榈酰转移酶II（CPTII）1。线粒体内细胞质一侧的脂酰COA由肉毒碱棕榈酰转移酶转移酶I催化与肉碱结合形成脂酰肉碱，脂酰肉碱通过线粒体内膜的移位酶的作用穿过线粒体内膜，进入线粒体。在线粒体内基质的一侧的肉毒碱棕榈酰转移酶转移酶II的催化下，脂酰肉碱上的脂酰基又转移到COA上，重新形成脂酰COA,成为氧化的底物。鱼体中的脂质组成是鱼体膳食脂肪沉积平衡的结果，即是脂肪合成代谢与分解代谢的一种平衡状态的结果。脂肪分解产生
11、的脂肪酸可转化成甘油三脂、膜磷脂或进入线粒体内进行氧化。但长链脂肪酸必须先在胞液中活化成脂酰COA，然后再通过肉碱脂酰转移酶系统的转运才能进入线粒体内进行氧化2。在哺乳动物中，CPTI在肝（LA）和肌肉（MB）中至少被分为两个亚型3LCPTI或者CPTIA和MCPTI或者CPTIB，并且在肝和肌肉CPTI的基因表达首次被研究。在人体中，这两种形式都是由两个不同的基因编码。在肾，肺，脾，肠，卵巢和胰腺中LCPTI作为主要（或者唯一的表达），而在睾丸中MCPTI则占主导地位4。这两个亚型有明显不同的动力学性质，特别是它们的KM值（在大鼠中MCPTI500MM,LCPTI30MM），还有对丙二酰辅酶
12、A抑制敏感性也不同，麦加里等发现在肌肉中（IC50003UM）CPTI对丙二酰辅酶A抑制敏感性大约是肝中（IC5027UM）的100倍5。丙二酰辅酶A是CPTI可逆抑制剂，它是乙酰辅酶A合成脂肪酸的第一步，通过乙酰辅酶A羧化酶产生。因此它提供了一个相互控制的两个相反的路径脂肪酸合成和脂肪酸氧化的简单机制。丙二酰辅酶A对CPTI抑制作用在脂肪酸氧化生理调节起重要的作用6。到目前为止，可用的关于鱼体组织中的CPTI活性的数据很少。STEPHANIEGUTIERES7发现在鳟鱼中CPTI活性的顺序是红肌肠肾肝白肌，在脂肪组织中未检测到活性，这个结果表明在这些有CPTI基因表达的组织中有严谨的组织转录
13、控制系统。这结果与18FROYLAND等人所得的相一致，他们测量了大西洋鲑鱼的肌肉和肝脏中的CPTI活性。CPTI活性的顺序是红肌肾肝肝白肌。他们还用丙二酰COA做对照，证明他们测量的CPTI活性分布是正确的。埃金顿也研究了虹鳟鱼和大西洋鲑鱼在不同基质中的CPT最大活性8。这个鳟鱼和鲑鱼的CPTI活性顺序与现在研究发现的是一致的。肪的沉积是能量贮存的主要方式，鱼体中的脂质组成是鱼体膳食脂肪沉积平衡的结果9，即是脂肪合成代谢与分解代谢的一种平衡状态的结果。脂肪分解产生的脂肪酸可转化成甘油三脂、膜磷脂或进入线粒体内进行氧化。但长链脂肪酸必须先在胞液中活化成脂酰COA，然后再通过肉碱脂酰转移酶系统的
14、转运才能进入线粒体内进行氧化。但长链脂肪酸必须先在胞液中活化成脂酰COA，然后再通过肉碱脂酰转移酶系统的转运才能进入线粒体内进行氧化10。而CPTI催化长链脂酰COA与肉碱合成脂酰肉碱，是脂肪酸氧化过程中的一种限速酶，因此抑制或者激活CPTI能控制脂肪酸氧化进行与否，最终导致鱼体中脂肪的积累情况11。可以说CPTI对鱼类多种代谢过程都有重要的调节作用，它不仅参与脂类代谢的某些酶的代谢，还会影响某些脂肪细胞的生长、分化甚至凋谢。在鱼体中脂肪的含量和组成是影响鱼肉口味的主要因素12。一直以来，国内外学者主要是对哺乳动物的CPTI基因进行研究如黄其春13研究了猪的CPTI基因，而相对于鱼类中CPTI
15、基因的研究则较少，已知的有STEPHANIEGUTIERES14克隆了虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）CPTI基因和LIVARFROYLAND15克隆出了大西洋鲑鱼（SALMOSALAR）CPTI基因,由于CPTI在鱼类脂肪代谢中发挥了重要作用，因而成为用来研究脂肪细胞分化和脂肪代谢调节的重要基因。而国内目前还没有鱼类CPTI基因克隆的相关报道。与哺乳动物不同的是，对低脊椎动物脂肪酸的运输系统仍然不清楚。CPTI的活性在鱼中被检测只存在于肝脏和肌肉中16。本实验通过RTPCR获得鲈鱼肝CPTI基因核心片段，测序后，该片段大小1023KB，使用CDNA末端快速扩增（5AND3RAPI
