曼氏无针乌贼过氧化物还原酶peroxiredoxin 1基因的克隆【毕业设计】.doc

资源描述

1、本科毕业设计（20_届）曼氏无针乌贼过氧化物还原酶PEROXIREDOXIN1基因的克隆所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录中英文摘要1引言32PRX1基因全长的克隆及序列分析421材料与方法4211实验试剂及配置方法4212主要仪器设备422曼式无针乌贼总RNA的提取5221曼式无针乌贼目标基因片段的获得5222曼氏无针乌贼3RACE末端扩增523PCR产物的切胶纯化回收73实验结果831曼式无针乌贼总RNA的提取8323RACE扩增曼式无针乌贼PRX1基因3末端933SMPRX1基因的核苷酸分析104总结1441结论1442创新点1543展望15参考文献15附录

2、错误未定义书签。摘要摘要曼氏无针乌贼资源数量较大，作为主要经济鱼种是浙江沿海传统捕捞对象。但由于过度捕捞，乌贼的资源锐减。因此，对曼氏无针乌贼进行生化分子机制的研究工作显得尤为迫切。本研究采用大规模EST测序方法，结合末端快速扩增（RAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDS，RACE）技术从曼氏无针乌贼墨囊中克隆到过氧化物还原酶1（PROXIREDOXIN1，SMPRX1）基因的CDNA序列全长；PRX1基因的CDNA全长为1052BP，5UTR为79BP，3UTR为352BP，开放阅读框（OPENREADINGFRAME，ORF）为621BP，编码206个氨基酸。MRNA3端具

3、有推测的多聚腺苷酸加尾信号（POLYADENYLATIONSIGNAL）AATAAA和POLYA尾巴。PRX1的预测分子量为244KDA，理论等电点为663。关键词曼氏无针乌贼；过氧化物还原酶1；基因克隆；基因表达ABSTRACTABSTRACTSEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNEISANIMPORTANTECONOMICFISHERYRESOURCES,ISZHEJIANGCOASTALTRADITIONALFISHINGOBJECTBUTDUETOOVERFISHING,THESQUIDSRESOURCESDOWNSHARPLYTHEREFORE,SEPIELLAMA

4、INDRONIDEROCHEBRUNEOFBIOCHEMICALRESEARCHONMOLECULARMECHANISMSISPARTICULARLYURGENTTHISSTUDYADOPTSEXTENSIVEESTSEQUENCINGMETHODS，RAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDSTECHNOLOGYFROMSEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNESLIVERCLONEPROXIREDOXIN1GENESCDNASEQUENCEFULLLENGTH；PRX1GENECDNAFULLLENGTH1052BP,5UTRWAS79BP,3UTRIS352B

5、P,OPENREADINGFRAMEOPENREADINGFRAME,ORFIS621BP,ENCODING206AMINOACIDSMRNA3ENDOFAPUTATIVEPOLYADENYLATIONPOLYADENYLATIONSIGNALPOLYADENYLATIONSIGNALAATAAAANDTHEPOLYATAILPRX1THEPREDICTEDMOLECULARWEIGHTOF244KDA,ISOELECTRICPOINTOF663KEYWORDSSEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNE；PEROXIREDOXIN1；GENECLONING；GENEEXPRES

6、SION1引言曼氏无针乌贼SEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNE，俗称墨鱼，属软体动物门（MOLLUSCA）、头足纲（CEPHALOPODA）、二腮亚纲（DIBRANCHIA）、十腕目（DECAPODA）、乌贼超科（SEPIACEA）、乌贼科（SEPIIDAE）、无针乌贼属（SEPIELLA），是沿海广温广布种，广泛分布于我国渤海、黄海、东海、南海以及日本东京湾、富山湾以西、韩国、马来群岛、菲律宾群岛、苏联远东海和印度洋海域等，被称为东海“四大海产”之一。乌贼的经济价值很高，可食部分约占总体的92，肉质鲜嫩脆滑；雄性生殖腺干品称为“墨鱼穗”，雌性缠卵腺称为“墨鱼蛋”，均为海

