1、本科毕业设计（20_届）曼氏无针乌贼过氧化物还原酶PEROXIREDOXIN4基因的克隆所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月2目录中英文摘要1引言12材料和方法321试剂和仪器3211试剂3212仪器322试验方法3221曼氏无针乌贼总RNA的提取3222PRX4基因全长的克隆4223曼氏无针乌贼3RACE末端扩增4224感受态细胞的制备6225感受态细胞的连接6226感受态细胞的转化63结果与讨论731曼氏无针乌贼总RNA的提取及3RACE扩展曼氏无针乌贼PRX4基因3末端7311曼氏无针乌贼总RNA的提取73123RACE扩展曼氏无针乌贼PRX4基因3末端732SM
2、PRX4基因的核苷酸序列分析833SMPRX4基因的同源性分析和进化分析84讨论与总结1341讨论1342总结13致谢14参考文献153摘要曼氏无针乌贼资源数量较大，曾是我国四大海产渔业之一，作为主要经济鱼种是浙江沿海传统捕捞对象。但由于过度捕捞，乌贼的资源锐减，已形不成鱼讯，目前仅作为兼捕对象。因此，对曼氏无针乌贼进行生化分子机制的研究工作显得尤为迫切。本研究采用大规模EST测序方法，结合末端快速扩增（RAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDS，RACE）技术从曼氏无针乌贼肝脏中克隆到过氧化物还原酶4（PROXIREDOXIN4，SMPRX4）基因的CDNA序列全长；曼氏无针乌
3、贼PRX4基因的CDNA序列全长为1023BP，5UTR（UNTRANSLATEDREGION，UTR）为45BP，3UTR为243BP，开放阅读框（OPENREADINGFRAMEORF）为735BP，编码245个氨基酸，SMPRX4的预测分子量为273KDA，理论等电点为699。MRNA3端具有多聚腺甘酸加尾信号（POLYADENYLATIONSIGNAL）TAAAAA和POLYA尾巴。关键词曼氏无针乌贼；过氧化物还原酶4；EST测序；基因克隆；ABSTRACTSEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNEISANIMPORTANTECONOMICFISHERYRESOURCE
4、S,ONCEISONEOFCHINASFOURMAJORMARINEFISHERY,ASTHEMAINECONOMICFINGERLINGISZHEJIANGCOASTALTRADITIONALFISHINGOBJECTBUTDUETOOVERFISHING,THESQUIDSRESOURCESDOWNSHARPLY,DONOTFORMFISINGSEASONALREADY,CURRENTLYONLYASANDCATCHINGOBJECTSOFORBIOCHEMICALMOLECULARMECHANISMOFRESEARCHWORKAPPEARMOREIMPORTANTANDURGENTABO
5、UTSEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNETHISSTUDYADOPTSEXTENSIVEESTSEQUENCINGMETHODS,RAPIDAMPLIFICATIONOFCDNAENDSTECHNOLOGYFROMSEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNESLIVERCLONEPROXIREDOXIN4GENESCDNASEQUENCEFULLLENGTH,PRX4GENESFOR1023BPCDNASEQUENCELENGTH,5UTR（UNTRANSLATEDREGION，UTR）FOR45BP,3UTRFOR243BP,OPENREADINGFRAM
6、EORF）FOR735BP,CODING245AMINOACIDSMRNA3ENDHASPOLYADENYLATIONSIGNALTAAAAAANDPOLYATAILKEYWORDSSEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNE；PEROXIREDOXIN4；ESTSEQUENCING；GENECLONING；41引言曼氏无针乌贼SEPIELLAMAINDRONIDEROCHEBRUNE（以下简称乌贼），俗称墨鱼，属软体动物门（MOLLUSCA）、头足纲（CEPHALOPODA）、二腮亚纲（DIBRANCHIA）、十腕目（DECAPODA）、乌贼超科（SEPIACEA）、乌贼科（S