16、DAMPLIFICATIONOFCDNAENDS,RCAE）技术克隆出鲈鱼CPTI3末端序列其大小为1292BP，但遗憾的是未成功克隆出鲈鱼CPTI5末端序列。本课题对今后深入研究脂肪代谢的相关因素，改善鱼类的肉质和口味都有重要的意义，也能为将来研究CPTI基因的功能打下了必不可少的基础，最终为鲈鱼的最优养殖做指导。1材料和方法11实验材料、试剂和引物111实验材料实验所用材料鲈鱼的肝脏组织。由宁波大学曹光标科技楼303，钱云霞教授实验室提供。试验鲈鱼购自宁波水产大世界，体重约为500G。主要仪器设备DK8D电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司）LX100手掌型离心机（江苏海门市其林贝尔仪器
17、制造有限公司）T1THERMOCYCLERPCR自动系列化分析仪（德国BIOMETRA公司）GIS2008凝胶图像处理系统（上海天能科技有限公司）WD9403D型紫外分析仪（北京六一仪器厂）5415D型台式高速离心机（EPPENDORF公司）19BIOFUGESTRATAS大型冷冻离心机（HERAEUS公司）DYY8B型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）112实验试剂1总RNA提取所用试剂TRIZOLREAGENTINVITROGEN公司、氯仿（常熟市杨园化工厂）、异丙醇（上海试剂四厂）、DEPC处理灭菌水1ML焦碳酸二乙酯（DEPC）（BIOBASICINC公司）加1000ML纯水配成01的水
18、溶液，配制好后放置过夜，121高压灭菌25MIN，备用、75乙醇取75ML的无水乙醇（杭州长征化工厂）加以DEPC处理灭菌水定容到100ML，置4保存备用。2CDNA合成所用试剂DNTPMIXTURE各10MMOL/ML（上海生工生物工程技术服务有限公司）、MMLV逆转录酶（PROMEGA公司）、OLIGODT（上海生工生物工程技术服务有限公司）、二硫苏糖醇（DTT）（杭州昊天生物技术有限公司）。3PCR及PCR产物回收所用试剂TAQDNA聚合酶（5U/L）、10BUFFER100MMOL/LTRISCL，PH83；200MMOL/LKCL、MG225MMOL/L（TAKARA公司）、DNTP
19、MIXTURE各10MMOL/ML（上海生工生物工程技术服务有限公司）、引物由上海基康生物技术有限公司合成、琼脂糖（上海生工生物工程技术服务有限公司）、凝胶回收试剂盒（碧云天生物技术研究所）。4感受态细胞的制备所用试剂01MOL/LCACL2称取分子量为147的CACL22H2O（上海生工生物工程技术服务有限公司）147G加蒸馏水定容至100ML，高压灭菌后4保存备用、甘油（上海生工）、LB培养基950ML蒸馏水中加入5G酵母提取物（OXOID公司），10G胰蛋白胨（OXOID公司），5GNACL。调整PH值至70定容至1000ML。如需要固体培养基则每1000ML液体培养基中加入15G琼脂，
20、高压灭菌后备用、氨苄青霉素（上海生工）。5RACE扩增所用试剂琼脂糖（上海生工生物工程技术服务有限公司）、TAQDNA聚合酶（5U/L）、10BUFFER100MMOL/LTRISCL，PH83；200MMOL/LKCL、MG225MMOL/L（TAKARA公司）、DNTPMIXTURE各10MMOL/ML（上海生工生物工程技术服务有限公司）、引物由上海基康生物技术有限公司合成、凝胶回收试剂盒（碧云天生物技术研究所）、SMARTTMRACECDNAAMPLIFICATIONKITCLONTECH公司。12实验方法121总RNA提取鲈鱼肝脏总RNA的提取方法参照TRIZOLREAGENT试剂说明
21、书取液氮冻存鲈50100MG，放入液氮中陶瓷研钵研磨。加入TRIZOL1ML后转移到15MLDEPC水处（01DEPC水浸泡过夜后高压灭菌）的离心管中，室温放置5MIN。然后加入氯仿02ML，盖紧，手摇混匀15S，室温放置23MIN。接着4，12000G离心15MIN。取上清（约06ML），转移到15MLDEPC水处理的离心管中。加异丙醇05ML，混匀，室温下10MIN。接着4，10000G离心10MIN然后弃上清，加1ML75乙醇洗涤。接着4，7500G离心5MIN。弃上清，室温干燥510MIN。最后用DEPC处理灭菌纯水2040L溶解，70OC保存。RNA提取成功的关键是尽量减少RNA酶的