7、味佳品（董正之,1989）。但由于过度捕捞和生态恶化，曼氏无针乌贼资源急剧衰退，对曼氏无针乌贼进行生化分子机制等基础生物学研究变得越来越重要。乌贼墨汁储存于墨囊中，王春琳等对曼氏无针乌贼墨囊进行了组织学及墨汁形成的超微结构，研究表明墨囊壁由外膜、肌肉层和黏膜三部分组成，具有凝血功能，作为一种中药被用于治疗多种妇科疾病，如功能性子宫出血、子宫痉挛和早起虚弱等病症。而乌贼墨汁的主要成分黑色素的生物合成的最后一步需要在过氧化物酶的催化下完成。过氧化物还原酶（PEROXIREDOXIN，PRX）是广泛存在于各类生物体中的一种重要的抗氧化酶，它是生物体应对活性氧族侵害机制中具有重要作用的蛋白。曼氏无针乌

8、贼是一种具有强抵抗力，不易受病菌侵害的水产经济动物，并且曼氏无针乌贼卵也具有一定的抗菌能力，在适当的温度下能在恶劣的外环境中存活。为了探明PEROXIREDOXIN1基因在曼氏无针乌贼成体以及胚胎发育过程中是否具有一定的作用，本研究拟对PRX1基因CDNA序列全长进行克隆并将其进行体外大肠杆菌重组，并通过实时荧光定量PCR技术对PRX1基因在曼氏无针乌贼成体各组织的表达，为今后研究其跟黑色素形成之间的关系以及PEROXIREDOXIN蛋白在曼氏无针乌贼抗氧化系统中的作用打下分子基础。这不仅在学术上有重要意义，还将对提升曼氏无针乌贼的药用价值、经济价值和曼氏无针乌贼大规模养殖发展起促进作用。本研

9、究的目的和意义11本研究的目的1通过克隆得到曼氏无针乌贼PEROXIREDOXIN1的CDNA全长序列。2对其进行结构与功能分析。3检测该基因在不同组织中的表达情况。1重组表达关键结构域。5检测PEROXIREDOXIN1在重组蛋白的活性检测。6查阅与本研究相关的资料。7完成一篇2000字以上的综述文章，翻译两篇相关的外文参考文献。8学会并掌握基本的科研技能，完成毕业论文。12本研究的意义曼氏无针乌贼是我国重要的水产经济动物，但近年来疾病的频发给养殖业造成了巨大的经济损失。由于免疫学方面的基础研究较少，面对日益严重的病害问题以及病因的多样性，目前尚无有效的疾病防治措施来保证曼氏无针乌贼健康养殖

10、和可持续发展。在对曼氏无针乌贼的病原和环境因子进行研究的同时，从机体本身入手，研究其免疫防御机制，对曼氏无针乌贼养殖业的可持续发展具有重要意义。PEROXIREDOXIN1在细胞内主要起抗氧化和调节过氧化氢介导的信号转导作用；参与细胞的增殖与分化；增强NK细胞的活性；保护自由基敏感蛋白；参与血红素的代谢还参与细胞周期进程以及发挥分子伴侣作用。在生物养殖、生物工程、生物制药、生理活动调控、疾病防治、研究寄生性原虫疫苗等方面展示出广阔的应用前景。而关于曼氏无针乌贼的PEROXIREDOXIN1的作用目前尚不明确，更没有人做过关于它的研究。所以对曼氏无针乌贼PEROXIREDOXIN1进行克隆与表达

11、，研究它的特殊生物学功能具有重大的意义。2PRX1基因全长的克隆及序列分析21材料与方法材料及仪器设备211实验试剂及配置方法TRIZOLREGANT、3FLIRACECORESETVER20、TAKARALATAQ、琼脂糖凝胶、胶回收试剂盒、普通TAQ酶、核算MARKER、PCR产物克隆载体PMD18TVECTOR、DNTPS均购自大连宝生物（TAKARA）公司LB培养基、DEPC水购自上海捷瑞生物有限公司，氨芐青霉素购自上海生共其他试剂均为国产分析纯试剂。LB液体培养基25G培养基粉末溶解于1L纯水中，高压灭菌。含氨芐青霉素的LB培养及平板1L的培养基中加入15G琼脂，高压灭菌，冷却至50

