1、本科毕业设计（20_届）曼氏无针乌贼凝集素基因关键结构域重组子的构建所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录摘要ABSTRACT1引言511曼氏无针乌贼5111曼氏无针乌贼病害研究现状5112无脊椎动物的免疫防御机制512凝集素6121凝集素的分布与分类6122凝集素的结构6123凝集素的作用72实验材料及仪器821主要化学试剂822仪器设备823实验材料及其处理83实验方法931实验用品的预处理932曼氏无针乌贼总RNA的提取933曼氏无针乌贼CDNA文库的构建934序列分析与目的基因片段的获得935编码凝集素基因成熟肽DNA的扩增和验证10351PCR产物的回收纯化
2、1036感受态细胞的制备、连接及转化11361感受态细胞的制备11362感受态细胞的连接11363感受态细胞的转化1137序列比较与系统进化分析1138重组表达载体的构建1139重组表达载体转化宿主菌134实验结果1441曼氏无针乌贼总RNA的提取1442序列分析与目的片段（EST）的获得1443关键结构域重组子构建1544凝集素基因的同源性分析1545凝集素基因的进化分析1746重组质粒DNA的酶切175讨论与总结19参考文献20致谢错误未定义书签。【摘要】曼氏无针乌贼是我国重要的水产经济动物，近年来养殖规模不断扩大，产量持续增加。随着养殖规模的扩大以及养殖环境的日益恶化而导致了大量疾病的发
3、生，严重制约了曼氏无针乌贼养殖业的健康发展。可见，疾病的控制与预防对曼氏无针乌贼养殖业的可持续发展具有举足轻重的作用。研究表明，曼氏无针乌贼是依靠由细胞免疫和体液免疫构成的固有免疫系统来对病原进行识别和清除的。所以，固有免疫机制的研究有助于推动曼氏无针乌贼病害防治工作的开展。本实验在提取曼氏无针乌贼总RNA的前提下，构建了CDNA文库，并根据凝集素基因EST序列进行了凝集素结构域的预测，129位氨基酸为其信号肽结构，36264位氨基酸为其结构域部分。对所得到的结构域进行重组子的构建，并成功实现了重组载体对大肠杆菌DE3的转化。【关键词】曼氏无针乌贼；固有免疫；凝集素；重组子【ABSTRACT】
4、THECUTTLEFISHSEPIELLAMAINDRONIISONEOFTHEMOSTCOMMERCIALLYIMPORTANTNATIVESPECIESFORAQUACULTUREINDUSTRYINCHINAWITHTHEEXPANSIONOFFARMINGANDTHEFARMINGENVIRONMENTHASLEDTOTHEDETERIORATIONOFALARGENUMBEROFDISEASES,SEVERELYRESTRICTEDTHESQUIDMANNEEDLEHEALTHYDEVELOPMENTOFAQUACULTUREVISIBLE,DISEASECONTROLANDPREV
5、ENTIONOFNEEDLEFREESQUIDMANTHESUSTAINABLEDEVELOPMENTOFAQUACULTUREPLAYSANIMPORTANTROLERESEARCHSHOWSTHATCUTTLEFISHMANNEEDLEISTORELYONTHECELLULARANDHUMORALIMMUNITYTOTHEINNATEIMMUNESYSTEMCONSISTINGOFTHEIDENTIFICATIONANDREMOVALOFPATHOGENSTHEREFORE,MECHANISMSOFINNATEIMMUNITYMANSONIHELPTOPROMOTEDISEASEPREVE
6、NTIONANDTREATMENTWITHOUTNEEDLESSQUIDWORKINTHEPRESENTSTUDY,LECTINDOMAINWASPREDICTEDACCORDINGTOLECTINGENEESTSEQUENCES,129AMINOACIDSTRUCTUREISITSSIGNALPEPTIDEANDAMINOACIDS36264PARTISITSDOMAINTHECONSTRUCTIONOFRECOMBINANTWASWORKEDOUTONTHEBASISOFTHEDOMAINANDFINALYTOACHIEVETHETRANSFORMATIONOFTHERECOMBINANT