22、污染，因为RNA酶含有肽链内二硫键，使其能抵抗长时间的煮沸和温和变性剂，而且变性后可迅速折叠，具有很高的稳定性。RNASE存在广泛，环境中灰尘，各20种实验器皿和试剂，人体的汗液和及唾液中均存在RNA酶。目前，尚无令RNA酶失活的简易办法。所以要成功提取RNA在实验操作中应该注意1组织离体后迅速用液氮冷冻。2实验中所用金属器具，研钵等均要在200OC下干热灭菌4H以上。3实验中所用离心管，枪头皆为经DEPC水浸泡处理并灭菌。4实验中所用溶液均要用经DEPC处理的灭菌水配制。5实验过程中要戴一次性手套、口罩，并注意更换。6提取环境要干净无菌，最好在专用的超净工作台上操作。122CDNA合成CDN
23、A合成按照TAKARA1STSTRANDCDNASYTHENSISKIT进行16将上述总RNA样品在65OC变性5MIN，迅速置冰上备用。取15MLDEPC水处理的离心管中，并依次加入下列成分RNA样品2L，5BUFFER4L，DNTPMIXTURE各10MMOL/ML1L，OLIGODT50MOL/L1L，MMLV逆转录酶1L，DTT01MOL/L2L，加DEPC处理水至总体积为20L混匀。在室温放置10MIN后，42OC水浴1小时，冰浴2MIN。所得产物即为CDNA，置于20OC保存。逆转录过程中的操作依然要十分小心，实验中所用离心管，枪头均要用01DEPC水处理，以防止RNA酶污染。在2
24、0L逆转录体系中模板总RNA的用量不要超过11G，过多则会影响逆转录的效率。123PCR从GENBANK中读取SPARUSAURATADQ866821，ONCORHYNCHUSMYKISSAJ6060761，BOSTAURUSNM_0010343492，GALLUSGALLUSNM_0010128981，MACACAFASCICULARIS（AB1687751），HUMAN（U668281），DANIORERIO（NM_0010059401），OVISARIES（NM_0010092591），MUS（NM_0099482），SUSSCROFA（AY1810621），的CPTI基因CDNA序列通
25、过BIOEDIT进行比对17，在PRIMER5辅助下进行引物设计，并在NCBI数据库中通过BLAST进行同源性比对。得出PCR扩增引物如（表1）所示，由INVITROGEN公司合成。表1鲈鱼CPTIPCR扩增核心片段的引物序列TAB1SEQUENCESOFPRIMERSUSEDINAMPLIFYINGCPTIPARTIALCDNASEQUENCESOFLATEOLABRAXJAPOMCUS引物名称引物序列53（RA/G，YC/T，HA/T/C，DG/A/T）CPTIFGGGCHACHAAYTAYGTGAGTGAYCPTIRTGAAGGCATCDGGRCTGGT聚合酶链式反应POLYMERASE
26、CHAINREACTION,PCR反应包含变性，退火，延伸三步骤18。PCR反应体系见表2表2PCR反应体系TAB2THECOMPONENTSOFPCRREACTION反应液成份体积50L10BUFFER100MMOL/LTRISCL,PH83；200MMOL/LKCL5L模板CDNA（012G）1L21DNTPS各10MMOL/L4L正向引物CPTI1410F10MMOL/L1L反向引物CPTI1410R10MMOL/L1LTAQDNA聚合酶5U/L05L灭菌双蒸水375LPCR反应条件94预变性5MIN；33个循环94变性1MIN；45退火1MIN；72延伸2MIN；72最后延伸10MIN