7、EPIIDAE）、无针乌贼属（SEPIELLA），是沿海广温广布种，广泛分布于我国渤海、黄海、东海、南海以及日本东京湾、富山湾以西、韩国、马来群岛、菲律宾群岛、苏联远东海和印度洋海域。我国曼氏无针乌贼资源数量较大，曾是浙江渔场四大渔业之一，作为主要经济鱼种被捕捞，浙江省历史最高年产量（1957年）达到67万吨。但由于过度捕捞，资源遭到很大破坏，渔汛消失，80年代后期，特别是90年代以来，种质资源明显衰减，产量急剧下降，目前仅作为兼捕对象。关于曼氏无针乌贼形态构造，生态生理以及渔业资源等方面的研究已有零星报道，80年代，唐逸民和李星颉等人进行了乌贼增殖及繁殖保护工作作了一些调查研究的工作。在繁殖
8、方面，国外学者ROPERV等（1996）观察了BRACHIOTEUTHISBEANIIVERRILL的交配现象，YOUNGRE等（1985）研究了BRACHIOTEUTHISBEANIIVERRILL的卵与幼体，WATANABE1998研究了THYSANOTEUTHISRHOMBUS的胚胎发育，NIGMATULLINCM（1995）研究了THYSANOTEUTHISRHOMBUS的年龄、生长和繁殖生物学等。乌贼墨汁的主要成分黑色素的生物合成的最后一步需要在过氧化物酶的催化下完成。过氧化物还原酶（PEROXIREDOXIN，PRX）是广泛存在于各类生物体中的一种重要的抗氧化酶，它是生物体应对活性
9、氧族侵害机制中具有重要作用的蛋白。PEROXIREDOXINS蛋白广泛存在于各类生物体中，并且在细胞中的表达量很高，是大肠杆菌中十大丰富表达的蛋白之一（FISHERABETAL，1999），是真核细胞生物表达量位居前三的蛋白（SHICHIH，1990）。尽管第一个PRX蛋白是在酵母上得鉴定，但相继而来的其他PRX亚型及其特性是在哺乳动物中得到发现的。在哺乳动物中一共发现六种PRX蛋白，分别命名为PRX，PRX，PRX，PRX，PRX，PRX（见表11）。PRX家族蛋白最初根据所含有保守半胱氨酸的数目，分为两个亚型家族，即2CYS型和1CYS型，前者仅在52位上有一个高度保守的CYS，后者则在5
10、2和172位上分别有一个高度保守的CYS。PRX属于1CYS，其他成员属于2CYS。然而根据各个成员之间的同源性和保守CYS的不同，现在更趋向于将六种PRX蛋白分为3种类型（CHANGTSETAL，2002）典型2CYS型，非典型2CYS型和1CYS型。典型的2CYS型包括PRXPRX，除了N端保守的CYS残基之外，C端还有一个保守的CYS残基，称为典型2CYS型PRX蛋白；PRX除了具有一个N端保守的CYS残基之外，还有两个保守性较低的CYS残基，称为非典型性2CYS型PRX蛋白（LEYENSG，2003）；PRX仅在N末端具有一个保守的CYS残基，称为1CYS型PRX蛋白。哺乳动物中六种亚
11、型的PRX蛋白的同源性比较结果表明，2CYS型PRX蛋白之间同源性相对较高；1CYS型PRX蛋白与2CYS型蛋白的同源性约为40，同源性较低；非典型2CYS型PRX蛋白与家族中其他五种类型的PRX蛋白没有显著相似性，同源性约为10左右。高等生物中的同源基因在低等真核生物中仍具有功能，这表明PRX蛋白家族在进化上具有很高的保守性（TIENNETAL，2003）。5表11哺乳动物的六种亚型PRX蛋白TABLE11SIXSUBCLASSESOFPEROXIREDOXINSFROMMAMMALSPRXSUBTYPESPRXPRXPRXPRXPRXPRXPREVIOUSNOMENCLATURETPXAN
12、KEFAMSP23OSF3HBP23PAGTPXBNKEFBPRPCALPROMOTINTORINBAND8TSAAOP1SP22MER5AOE372TRANKAOEB166PMP20AOPPORF06LTW4AOP2POLYPEPTIDELENGTH199AA198AA256AA271AA214AA224AAHUMANCHROMOSOMALLOCATION1Q34113Q1210Q25Q2610Q221311Q131Q232CELLLARLOCATIONCYTOSOL，NUCLEUSCYTOSOL，MEMBRANEMITOCHONDRIANCYTOSOL，GOLGI，SECRETEDMITO