12、时加入终浓度为100G/ML的氨芐青霉素，倒平板。当培养基凝固后，储存于4备用。212主要仪器设备液氮罐YDS3普通冰箱HAIR,BCD153TF无菌接种箱WJZJX水平电泳仪ABYGENE,BGSUBMIDI便携式电子精密天平SARTORIUS,TE612L超低温冰箱DW86L388垂直板电泳仪BAYGENE,VERMINI冷冻离心机THERMO,AULFUGEPRIMOR蒸馏水器SZ93分析天平METTLER,EL104高压灭菌锅LDZX30KBS超声波细胞破碎仪酸度计FE20K磁力搅拌棒GAYGENE,STIRRER1DB离心机BAYGENE,BGQSPINM脱色摇床TS1000紫外分光

13、光度计752S凝胶成像系统BIORAD,UNIVERSALHOODII恒温水槽DK8D变频摇床BHWR100B电热恒温鼓风干燥箱DHG9053A实时荧光定量PCR仪器RTCYCLER236PCR仪TECHNE,TC512超净工作台YJ875微量可调移液器EPPENDORF超微量分光光度计NANODROPND20022曼式无针乌贼总RNA的提取选取体长为810CM的新鲜乌贼个体（采自浙江省宁海县得水育苗场。），用高温灭菌的手术剪快速解剖，剪取1立方厘米左右体积的肝脏，置于已加入1MLSAMPLEPROTECTOR的15ML离心管中，室温可保持24H，长期保持须在20的冰箱中。剪取肝脏组织1020

14、管，用于PRX1基因全长的克隆实验。用TRIZOLREGANT试剂（购自TAKARA）提取曼氏无针乌贼总RNA。提取RNA过程中所有枪头和离心管均用DEPC处理，研钵、镊子、剪刀等非塑料制品高温180干燥灭菌处理。曼氏无针乌贼总RNA提取具体操作步骤如下（1）取1立方厘米左右体积的肝脏组织，用吸水纸吸干液体，加液氮在研钵中研磨成粉末。趁液氮未挥发光将粉末转移到15MLRNASEFREE离心管中，并加入1MLTRIZOL（根据组织体积大小加适量）；（2）冰上放置5MIN，以使核蛋白裂解彻底；（3）加入TRIZOL1/5V的氯仿，剧烈震荡混匀30S，冰上NANO放置3MIN；（4）冰冻离心1200

15、0RPM415MIN。离心后，混合物分为最底层的淡红色酚仿相，中间蛋白层和无色的上层水相，RNA就存于水相中，水相体积约为5060；（5）将上清液转移到15MLRNASEFREE离心管里，加入与上清液等体积的异丙醇，冰上放置10MIN；（6）冷冻离心机12000RPM410MIN（离心结束后，可在管底看到白色胶状的RNA沉淀）；（7）弃上清，用1ML75酒精洗涤RNA沉淀，7500RPM45MIN；（8）弃上清，室温下放置510MIN，使酒精挥发；（9）加20LDEPC水溶解，80保存；（10）使用微量核酸定量仪检测RNA产率和质量鉴定。用双蒸水稀释RNA，使用超微量分光光度计NANODROP

16、ND2000检测RNA的A260/280比值及RNA总浓度。221曼式无针乌贼目标基因片段的获得曼氏无针乌贼的CDNA文库由北京博奥生物有限公司构建。根据曼氏无针乌贼CDNA文库EST序列的大规模测定，将获得的有效EST序列数据进行聚类拼接，将所获得的CONTIGS在数据库中进行分析，根据同源相似性分析结果找到与PRX1基因相同源的EST序列。222曼氏无针乌贼3RACE末端扩增PRX1基因的3RACE末端扩增方法参照TAKARA3FULLRACECORESETVER20试剂盒说明书，结合TAKARALATAQ进行PCR扩增。CDNA第一链合成25L反应体系（一般情况下，TOTALRNA的使用