27、；4保存产物以01琼脂糖凝胶电泳，因目的条带不够清晰，所以将1次PCR产物进行切胶纯化，以纯化产物为模板相同条件进行2次PCR。124PCR产物回收及凝胶电泳目的片段的回收使用碧云天生物技术研究所生产的DNA胶回收试剂盒琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其他DNA尽可能分开，然后在紫外分析仪上用干净的手术刀割下含需回收DNA的琼脂块，放入15ML离心管中，用1ML枪头捣碎。判定DNA片段的位置时使用长波长紫外光，紫外光下照射的时间应尽可能短；每100L/100MG琼脂糖凝胶的比例加入EXTRACTIONBUFFER溶液，置于5060水浴中10MIN至胶全融，期间，需VORTEX或颠倒混匀34次，
28、以加速溶解；将融化的胶溶液转移至DNA纯化柱中，室温放置1MIN。13000RPM离心1MIN，弃去接液管中废液；取下DNA纯化柱，加上700L溶液，室内放置1MIN；16000RMP离心1MIN，洗去杂质，倒弃收集管内的液体；向DNA纯化柱内加入500L溶液,于16000RPM离心1MIN，进一步去杂，并弃去接液管中废液；再16000RPM离心1MIN，除去残留液体并让残留的乙醇充分挥发；取下DNA纯化柱置于15ML离心管上，加入30L溶液至管内柱面上放置1MIN；16000RPM室温离心1MIN，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于20备用；用1的琼脂糖凝胶电泳检测回收产
29、物；125感受态细胞的制备目前常用的感受态细胞制备方法有CACL2和RBCLKCL法，RBCLKCL法制备的感受态细胞转化效率较高，但CACL2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15的无菌甘油于70保存半年，因此CACL2法为使用更广泛。DH5A感受态细胞的制备主要参照精编分子生物学实验指南过程如下取DH5A单菌落，接种于15MLLB培养液中，于37摇床培养过夜（250R/MIN）；往一个250ML的烧瓶中加入100MLLB培养液，再加入4ML过夜培养液；37恒温振荡器250R/MIN培养至OD590为0375；这一步的目的是使细菌
30、快速生长（对数早期或中期）；将培养液分装到2个50ML预冷无菌的离心管中，于冰上放置10MIN，然后于4，4000R/MIN离心10MIN。倒掉上清液，倒置吸水纸上1MIN左右，晾干；22细胞沉淀用10ML预冷的01MOL/LCACL2溶液重悬，于4，4000R/MIN离心10MIN。倒掉上清液，倒置吸水纸上1MIN左右，晾干；重复步骤5一次；用2ML预冷的CACL2溶液重悬细胞，分装到加有甘油的15ML无菌离心管中，每管加200L左右，立即冻存于70；实验中应该注意1细胞生长状态和密度不要用经过多次转接或储于的培养菌，最好从70或20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长
31、密度以刚进入对数生长期时为好。2试剂的质量所用的试剂，如CACL2等均需是最高纯度的GR或AR，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。3防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，枪头等要高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。126目的片段与载体的连接，测序PCR回收产物与质粒连接的反应体系（10L）吸取PCR产物45L，加PMD18T载体05L，加LIGATIONSOLUTION混匀，4连接过夜；200L感受态细胞室温解冻后置于冰上；取
32、50L感受态细胞，加入5L连接物，轻轻摇匀，冰上放置20MIN；42水浴90S（热激），冰上冷却23MIN；加入800LLB（AMP）培养基，（37预热先）；混匀，37振荡培养45MIN，（1H），（前25MIN转数150左右，后20MIN剧烈振荡200以上），然后离心145000RMP30S去上清；取200L上述培养物（摇匀后再取，涂到AMP的LB平板上）；将涂布好的平板置于37恒温振荡器中140R/MIN过夜培养（过夜时间过长，也会产生卫星菌落）；挑选菌落于3MLLB培养基中（含AMP），68H；8000RMP5MIN离心或10000RMP2MIN收集菌体；小量培养后提取质粒DNA，进行酶