13、CHONDRIAN，PEROXISOME，CYTOSOLCYTOSOLGENEBANKAAA50464AAA50465BAA08389AAB95175AAF03750BAA0349661引言曼氏无针乌贼是一种具有强抵抗力，不易受病菌侵害的水产经济动物，并且曼氏无针乌贼卵也具有一定的抗菌能力，在适当的温度下能在恶劣的外环境中存活。为了探明PEROXIREDOXIN4基因在曼氏无针乌贼成体以及胚胎发育过程中是否具有一定的作用，本研究拟对PRX4基因CDNA序列全长进行克隆并进行简要分析，为今后研究其跟黑色素形成之间的关系以及PEROXIREDOXIN蛋白在曼氏无针乌贼抗氧化系统中的作用打下分子基础
14、。这不仅在学术上有重要意义，还将对提升曼氏无针乌贼的药用价值、经济价值和曼氏无针乌贼大规模养殖发展起促进作用。曼氏无针乌贼是我国重要的水产经济动物，但近年来疾病的频发给养殖业造成了巨大的经济损失。由于免疫学方面的基础研究较少，面对日益严重的病害问题以及病因的多样性，目前尚无有效的疾病防治措施来保证曼氏无针乌贼健康养殖和可持续发展。在对曼氏无针乌贼的病原和环境因子进行研究的同时，从机体本身入手，研究其免疫防御机制，对曼氏无针乌贼养殖业的可持续发展具有重要意义。PEROXIREDOXIN4在细胞内主要起抗氧化和调节过氧化氢介导的信号转导作用；参与细胞的增殖与分化；增强NK细胞的活性；保护自由基敏感
15、蛋白；参与血红素的代谢还参与细胞周期进程以及发挥分子伴侣作用。在生物养殖、生物工程、生物制药、生理活动调控、疾病防治、研究寄生性原虫疫苗等方面展示出广阔的应用前景。而关于曼氏无针乌贼的PEROXIREDOXIN4的作用目前尚不明确，更没有人做过关于它的研究。所以对曼氏无针乌贼PEROXIREDOXIN4进行克隆与表达，研究它的特殊生物学功能具有重大的意义。本研究的主要内容是通过克隆得到曼氏无针乌贼PEROXIREDOXIN4的CDNA全长序列并进行简要分析。72材料和方法21试剂和仪器211试剂TRIZOLREGANT、3FLIRACECORESETVER20、TAKARALATAQ、琼脂糖凝
16、胶、胶回收试剂盒、普通TAQ酶、核算MARKER、PCR产物克隆载体PMD18TVECTOR、DNTPS均购自大连宝生物（TAKARA）公司LB培养基、DEPC水购自上海捷瑞生物有限公司，氨芐青霉素购自上海生工其他试剂均为国产分析纯试剂。LB液体培养基25G培养基粉末溶解于1L纯水中，高压灭菌。含氨芐青霉素的LB培养及平板1L的培养基中加入15G琼脂，高压灭菌，冷却至50时加入终浓度为100G/ML的氨芐青霉素，倒平板。当培养基凝固后，贮存于4备用。212仪器磁力搅拌棒GAYGENE,STIRRER1DB离心机BAYGENE,BGQSPINM脱色摇床TS1000紫外分光光度计752S凝胶成像系
17、统BIORAD,UNIVERSALHOODII恒温水槽DK8D变频摇床BHWR100B液氮罐YDS3普通冰箱HAIR,BCD153TF无菌接种箱WJZJX水平电泳仪ABYGENE,BGSUBMIDI便携式电子精密天平SARTORIUS,TE612L超低温冰箱DW86L388电热恒温鼓风干燥箱DHG9053A实时荧光定量PCR仪器RTCYCLER236PCR仪TECHNE,TC512超净工作台YJ875垂直板电泳仪BAYGENE,VERMINI冷冻离心机THERMO,AULFUGEPRIMOR蒸馏水器SZ93分析天平METTLER,EL104高压灭菌锅LDZX30KBS超声波细胞破碎仪酸度计FE
18、20K微量可调移液器EPPENDORF8超微量分光光度计NANODROPND20022试验方法221曼氏无针乌贼总RNA的提取成体曼氏无针乌贼采自浙江省宁海县得水育苗场。选取胴长810CM的乌贼新鲜个体，更有利于实验结果的准确性，然后用高温灭菌的手术剪快速解剖，剪取得到1CM3左右体积的肝脏，解剖中尽量做到无菌无尘，将得到的肝脏置于事先准备好的加入1MLSAMPLEPROTECTOR的15ML离心管中，此离心管室温可保持24H，长期保持则需置于20冰箱中。剪取肝脏组织1020管，用于PRX4基因全长的克隆实验。用TRIZOLREGANT试剂（购自TAKARA）提取曼氏无针乌贼总RNA。提取RN