17、量为1G，增加模板RNA的使用量有时会使反应性能下降。）RNA1L（浓度为1000MG/L）3RACEADAPTOR（5M）1L5MMLVBUFFER2LDNTPMIXTURE（10MMEACH）1LRNASEINHIBITOR（40U/L）025LREVERSETRANSCRIPTASEMMLV（RNASEH）（200U/L）025LRNASEFREEDH2O45LTOTALVOLUME10L反应在TECHNEPCR仪TC512中进行，反应条件为42,60MIN70,15MIN反应结束后可以进行下一步实验或将反应液保存于20冰箱中。套式PCR反应引物的设计根据获得的目标PRX1基因的EST序

18、列，使用PRIMER50软件设计特异性异物PRX1643和PRX1806，分别与TAKARA3FULLRACECORESETVER20试剂盒自带的引物3RACEOUTERPRIMER和3RACEINNERPRIMER进行套式PCR反应。第一轮扩增使用引物PRX1643和3RACEOUTERPRIMER，得到的PCR产物作为模板进行第二轮扩增，第二轮扩增引物为PRX1806和3RACEINNERPRIMER。引物如下PRX1643CAGTACCATGAAGCCTGATCCAA（之后的已知片段410BP）PRX1806GATGTTCAGCCGTCCTCTTCACT（之后的已知片段247BP）3RA

19、CEOUTERPRIMERTACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3RACEINNERPRIMERCGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG套式PCR反应的OUTERPCR反应体系反应体系反转录反应液35L（25LL）1CDNADILUTIONBUFFER65L（510L）GENESPECIFICOUTERPRIMER（10M）2L3RACEOUTERPRIMER（10M）2L10LAPCRBUFFER（MG2FREE）4LMGCL2（25MM）3LTAKARALATAQ（5U/L）025LDH2O2875LTOTALVOLUME50L反应条件943MIN2030C

20、YCLES9430S2030CYCLES55（3765）30S2030CYCLES721MIN/KBP27210MINPCR反应结束后取8L产物进行1琼脂糖凝胶电泳检测，电泳后用EB染色10MIN，凝胶成像系统拍胶检测是否有目标片段。套式PCR反应的INNERPCR反应反应体系1STPCR产物1LDNTPMIXTURE25MMEACH8L10LAPCRBUFFER（MG2FREE）5LMGCL2（25MM）5LTAKARALATAQ（5U/L）05L1CDNADILUTIONBUFFER65L（510L）GENESPECIFICINNERPRIMER（10M）2L3RACEINNTERPRIM

21、ER（10M）2L10LAPCRBUFFER（MG2FREE）4LDH2O265LTOTALVOLUME50L反应条件943MIN30CYCLES9430S30CYCLES55（3765）30S30CYCLES721MIN/KBP27210MINPCR反应结束后，取510L的PCR反应产物进行琼脂凝胶电泳，确认是否成功扩增3RACE特异性片段。23PCR产物的切胶纯化回收1）PCR反应结束后，取510L的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离目的片段，在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶体积，提高DNA回收

22、率。切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。2）切碎胶块，称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1MG1L进行计算。向胶块中加入胶块融化液DRBUFFER，DRBUFFER的加量如下表（表21）表21DRBUFFER使用量TABLE21THEVOLUMEUSAGEOFDRBUFFER凝胶浓度DRBUFFER使用量104个凝胶体积10155个凝胶体积15206个凝胶体积3）均匀混合后75加热融化胶块，此时硬不断振荡混合，使胶块充分融化。4）向上述胶块融化液中加入DRBUFFER量的1/2体积量的DRBUFFER，均匀混合。当分离小于400BP的DNA片段时，应在此

23、溶液中加入终浓度为20的异丙醇。5）将试剂盒中的SPINCOLUME安置于COLLECTIONTUBE上。将上述操作4的溶液转移至SPINCOLUME中，12000RPM离心1MIN，弃滤液。6）将500L的RINSEA加入SPINCOLUME中，12000RPM离心30S，弃滤液。7）将700L的RINSEB加入SPINCOLUME中，12000RPM离心30S，弃滤液。8）重复操作7）9）将SPINCOLUME安置于COLLECTIONTUBE上，12000RPM离心1MIN。10）将SPINCOLUME安置于新的15ML的离心管中，在SPINCOLUME膜的中央处加入加热至60的灭菌蒸馏