33、切鉴定后送上海INVITROGEN公司进行双向重复测序。127RACE扩增RACEPCR扩增按照CLONTECH公司的SMARTTMRACECDNAAMPLIFICATIONKIT的说明书进行。取1G鲈鱼肝脏总RNA按说明书分别合成3READYCDNA和5READYCDNA，具体反应条件如下19A3READYCDNA经微量紫外分光光度计测定RNA样品浓度。在DEPC水处理的离心管中配制5L下列混合液RNA1G3RACEPRIMERA1LRNASEFREEDH2O补足到5L上述混合液置PCR仪上702MIN，将产物取出来后，冰上急冷2MIN。轻微离心，收集液体于离心管底部。23在DEPC水处理的
34、离心管中配制下列混合液上述经变性、退火的混合液5L5FIRSTSTRANDBUFFER2LDTT20MM05LDNTPMIX10MM1LMMLVREVERSETRANSCRIPTASE1L混匀，置PCR仪上4290MIN。向上述反应液加入200LTRICINEEDTABUFFER。混匀，置PCR仪上727MIN。B5READYCDNA经微量紫外分光光度计测定RNA样品浓度。在DEPC水处理的离心管中配制5L下列混合液RNA1G5RACEPRIMERA1LSMARTIIAOLIGO1LRNASEFREEDH2O补足到5L上述混合液置PCR仪上702MIN，冰上急冷2MIN。轻微离心，收集液体于离
35、心管底部。在DEPC水处理的离心管中配制下列混合液上述经变性、退火的混合液5L5FIRSTSTRANDBUFFER2LDTT20MM05LDNTPMIX10MM1LMMLVREVERSETRANSCRIPTASE1L混匀，置PCR仪上4290MIN。向上述反应液加入200LTRICINEEDTABUFFER。混匀，置PCR仪上727MIN。分别得到鲈鱼肝脏3READYCDNA和5READYCDNA各200L，20保存。据获得的核心片段序列，设计特异性引物LYCPT3F3和LYCPT5R3（表3），分别以3READYCDNA和5READYCDNA为模板，以及试剂盒提供的通用引物UPM进行3RAC
36、E和5RACEPCR反应。第2轮PCR的引物为LYCPT3F4和LYCPT5R4（表3），和试剂盒提供的引物NESTUPM分别进行PCR扩增，PCR扩增条件如下9430S，722MIN，5个循环；9430S，7030S，722MIN，5个循环9430S，6830S，722MIN，25个循环；最后72延伸6MIN。PCR产物的回收、克隆和测序方法同124和126。表3鲈鱼CPTIRACE的引物TAB3SEQUENCESOFPRIMERSUSEDINCPTI3RACEAMPLIFYINGOFLATEOLABRAXJAPOMCUS引物名称引物序列5324LYCPT3F3ACACTGGATGATGAG
37、CCGCAGGGTTALYCPT3F4AGTGGCAGATTCCAAAGGAGTGTCAAGALYCPT5R3TTGAGTTCTCCTTGCTGGGGTTCTGALYCPT5R4CCATCTGAGTGGAACACATAGGAACGG2实验结果及分析21总RNA提取结果通过TRIZOL法提取了鲈鱼肝脏组织总RNA，经1琼脂糖凝胶电泳后结果见图1，图中5S、18S和28S三条条带清晰可见，说明RNA样品具有良好完整性。图1RNA琼脂糖凝胶电泳图FIG1THEAGAROSEGELELECTROPHORESISRESULTOFRNA22鲈鱼CPTI基因CDNA的克隆以鲈肝脏CDNA为模板，利用兼并引物
38、CPTIF和CPTIR扩增得到目标片段，产物经1琼脂糖电泳显示特异的目的条带，大小在1016KB左右（见图2中的RTPCR，根据电泳检测图MARKER比较），与预期大小相符，PCR产物经切胶回收、连接转化、挑克隆检测，送上海INVITROGEN生物有限公司测序。测序结果如图3所示，后经BLAST同源性检索，得出此片段分别与金头鲷（SPARUSAURATA）的CPTI基因有89的同源性，与虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）有77的同源性，并且与哺乳动物如牛（BOSTAURUS）、鸡（GALLUSGALLUS）、食蟹猴（MACACAFASCICULARIS）、猿（HOMOSAPIENS）