19、A过程中所有枪头和离心管均用DEPC处理，研钵、镊子、剪刀等非塑料制品高温180干燥灭菌处理。曼氏无针乌贼总RNA提取具体操作步骤如下（1）取1CM3左右体积的肝脏组织，用吸水纸吸取液体，置于研钵中加入液氮研磨成粉末。趁液氮未挥发光时，将粉末转移到15MLRNASEFREE离心管中，并加入1MLTRIZOL（根据组实际体积大小加入适量TRIZOL）；（2）冰上放置5MIN，以使核蛋白裂解彻底；（3）加入TRIZOL1/5V的氯仿，剧烈震荡混匀30S，冰上放置3MIN；（4）冰冻离心12000RPM415MIN。离心后，混合物分为最底层的淡红色酚仿相，中间蛋白层和无色的上层水相，RNA就存于水相
20、中，水相体积约为5060；（5）将上清液小心转移到RNASEFREE15ML离心管里，加入与上清液等体积的异丙醇，冰上放置10MIN；（6）冷冻离心机12000RPM410MIN（离心后，可在管底看到胶状的RNA沉淀）；（7）弃上清，用1ML75酒精洗涤RNA沉淀，7500RPM45MIN；（8）弃上清，室温下放置510MIN，使酒精挥发；（9）加20LDEPC水溶解，80保持；（10）使用微量核酸定量仪检测RNA产率和质量鉴定。用双蒸水稀释RNA，使用超微量分光光度计NANODROPND2000检测RNA的A260/280比值及RNA总浓度。222PRX4基因全长的克隆曼氏无针乌贼目标基因片
21、段的获得曼氏无针乌贼CDNA文库由北京博奥生物有限公司构建。根据曼氏无针乌贼CDNA文库EST序列的大规模测定，将获得的有效EST序列数据进行聚类拼接，生成CONTIGS，将所获得的CONTIGS在数据库中进行分析，根据同源相似性分析结果找到与PRX4基因相同源的EST序列。223曼氏无针乌贼3RACE末端扩增PRX4基因的3RACE末端扩增方法参照TAKARA3FULLRACECORESETVER20试剂盒说明书，结合TAKARALATAQ进行PCR扩增。（1）CDNA第一链合成925L反应体系（一般情况下，TOTALRNA的使用量为1G，增加模板RNA的使用量有时会使反应性能下降。）RNA
22、1L（浓度为1000MG/L）3RACEADAPTOR（5M）1L5MMLVBUFFER2LDNTPMIXTURE（10MMEACH）1LRNASEINHIBITOR（40U/L）025LREVERSETRANSCRIPTASEMMLV（RNASEH）（200U/L）025LRNASEFREEDH2O45LTOTALVOLUME10L按上述内容在反应仪器中分别依次加入1L（浓度为1000MG/L）RNA，1L3RACEADAPTOR（5M），2L5MMLVBUFFER，1LDNTPMIXTURE（10MMEACH），025LRNASEINHIBITOR（40U/L），025LREVERSETR
23、ANSCRIPTASEMMLV（RNASEH）（200U/L），45LRNASEFREEDH2O，总量为10L。反应结束后可以进行下一步实验或将反应液保存于20冰箱中。这个反应在TECHNEPCR仪TC512中进行，反应条件为42,60MIN70,15MIN（2）套式PCR反应引物的设计根据获得的目标PRX4基因的EST序列，使用PRIMER50软件设计特异性异物PRX4606和PRX4622，分别与TAKARA3FULLRACECORESETVER20试剂盒自带的引物3RACEOUTERPRIMER和3RACEINNERPRIMER进行套式PCR反应。第一轮扩增使用引物PRX4606和3RA
24、CEOUTERPRIMER，得到的PCR产物作为模板进行第二轮扩增，第二轮扩增引物为PRX4622和3RACEINNERPRIMER。引物如下PRX4606CACTATGAATGACTTGCCTGTTGGTPRX4622CCTGTTGGTCGGTCAGTTGATG3RACEOUTERPRIMERTACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3RACEINNERPRIMERCGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG（3）套式PCR反应的OUTERPCR反应体系反应体系反转录反应液35L（25L）1CDNADILUTIONBUFFER65L（510L）GENESPECIFIC
25、OUTERPRIMER（10M）2L3RACEOUTERPRIMER（10M）2L10LAPCRBUFFER（MG2FREE）4LMGCL2（25MM）3LTAKARALATAQ（5U/L）025LDH2O2875LTOTALVOLUME50L10按照上述内容在反应仪器中分别依次加入35L反转录反应液，65L1CDNADILUTIONBUFFER，2LGENESPECIFICOUTERPRIMER（10M），2L3RACEOUTERPRIMER（10M，），4L10LAPCRBUFFER（MG2FREE），3LMGCL2（25MM），025LTAKARALATAQ（5U/L）2875LDH2O