24、水或ELUTIONBUFFER，室温静置1MIN。11）12000RPM离心1MIN洗脱DNA。感受态细胞的制备1）从37培养12H的LB平板上挑取新活化的ECOLIDH5单菌落，接种于100MLLB液体培养基中，37下，220RPM振荡培养36小时，至其OD600为05左右。2）将培养液转入预冷的50ML离心管中，冰上放置10MIN，使培养物冷却至0，然后于4下3000RPM离心10MIN。3）弃去上清，倒置1MIN以除去残留培养液。加入预冷的01MOL/L的CACL2溶液10ML轻悬浮细胞，冰上放置1530MIN后，4下3000RPM离心10MIN。4）弃去上清，加入4ML预冷含15甘油的

25、01MOL/L的CACL2溶液重悬细胞沉淀，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。5将感受态细胞分装成80L的小份，贮存于70冰箱中冻存。3连接在200L的PCR管中加入PMD18T载体05LPCR纯化产物45L连接缓冲液（冰中融化）5LPCR仪中16连接过夜4转化1）冰中融化的80L感受态细胞ECOLLDH5中加入10L连接产物，冰浴30MIN。2）将混合物置于42水浴锅中热激90S，取出后置于冰中冰浴2MIN。3）加入200L含100M氨苄青霉素的LB培养基，37220RPM，恒温摇床中振摇45MIN。4）将菌液涂布于含100M氨苄青霉素的平板中，37培养过夜。5）1216H后，检查平板并用

26、菌落PCR法筛选阳性克隆送上海生工测序。PRX1基因序列比较系统进化分析和PRX1基因蛋白结构预测对测序结果使用VECTORNTISUITE8软件进行拼接使用CLUSTALX、HTTP/BIOSOFTNET/SMS/的序列翻译工具对曼氏无针乌贼CDNA全长及推导得到的氨基酸序列进行分析；使用BLASTP的软件与NCBI上已整理出来的同源氨基酸序列进行比较使用HTTP/CNEXPASYORG/TOOLS的SIGNALP软件对SMPRX1的信号肽信息进行分析；使用MEGA41软件进行分子系统进化树的构建。PRX1蛋白空间结构预测使用PROTEINDATABANK（HTTP/WWWPDBCN）3实验

27、结果31曼式无针乌贼总RNA的提取采用大连宝生物的TRIZOLREGANT提取曼式无针乌贼总RNA经电泳检测可以清晰的看到5S、18、和28S（见图21）三条带，无明显拖带。超微量分光光度计ND2000检测所提取的RNA，260/280结果为192，浓度为1548LNG/L。电泳图和所测数据表明曼式无针乌贼总RNA提取完整性良好，总RNA浓度较高。（图21）图31此图为RNA凝胶电泳图。FIGURE31THISPICTURESHOWSTHERNAGELELECTROPHORESIS323RACE扩增曼式无针乌贼PRX1基因3末端将曼式无针乌贼PRX1基因的已知EST序列与NCBI上其他物种的P

28、RX1序列进行比较，发现该序列5末端齐全。根据PRX1基因EST序列，设计特异性引物PRX1643和PRX806，分别于TAKARA3FULLRACECORESETVER20试剂盒自带的引物3RACEOUTERPRIMER和RACEINNERPRIMER进行套式PCR反应，套式PCR扩增结束以后，电泳检测PCR产物，得到一条明显且无拖带的DNA片段（见图22），产物片段大小约为500BP，与预期片段相符。（图32）此图为套式PCR扩增以后CDNA凝胶电泳图。FIGURE32THISPICTURESHOWSTHENESTEDPCRAMPLIFICATIONOFCDNAAFTERGELELECTR

29、OPHORESIS将目的片段切胶纯化，并转化感受态，涂平板后采用PCR法挑选阳性克隆进行测序，测序结果去载体后获得的片段与原序列有重叠区域，表面该片段与原EST序列属于统一基因，拼接后得到全长为1064BP的曼式无针乌贼过氧化物还原酶1基因全长CDNA序列（见图23）。1GGGGACCGTCAGTCATTCGCACGATAACCGTTCGACGTGTTTCTAGTCTGAGCTCTTGTT1MCENIEKCKTASHL61TCTTACTCTTCAGGACACAATGTGTGAAAACATCGAAAAGTGCAAGACTGCATCACATCT15LPSQPAPCFKGTAVVNGEFK121TC