39、等有67的同源性，与其他动物如小鼠（MUS）及羊（OVISARIES）的CPTI基因有60以上的同源性，最终确认为鲈鱼CPTI的核心序列20。25图2鲈鱼肝脏CPTI基因PCR扩增结果FIG2THEPCRRESULTOFCPTIGENEINLATEOLABRAXJAPOMCUSLIVER根据该核心序列，按照RACE试剂盒要求分别设计3、5RACE特异引物进行PCR反应扩增其末端序列，在实验之前我们预测1P产物片段3预计片段1078BP以上，5预计片段1100BP以上；2P产物片度3预计片段780BP以上，5预计片段900BP以上。实际实验中我们成功获得了3末端序列，其大小约为1300BP（见图
40、2中的RACE3，根据电泳检测图MARKER比较）。测序结果如图4所示，大小为1292BP。使用BIOEDIT软件通过与核心片段比对，我们发现核心具有153个碱基与3末端序列重叠，通过BLSAT同源性检索，说明此3RACE产物即是我们所需要的末端序列。我们将核心和3末端序列连接得出其序列长度为2162BP见图（5），将此序列进行BLAST同源性比对，结果如表4。通过跟同源性最好的金头鲷（SPARUSAURATA）氨基酸翻译比对表明，此序列能翻译560个氨基酸，3端非翻译区为480BP，但是遗憾的是，我们未能成功克隆出所需要的5末端序列，可能失败的原因是引物设计得不好，亦或是PCR反应条件不好。
41、总之我们根据其他物种CPTI基因全长推测我们的5末端序列大小在900BP以上。图3鲈鱼肝脏CPTI基因核心序列FIG3THECORESEQUENCEOFCPTIGENEINLATEOLABRAXJAPOMCUSLIVER26图4鲈鱼肝脏CPTI基因3RACE序列FIG4THE3TERMINALSEQUENCEOFCPTIGENEINLATEOLABRAXJAPOMCUSLIVER虽然未成功CPTI基因全长，但是从我们获得的拼接体序列与其他物种CPTI基因比较，其大小相差并不是很大，因此我们尝试运用MEGA4中的临位相联法（NEIGHBORJOINING，NJ）构建了鲈鱼与其他8个物种的CPTI
42、基因核酸序列进行系统进化树（图6），该图显示，鱼类CPTI的汇成一个大的分支其中食草的又与食肉的分开，牛和羊形成一个小的分支，然后又与猿与食蟹猴形成的小分支汇成一个大的分支，而鸡和老鼠形成一个独立的大分支。金头鲷的CPTI与鲈鱼的CPTI的亲缘关系较近，说明二者的CPTI基本相同。而牛、羊的CPTI等与鱼的CPTI最终形成一个大的分支，表明他们可能有着相同的祖先。表4鲈鱼CPTI核酸序列比对TAB4THEHOMOLOGYANALYSEOFCPTINUCLEOTIDESEQUENCESEOFLATEOLABRAXJAPOMCUS物种（拉丁名）核酸序列登录号同源性金头鲷（SPARUSAURATA）
43、DQ866821190虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）NM_001124735177斑马鱼（DANIORERIO）NM_001005940175牛（BOSTAURUS）NM_001034349268小鼠（MUS）NM_013495268羊（OVISARIES）NM_001009259168猿（HOMOSAPIENS）AK291316167鸡（GALLUSGALLUS）NM_001012898168非洲爪蟾（XENOPUSLAEVIS）NM_00109516116727大鼠（RAT）L07736167通过实验结果表明，引物设计在对实验成果的影响有至关重要的影响，可以说一个好的引物是决