26、，总量为50L。PCR反应结束后取8L产物进行1琼脂糖凝胶电泳检测，电泳后用EB染色10MIN，凝胶成像系统拍胶检测是否有目标片段。反应条件943MIN2030CYCLES9430S2030CYCLES55（3765）30S2030CYCLES721MIN/KBP27210MIN（4）套式PCR反应的INNERPCR反应反应体系1STPCR产物1LDNTPMIXTURE25MMEACH8L10LAPCRBUFFER（MG2FREE）5LMGCL2（25MM）5LTAKARALATAQ（5U/L）05L1CDNADILUTIONBUFFER65L（510L）GENESPECIFICINNERPR
27、IMER（10M）2L3RACEINNTERPRIMER（10M）2L10LAPCRBUFFER（MG2FREE）4LDH2O265LTOTALVOLUME50L按照上述内容在反应仪器中分别加入1L1STPCR产物，8LDNTPMIXTURE25MMEACH，5L10LAPCRBUFFER（MG2FREE），5LMGCL2（25MM），05LTAKARALATAQ（5U/L），65L1CDNADILUTIONBUFFER，2L3RACEINNTERPRIMER（10M），2LGENESPECIFICINNERPRIMER（10M），4L10LAPCRBUFFER（MG2FREE），265LDH
28、2O，总量为50L。PCR反应结束后，取510L的PCR反应产物进行琼脂凝胶电泳，确认是否成功扩增3RACE特异性片段。反应条件943MIN30CYCLES9430S30CYCLES55（3765）30S30CYCLES721MIN/KBP27210MINPCR反应结束后，取510L的PCR反应产物进行琼脂凝胶电泳，确认是否成功扩增3RACE特异性片段。（5）PCR产物的切胶纯化回收111）PCR反应结束后，取510L的PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，分离目的片段，在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减少凝胶体积
29、，提高DNA回收率。切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA损伤。2）切碎胶块，称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1MG1L进行计算。向胶块中加入胶块融化液DRBUFFER，DRBUFFER的加量根据凝胶浓度不同而不同10浓度的加3个凝胶体积量的DRBUFFER；1015浓度的加4个凝胶体积量的DRBUFFER；1520浓度的加5个凝胶体积量的DRBUFFER。3）均匀混合后75加热融化胶块，此时硬不断振荡混合，使胶块充分融化。4）向上述胶块融化液中加入DRBUFFER量的1/2体积量的DRBUFFER，均匀混合。当分离小于400BP的DNA片段时，应在此溶液中加
30、入终浓度为20的异丙醇。5）将试剂盒中的SPINCOLUME安置于COLLECTIONTUBE上。将上述操作4的溶液转移至SPINCOLUME中，12000RPM离心1MIN，弃滤液。6）将500L的RINSEA加入SPINCOLUME中，12000RPM离心30S，弃滤液。7）将700L的RINSEB加入SPINCOLUME中，12000RPM离心30S，弃滤液。8重复操作7）。9）将SPINCOLUME安置于COLLECTIONTUBE上，12000RPM离心1MIN。10）将SPINCOLUME安置于新的15ML的离心管中，在SPINCOLUME膜的中央处加入加热至60的灭菌蒸馏水或EL
31、UTIONBUFFER，室温静置1MIN。11）12000RPM离心1MIN洗脱DNA。224感受态细胞的制备（1）从37培养12H的LB平板上挑取新活化的ECOLIDH5单菌落，接种于100MLLB液体培养基中，37下，220RPM振荡培养36小时，至其OD600为05左右。（2）将培养液转入预冷的50ML离心管中，冰上放置10MIN，使培养物冷却至0，然后于4下3000RPM离心10MIN。（3）弃去上清，倒置1MIN以除去残留培养液。加入预冷的01MOL/L的CACL2溶液10ML轻悬浮细胞，冰上放置1530MIN后，4下3000RPM离心10MIN。（4）弃去上清，加入4ML预冷含15