30、TTCCTTCTCAGCCAGCTCCCTGCTTTAAGGGAACAGCTGTTGTAAATGGTGAATTCAA35EICLKDYKGKYVVLFFYPLD181AGAAATTTGCCTTAAAGACTACAAAGGCAAATATGTGGTACTTTTTTTCTACCCATTAGA55FTFVCPTEIIAFSDRVEEFR241CTTTACTTTTGTATGTCCAACAGAAATCATTGCCTTCAGTGATCGTGTAGAAGAGTTCCG75KIDCEVVACSTDSHFSHLAW301AAAAATTGACTGTGAAGTGGTAGCTTGTTCTACAGACAGCCATTTCT

31、CTCATCTAGCATG95INTPRKQGGLGEMNIPLLAD361GATAAACACTCCCAGAAAACAAGGAGGCTTGGGTGAAATGAACATTCCTTTGTTAGCAGA115KNCDIARRYGCLKEEDGIAF421CAAGAACTGTGACATTGCCAGGAGATATGGCTGTCTGAAAGAGGAAGATGGAATTGCATT135RGLYIIDGKGILRQITINDL481CAGAGGCCTCTACATTATTGATGGTAAAGGCATTCTAAGACAAATAACAATTAATGATCT155PVGRSVDETLRLVQAFQYTD541TCCT

32、GTTGGGCGCTCTGTGGATGAAACTCTTCGCTTAGTGCAAGCATTCCAGTATACCGA175KHGEVCPAGWKPGSSTMKPD601CAAGCATGGTGAAGTATGTCCAGCTGGATGGAAACCAGGCAGCAGTACCATGAAGCCTGA195PKQSQEYFRSAN661TCCAAAACAAAGCCAAGAATATTTTAGAAGTGCCAACTAAATGAATACCACTCTCCTCCA721GTACAAAAGCAGCAAAAAAAGGCACTGTATCCCCCCACACTCCCTCATATCACCATTCAC781CTTCAGTGGCTTAC

33、TTTGTTTTATAGATGTTCAGCCGTCCTCTTCACTTGGGTTGGAGAG841ATGTGACTGGTTTCATGAGTGTGTGATGTAGCTGTTTTCTAGTCCACTACTCAGCTTTAA901AATAAAACATATAAAGCTGCTTTCATTGACATTGTAGTAAAACATGTTATGTTTGGCATG961GCATCATCACTATGACCAATAAATGCTACTGAATGCTAAGAAGAAATTAAGTCCCTCGAC1021CTGAAGCTCAGACCTTCTATGGGCGCGGGCGA（图33）此图为曼式无针乌贼PRX1CDNA的全长及推导出

34、的氨基酸序列图。FIG33TOTALNUCLEARSEQUENCEANDAMINOACIDSOFSMPRX1星号（）表示终止密码子位置，加尾信号（AATAAA）加粗表示33SMPRX1基因的核苷酸分析SMPRX1核苷酸及推导的氨基酸序列SMPRX1基因的核苷酸序列见图23。将3RACE得到的去载体核苷酸序列与原EST序列进行拼接后，得到PRX1基因的CDNA全长为1052BP，5UTR为79BP，3UTR为352BP，开放阅读框（OPENREADINGFRAME，ORF）为621BP，编码206个氨基酸。MRNA3端具有推测的多聚腺苷酸加尾信号（POLYADENYLATIONSIGNAL）AA

35、TAAA和POLYA尾巴。SMPRX1的蛋白质氨基酸序列分析和同源性分析SMPRX1的预测分子量为244KDA，理论等电点为663。利用HTTP/CNEXPASYORG的SIGNALP软件、SMART软件和SCANPROSITE蛋白质分析软件分析ESPRX1的氨基酸序列显示，ESPRX1无信号肽。根据SMART分析显示可知，SMPRX1含有一个PRX结构域（LEU4PRO218）和一个AHPC结构域（LEU4SER141）。经BLAST分析发现，ESPRX1与斑马鱼DRERIO、XLEAVIS、人HSAPIENS、SSALAR等动物PRX1的同源性很高。（图34）此图为SMPRX1多序列对比结