44、定实验成败的重要因素之一。其中引物序列和它与模版结合的特异性，又是决定PCR反应结果的关键。所以说，引物设计不合理，PCR反应的特异性及扩增效率均会降低。不同的反应体系，由于模版的组成、扩增片段的长度及其使用目的的不同，对引物的要求各不相同。引物设计的基本原是最大限度地提高扩增效率和特异性，尽可能抑制非特异性扩增。28图5核心与3末端序列拼接图FIG5THESPLICERESULTOF3TERMINALSEQUENCEANDCORESEQUENCEOFCPTI29图6CPTI的核苷酸序列系统进化树FIG6PHYLOGENETICTREEOFCPTINUCLEOTIDESEQUENCE图中横线表
45、示遗传距离，白色箭头表示本实验选用的鱼种，运用MEGA4中的临位相联法（NEIGHBORJOINING，NJ）构建，参与的物种有金头鲷（SPARUSAURATA）、牛（BOSTAURUS）、虹鳟（ONCORHYNCHUSMYKISS）、羊（OVISARIES）、食蟹猴（MACACAFASCICULARIS）、小鼠（MUS）、鸡GALLUSGALLUS、猿（HOMOSAPIENS）以及本实验对象鲈鱼。3讨论目前，一些研究已经证实CPTI具有多种重要的生物学功能，与脂肪酸氧化，脂质代谢，动物的生长发育，动物的营养健康有密切联系。CPTI对脂代谢的调控是目前研究的热点，研究表明CPTI活性与机体脂肪
46、酸氧化有重大影响。CPTI催化长链脂酰COA与肉碱合成脂酰肉碱，是脂肪酸一氧化过程中的一种限速酶。在鳟鱼序列发现与CPTI活性和对丙二酰COA敏感性有关的保守序列。SWANSON21等和DAI22等通过保守氨基酸的定点突变，SHI等23通过N末端缺失分析和对LCPT和MCPT氨基和羧基端之间嵌合体的产生等的分析最后得出肉毒碱棕榈酰转移酶活性部位主要是在羧基端，而N末端则对丙二酸单酰辅酶A很敏感，假设切除这个部位，那么丙二酸单酰辅酶A的抑制作用就会消失。因此可以通过基因工程来定向改造肉毒碱棕榈酰转移酶。我们以鲈鱼肝脏CDNA为模板，其他物种的CPTI序列设计引物（参见122引物合成），扩增了10
47、23KBP的鲈鱼CPTI核心CDNA序列，通过跟其他物种比对，相对于其他鱼种如金头鲷（SPARUSAURATA）的同源性较高，能达到89，但相对于哺乳动物其如猿（HOMOSAPIENS），小鼠（MUS）等其同源性也能达到65以上，说明我们克隆到的是CPTI核心序列，该基因在生物体中很好的同源性，预示着该基因在生物体的生理活动中有至关重要的作用。通过SMARTRACE的方法成功克隆了该基因完整3端序列，其大小是1292BP，使用BIOEDIT软件通过与核心片段比对，我们发现核心具有153个碱基与3末端序列重叠。我们将核心和3末端序列连接得出其序列长度为2162BP，通过BLAST比对我们也发现对
48、于其他物种的鱼它具有很高的同源性，但是对于哺乳动物如猿（HOMOSAPIENS）、大鼠、小鼠它的同源性却不高，大致在66左右，体现其高的保守性。通过跟同源性最好的金头鲷（SPARUSAURATA）氨基酸翻译比对表明，此序列能翻译560个氨基酸，3端非翻译区为480BP。是遗憾的是，我们未能成功克隆出所需要的5末端序列，可能失败的原因是引物设计得30不好，亦或是PCR反应条件不好。运用MEGA4中的临位相联法（NEIGHBORJOINING，NJ）构建了鲈鱼与其他8个物种的CPTI基因核酸序列进行系统进化树，我们发现金头鲷的CPTI与鲈鱼的CPTI的亲缘关系较近，说明二者的CPTI基本相同。牛、
49、羊等哺乳动物的CPTI却与鱼的CPTI亲缘关系相距较远，表明它们之间的CPTI结构和功能有所不同。我们推测CPTI在低等脊椎动物中的功能和作用机制比在哺乳类中更为复杂。综上所述，本课题对今后深入研究脂肪代谢的相关因素，改善鱼类的肉质和口味都有重要的意义，为进一步研究鲈CPTI蛋白的功能研究奠定了理论基础。在提高生产水平、创造最佳经济效益的同时，生产出能满足人们生活水平要求的高蛋白、低脂肪、好口味的的鲈鱼。参考文献1EATONSCONTROLOFMITOCHONDRIALBOXIDATIONFLUXPROGLIPIDRESJ2002,41,1972392FRASERF,CORSTORPHINECG,ZAMMITVATOPOLOGYOFCARNITINEPALMITOYLTRANSFERASEI