32、甘油的01MOL/L的CACL2溶液重悬细胞沉淀，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。（5将感受态细胞分装成80L的小份，贮存于70冰箱中冻存。225感受态细胞的连接在200L的PCR管中加入PMD18T载体05LPCR纯化产物45L连接缓冲液（冰中融化）5LPCR仪中16连接过夜226感受态细胞的转化（1）冰中融化的80L感受态细胞ECOLIDH5中加入10L连接产物，冰浴30MIN。（2）将混合物置于42水浴锅中热激90S，取出后置于冰中冰浴2MIN。（3）加入200L含100M氨苄青霉素的LB培养基，37220RPM，恒温摇床中振摇45MIN。（4）将菌液涂布于含100M氨苄青霉素的平板
33、中，37培养过夜。（5）1216H后，检查平板并用菌落PCR法筛选阳性克隆进行测序。123结果与讨论31曼氏无针乌贼总RNA的提取及3RACE扩增曼氏无针乌贼PRX4基因3末端311曼氏无针乌贼总RNA的提取采用大连宝生物的TRIGOLREGANT提取曼氏无针乌贼总RNA经电泳检测可以清晰的看到三条带（见图41），无明显拖带。超微量分光光度计ND2000检测所提取的RNA，260/280结果为192，浓度为15481NG/L。电泳图和所测数据表明曼氏无针乌贼总RNA提取完整性良好，总RNA浓度较高。图31曼氏无针乌贼总RNAFIG31THETOTALRNAOFSEPIELLAMAINDRONI
34、3123RACE扩增曼氏无针乌贼PRX4基因3末端将曼氏无针乌贼PRX4基因的已知EST序列与NCBI上其他物种的PRX4序列进行比较。发现该序列5末端齐全。根据PRX4基因EST序列，设计特异性引物PRX4606和PRX4622，分别与TAKARA3FULLRACECORESETVER20试剂盒自带的引物3RACEOUTTERPRIMER和3RACEINNTERPRIMER进行套式PCR反应。测序结果去载体后获得的片段与原序列有重叠区域，表明该片段与原EST序列属同一基因，拼接后得到全长1023BP的曼氏无针乌贼过氧化物还原酶4基因全长CDNA序列（见图32）1MALVG1GGGGGTTTT
35、TACTTTTTCTATAGACAACGTGGACTGGGAACGAAAATGGCGCTTGTCGGT6VNILCLLVLISSAVCIADEK61GTTAATATTTTATGTCTTCTCGTTTTAATATCGTCTGCAGTTTGCATTGCAGATGAAAAA26CYSFAGGQVYPQEDRKMSGH121TGCTATTCGTTTGCAGGTGGACAAGTTTATCCCCAAGAAGACAGAAAAATGTCTGGACAT1346TIQWSKAIISKPAPDWNGTA181ACAATCCAATGGAGTAAAGCTATAATCTCCAAGCCTGCTCCTGACTGGAATGGC
36、ACGGCC66VINGKFEEIGLRSYKGKYLV241GTTATTAATGGAAAATTTGAAGAGATTGGTCTCCGAAGTTATAAAGGGAAATATCTTGTA86FFFYPLDFTFVCPTEIIAFS301TTCTTCTTTTATCCTCTCGATTTCACTTTTGTCTGCCCAACAGAAATCATTGCATTTAGT106DRIEEFKDLNTKVVACSVDS361GACCGAATTGAAGAATTCAAAGATTTGAACACCAAAGTTGTTGCTTGTTCTGTTGATTCT126QFTHLAWLNTPRNKGGLGHL421CAATTTACTCAT
37、TTGGCTTGGTTAAATACACCAAGAAACAAAGGTGGGTTGGGCCATCTG146KIPLLSDITHEISKAYGVYL481AAAATTCCTCTTTTATCAGACATCACACATGAGATTTCCAAAGCATATGGCGTCTATTTA166QNLGHSLRGLFIIDTKGILR541CAGAATCTAGGACACAGTTTACGTGGCCTCTTTATCATTGATACGAAGGGTATATTGCGG186QITMNDLPVGRSVDETLRLV601CAGATCACTATGAATGACTTGCCTGTTGGTCGGTCAGTTGATGAAACATTGCGT