36、果。FIG34MUCHSEQUENCEALIGNMENTRESULTOFSMPRX1SMPRX1基因的进化分析挑选不同物种的6中类型PRX的氨基酸序列（序列信息见表21），使用MEGA41软件构建PRX分子进化树。从图中我们可以看到，六种类型的PRX氨基酸序列各自聚成一支，SMPRX1同其他物种的PRX1氨基酸序列聚在一起形成PRX1分支。SMPRX1与SASLAR、斑马鱼DRERIO、XLAEVIS、人HSAPIENS等聚得较拢。与褐家鼠（RNORVEGICUS）和家鼠（MMUSCULUS）牛（BTAURUS）聚得较远。MMUSCULUSPRX1RNORVEGICUSPRX1BTAURUSP

37、RX1HSAPIENSPRX1XLAEVISPRX1DRERIOPRX1SSALARPRX1SMPRX1BTAURUSPRX2HSAPIENSPRX2RNORVEGICUSPRX2MMUSCULUSPRX2BGLABRATAPRX4HSAPIENSPRX4BTAURUSPRX4RNORVEGICUSPRX4MMUSCULUSPRX3RNORVEGICUSPRX3HSAPIENSPRX3IPUNCTATUSPRX6GGALLUSPRX6MMUSCULUSPRX6SSCROFAPRX6DMELANOGASTERPRX5MMUSCULUSPRX5CAETHIOPSPRX5HSAPIENSPRX5图3

41、HYLIGENETICTREEOFPRXS4总结41结论关于PRX1的研究，在哺乳动物中尤其是人类的报道较多。本研究利用曼氏无针乌贼CDNA文库EST序列的大规模测定获得目标SMPRX1的EST序列，设计特异性引物结合RACE扩增技术，克隆了SMPRX1的全长的CDNA序列。通过实验测得曼式无针乌贼PRX1基因的CDNA全长为1052BP，5UTR为79BP，3UTR为352BP，开放阅读框为621BP，编码206个氨基酸。MRNA3端具有推测的多聚腺苷酸加尾信号AATAAA和POLYA尾巴。PRX1的预测分子量为244KDA，理论等电点为663。分析PRX1的氨基酸序列显示，PRX1无信号肽

42、。利用NCBIBLASTP软件的同源性比对结果表明，与斑马鱼（DRERIO）和人（HSAPIENS）XLAEVIS等聚得较拢，与褐家鼠（RNORVEGICUS）和家鼠（MMUSCULUS）牛（BTAURUS）聚得较远。42创新点（1）对头足纲PRX1展开基因研究，为进一步深入研究该基因的功能及其基因家族的进化提供了重要基础。（2）通过对曼式无针乌贼PRX1蛋白的分子生物学分析，初步探讨了PRX1蛋白在成体各组织和幼体胚胎发育中的表达规律，为研究PRX1基因在各组织和胚胎发育期的作用提供了重要基础。43展望PEROXIREDOXIN是一种在生物体内对活性氧族的清除中发挥重要作用的抗氧化酶系。随着

43、研究的深入，该蛋白家族的生理、生化功能已清楚地呈现在人们面前，且其个别成员新的生理作用也不断被发现。目前，人类基因组计划的完成为回答此问题提供了便利。此外，该家族蛋白与肿瘤的关系值得思考，它也许能为肿瘤的治疗提供新的途径。鉴于PRX1蛋白是一个独特的过氧化物酶，本实验对曼式无针乌贼PRX1蛋白的CDNA序列进行了克隆和体外重组，今后还可以在一下几个方面进行进一步深入研究。（1）进一步检测曼式无针乌贼PRX1基因的体外重组表达蛋白的功能。（2）对曼式无针乌贼成体各组织中和曼式无针乌贼胚胎发育过程中PRX1酶活性功能的分子生化机制研究。（3）为后续的基因芯片检测乌贼喷墨相关基因的研究奠定基础。参考