38、CTTGTT206QAFQYTDSHGEVCPAGWKPG661CAAGCTTTTCAATATACGGACAGCCATGGAGAAGTGTGCCCGGCTGGTTGGAAACCAGGA226ADTIIPDPKDK14LKYFEKANS721GCTGATACGATTATTCCTGATCCTAAAGACAAGTTGAAATATTTTGAAAAAGCCAACAGT246781TAAAAAAGAAAAAAAAAATTCTTTGATAAAATATTGCATTCCTCAGTTCTTGAATTTAAT841TCTTAGTAATGATTTTTTTTTTTAAAAGAATTCTGTGTTAAAACTGCTTTT
39、CATTGCATC901TTAAAACTAACTCTTTTCAAGAACTTTATTCTCTGTTCATCATTTCATTTCAAGTTTTTA961ATAAAAAGAATTGACACACAAAAAAAAAAAACCTATAGTGAAATCACTAGTGGAGGATCC1021GCG图32曼氏无针乌贼PRX4的CDNA全长及推导出的氨基酸序列FIG32TOTALNUCLEARSEQUENCEANDAMINOACIDSOFSMPRX4星号（）表示终止密码子位置，加尾信号（TAAAAA）斜体加粗表示32SMPRX4基因的核苷酸序列分析SMPRX4基因的核苷酸序列见图32。将3RACE得到的去载体核
40、苷酸序列于原EST序列进行拼接后得到PRX4基因的CDNA序列全长为1023BP，5UTR（UNTRANSLATEDREGION，UTR）为45BP，3UTR为243BP，开放阅读框（OPENREADINGFRAMEORF）为735BP，编码245个氨基酸，SMPRX4的预测分子量为273KDA，理论等电点为699。MRNA3端具有多聚腺苷酸加尾信号（POLYADENYLATIONSIGNAL）TAAAAA和POLYA尾巴。33SMPRX4基因的同源性分析和进化分析将SMPRX4序列在NCBI上使用BLAST软件分析发现与血吸虫（BIOMPHALARIAGLABRATA）、人（HOMOSAPI
41、ENS）、金牛（BOSTAURUS）褐家鼠（RATTUSNORVEGICUS）、家鼠（MUSMUSCULUS）等动物的PRX4的同源性都非常高，而与1CYS型和其他2CYS型PRX的相似度较低（见图33）。1516图33SMPRX4多序列比对结果FIG33MUCHSEQUENCEALIGNMENTRESULTOFSMPRX4挑选不同物种的六种类型PRX的氨基酸序列（序列信息见表31），使用MEGA41软件构建PRX分子系统进化树（见图34）。从图中我们可以看到，6种类型的PRX氨基酸序列各自聚成一支，SMPRX4通其他物种的PRX4氨基酸序列聚在一起形成PRX4分支。SMPRX4与血吸虫（BI
42、OMPHALARIAGLABRATA）和人（HOMOSAPIENS）等聚得较拢，与褐家鼠（RATTUSNORVEGICUS）和家鼠（MUSMUSCULUS）聚得较远。17图34PRXS分子系统进化树（所用序列见表31）FIG34THEPHYLIGENETICTREEOFPRXS18表31PRXS系统进化树构建所用序列TABLE31THESEQUENCESOFPHYLIGENETICTREEOFPRXS注册号物种名普通名PRX类型CAM16508MUSMUSCULUS家鼠PRX1NP859048HOMOSAPIENS人PRX1NP005800HOMOSAPIENS人PRX2NM017169RAT
43、TUSNORVEGICUS褐家鼠PRX2AAH60567RATTUSNORVEGICUS褐家鼠PRX3AAH05626MUSMUSCULUS家鼠PRX3CAG29340HOMOSAPIENS人PRX3ACI42880BIOMPHALARIAGLABRATA血吸虫PRX4NP058044MUSMUSCULUS家鼠PRX4CAG46506HOMOSAPIENS人PRX4NM053512RATTUSNORVEGICUS褐家鼠PRX4NM174433BOSTAURUS金牛PRX4AAG13450MUSMUSCULUS家鼠PRX5AAF55497DROSOPHILAMELANOGASTER果蝇PRX5C