44、文献1呼光富,李忠,梁红伟等镉对克式原螯虾肝胰腺触角腺及腮中SOD和CAT活性的影响J农业环境科学学报,2009,281180618112姜权黄孢原毛平革菌PEROXIREDOXIN基因克隆和表达D四川大学生命科学学院,2006,4135125333王春琳,樊晓旭,余红卫等曼氏无针乌贼墨囊组织学及墨汁形成的超微结构动物学报,2008,5423663724张华,许叔祥,定量聚合酶连是反映的研究与临床应用中华检验医学杂志J,2000,2341201215章波,栗永萍,艾国平PEROXIREDOXIN蛋白家族与电离辐射中华放射医学与防护杂志J2005,25595976杨丽华,方展强,郑文彪等镉对基于

45、腮和肝脏超氧化物歧化酶活性的影响安全与环境学报J,2003,123613167王宜燕,孙虎山,梁建光等贻贝发育早期酯酶和过氧化物酶活性海洋科学进展J,2007,2574464528章波,向渝梅,白云抗氧化蛋白PEROXIREDOXIN家族研究进展生理科学进展J,2004,3583523549J萨姆布鲁克,EF弗里奇,T曼尼阿蒂斯著,金冬雁,黎孟枫等译分子克隆实验指南科学出版社200288088710章波,艾国平,王燕,等采用RNAI技术抑制PEROXIREDOXINI的表达J中国生物化学与分子生物学报,2005,21570971211萨姆布鲁克J,拉塞尔DW分子克隆实验指南上/下册M黄培堂,王

46、嘉玺,朱厚础,等译3版北京科学出版社,2002864566712MU,C,ZHAO,J,WANG,LETALMOLECULARCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFPEROXIREDOXIN6FROMCHINESEMITTENCRABERIOCHEIRSINENSISFISHSHELLFISHIMMUNOL2009263182182713侯义龙,张开春,吴禄平等果树组织中总RNA提取的新方法沈阳农业大学学报,2002,33212212514PUSHPAMALI,WA,DEZOYSA,M,KANG,H,ETALCOMPARATIVESTUDYOFTWOTHIOREDOXINPE

47、ROXIDASESFROMDISKABALONEHALIOTUSDISCUSDISCUSCLONING,RECOMBINANTPROTEINPURIFICATION,CHARACTERIZEATIONOFANTIOXIDANTACTIVITIESANDEXPRESSSIONANALYSISFISHSHELLFISHIMMUNOL2008,245129430715WOOD,ZA,SCHRDER,E,HARRIS,JR,ETALSTRUCTURE,MECHANISMANDREGULATIONOFPEROXIREDOXINSTRENDSBIOCHEMSCI2008,2819324016胡松年基因表达

48、序列标签EST数据分析手册浙江大学出版社200515215917WOOD,ZA,POOLE,LB,KARPLUS,PA,PEROXIREDOXINEVOLUTIONANDTHEREGULATIONOFHYDROGENPEROXIDESIGNALINGSCIENCE20033005165065318YU,BP,CELLULARDEFENSESAGAINSTDAMAGEFROMREACTIVEOXYGENSPECIESPHYSIOLREV1994,741213916219ZHANG,Q,LI,F,ZHANG,J,WANG,B,GAO,H,HUANG,B,JIANG,H,XIANG,J,MOLECU

49、LARCLONING,EXPRESSIONOFAPEROXIREDOXINGENEINCHINESESHRIMPFENNEROPENAEUSCHINENSISANDTHEANTIOXIDANTACTIVITYOFITSRECOMBINANTPROTEINMOLIMMUNOL200744213501350920BERGGREN,MIHUSBECK,BSAMULITIS,BETALTHIOREDOXINPEROXIDASE1PEROXIREDOXIN1ISINCREASEDINTHIOREDOXIN1TRANSFECTEDCELLSANDRESULTSINENHANCEDPROTECTIONAGAINSTAPOPTOSISCAUSEDBYHYDROGENPEROXIDEBUTNOTBYOTHERAGENTSINCLUDINGDEXAMETHASONE,ETOPOSIDE,ANDDOXORUBICINARCHBIOCHEMBIOPHYS2001,39210310921RHEESG,

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