44、AG33484HOMOSAPIENS人PRX5DQ779284ICTALURUSPUNCTATUS毛虫PRX6NM007453MUSMUSCULUS家鼠PRX64讨论与总结1941讨论关于PRX4的研究，在哺乳动物中尤其是人类的报道较多，而在头足类中研究较少，本研究利用曼氏无针乌贼CDNA文库EST序列的大规模测定获得目标SMPRX4的EST序列，设计特异性引物结合RACE扩增技术，克隆了SMPRX4的全长的CDNA序列。PRX4蛋白是PRX蛋白家族中的2CYS亚型蛋白，在哺乳动物中的各个组织中都有表达，主要在内质网和细胞质基质中有很高的表达量。抗氧化和自由基清除作用是PRX蛋白家族的基本功能
45、，该家族蛋白均具有将过氧化氢还原为水的能力（章波，2005）。其中2CYSPRX以硫氧化蛋白为电子受体，而1CYSPRX蛋白的电子受体还存在很大的争议性。另外，PRX4还参与血红素的代谢还参与细胞周期进程以及发挥分子伴侣作用。其具有抗氧化性已被越来越多的研究所证实，HYUNPARK（2008）等研究发现对南极帽贝进行热激处理引起氧化应激的实验中，对照组各组织中均检测到PRX4蛋白基因表达，在实验组的肝脏中该蛋白基因显著表达上调。这表明PRX4蛋白基因在热激引起的氧化应激反应中起到保护组织的作用，该蛋白具有抗氧化的功能（HYUNPARKETAL，2008）。这表明PRX4在各种组织形态中都能发挥
46、不同的作用，但是其具体通过什么途径发挥作用还不得而知，通过EST测序得到的CDNA长度我们分析其氨基酸组成及一些特定结构，应该在这个基础上进一步的研究，对PRX4在人体机制产生的作用进行分析。我们都知道乌贼墨汁存在于墨囊中，通过对其进行生物组织学分析由外膜、肌肉层和粘膜组成，墨腺体集中于墨囊底部。在具有分泌黑色素功能的B型细胞中可见黑色素颗粒储存在囊泡中，囊泡在移出细胞的过程中逐渐变大，泡内黑色素逐渐增多。囊泡可能通过胞吐的形式排出细胞外，黑色素排出后以颗粒的形式游离于细胞间隙中，形成墨汁。有关乌贼的墨汁，具有凝血功能，作为一种中药被用于治疗多种妇科疾病，如功能性子宫出血、子宫痉挛和早起虚弱等
47、病症。而乌贼墨汁的主要成分黑色素的生物合成最后一步需要过氧化物酶的催化，我们是否可以通过PRX4在组织体外培养进行表达来判断其起什么作用，又是如何起作用。最后，有关PRX4基因的生物学功能的研究道路还很长，通过不断研究其作用将会开发出来并起到一定的作用。42总结关于PRX4的研究，在哺乳动物中尤其是人类的报道较多。本研究利用曼氏无针乌贼CDNA文库EST序列的大规模测定获得目标SMPRX4的EST序列，设计特异性引物结合RACE扩增技术，克隆了SMPRX4的全长的CDNA序列。SMPRX4的EST序列经过分析发现其5末端具有序列完整性特性，通过3RACE技术获得了SMPRX4基因的CDNA全长
48、，包含1023BP碱基，开放阅读框长度为735BP，编码245个氨基酸，SMPRX4的预测分子量为273KDA，理论等电点为699。3末端具有多聚腺甘酸加尾信号TAAAAA和POLYA尾巴。利用NCBIBLASTP软件的同源性比对结果表明，与血吸虫（BIOMPHALARIAGLABRATA）和人（HOMOSAPIENS）等聚得较拢，与褐家鼠（RATTUSNORVEGICUS）和家鼠（MUSMUSCULUS）聚得较远。首次开展对头足类PRX4基因的研究，为进一步深入研究该基因的功能及其基因家族的进化提供了重要基础；对曼氏无针乌贼PRX4蛋白进行分子生物学分析，为其在各组织中所产生的作用提供了重要
49、基础。20本研究对曼氏无针乌贼PRX4蛋白的CDNA进行了克隆并且进行了简要分析，今后还可以在以下几个方面进行进一步深入研究检测曼氏无针乌贼PRX4基因的体外重组表达蛋白的功能；对曼氏无针乌贼成体各组织中和曼氏无针乌贼胚胎发育过程中SMPRX4酶活性功能的分子生化机制进行研究。参考文献1章波,向渝梅,白云抗氧化蛋白PEROXIREDOXIN家族研究进展J生理科学进展,2004,3543523552RHEESG,KANGSW,CHANGTS,ETALPEROXIREDOXIN,ANOVELFAMILYOFPEROXIDASEJIUBMBLIFE,2001,52235413史河秀,王世鄂2CYSPEROXIREDOXINS的研究进展J解剖学研究,2007,2953803834MIZUSAWAH,ISHII,T,BANNAISPEROXIREDOXINIMACROPHAGE23KDASTRESSPROTEINISHIGHLYANDWI