7、VECTORINECOLI【KEYWORDS】SEPIELLAMANDRONI；INNATEIMMUNE；LECTIN；RECOMBINANT51引言11曼氏无针乌贼曼氏无针乌贼（SEPIELLAMAINDRONI），俗名花粒子、麻乌贼、血墨。隶属于软体动物门、头足纲、十腕目、乌贼科（唐逸民等，1991）。曼氏无针乌贼生殖群体密集，年产量45万吨（2007中国渔业统计年鉴），主要渔场在中国的浙江近海和福建东北近海（唐逸民，吴常文等，1986）。干制品称“螟蜅鲞”或“南鲞”为海味佳品，是海味市场的重要品种，经济价值巨大。随着曼氏无针乌贼人工养殖的迅猛发展，其病害日趋严重，尤其是细菌性与病毒性疾病
8、的频繁爆发。严重影响了曼氏无针乌贼的养殖效益。因此，疾病预防和控制对曼氏无针乌贼养殖业的可持续发展具有举足轻重的作用。111曼氏无针乌贼病害研究现状外界病原体、环境和寄主本身三方面相互作用往往是疾病发生的根源（张寿山，华鼎可等，1974）。所以解决病害问题，需要从提高养殖品种本身的抗逆性、改善养殖生态环境及控制病原侵袭三方面入手。而宿主本身的抗性决定了环境变化或者病原的入侵能否导致疾病的发生（MYDLARZLD等，2006）。因此，培育抗逆性强的优质种苗在疾病预防方面显得特别重要。其中，增强曼氏无针乌贼的抗逆性、解决种质问题的主要手段是开展遗传育种学的研究和应用。但是传统的遗传选育需要较长时间
9、进行优良性状分离，并建立高品质的家系。而从分子水平研究控制曼氏无针乌贼优良性状的基因类型无疑将会极大推动遗传选育工作的开展。因此，从分子水平开展免疫学研究，了解曼氏无针乌贼的免疫防御机制，将为曼氏无针乌贼抗病品系的培育及健康养殖提供理论基础。112无脊椎动物的免疫防御机制免疫系统分为固有免疫和获得性免疫（LEESY等，2002）。是动物在漫长的进化过程中为了抵抗外来物质的入侵而形成的。“自己”与“非己”的识别是免疫系统的基本功能。获得性免疫是脊椎动物特有的免疫方式，能够选择性地进行病原识别和清除，因此也被称为适应性免疫或者特异性免疫（陈政良，朱锡华等2000）。获得性免疫是个体在生命过程中，受
10、病原微生物及其代谢产物中的抗原性物质刺激后主动产生或接受免疫效应因子后被动获得的（BEUTLERB等，2004）。固有免疫是一种古老的免疫防御方式，在所有的多细胞动物中都有发现，是一种先天免疫形式。固有免疫是最普遍、反应速度最快的，甚至被认为是最重要的免疫类型（BEUTLERB等，2004）。固有免疫包括机体对病原感染的感知（识别）以及机体对入侵病原的清除两个方面（BEUTLERB等，2004）。所以，描述固有免疫应答的有效性包括三个基本方面首先机体识别“自我”和“非我”；其次，机体通过防御反应将入侵者杀死或者使其失去致病力；最后，机体识别并能清除自己的受损害的或者病态的细胞。这要求固有免疫必
11、须具备三种组成（MYDLARZLD等，2006）细胞介导的吞噬；体液反应激活引起的调理作用、黑化和凝结；体液的抗菌物质。对入侵物的识别或感知是免疫防御的起始，将最终引发效应物反应系统，6包括吞噬作用、包被（掩）作用、激活蛋白酶级联反应和黑化作用以及抗菌肽的合成等，从而清除或消灭入侵物。这些反应机制传统上被分为细胞免疫和体液免疫（HOFFMANNJA等，1999），实际上细胞免疫和体液免疫两者是密切相关的，如体液因子可在血淋巴细胞中合成并释放出来，而细胞反应又受体液因子的介导和影响（徐海圣，徐步进等，2001）。12凝集素凝集素是一类具有糖结合专一性，可促使细胞凝集的蛋白质。广泛分布于植物、动物
12、和微生物中。近年来凝集素研究发展迅速，凝集素对糖的特异结合性以及凝集素在不同生物或同一生物不同组织中的分布多样性决定了它在动植物以及微生物体内有重要而特殊的生物学功能。它们在科学的多个领域中均有重要应用价值。不同来源凝集素的特点、分布及作用机制各不相同。凝集素有促有丝分裂、细胞识别、抗虫、抗病毒等诸多方面的作用。在生物养殖、生物工程、生理活动调控、疾病防治等方面展示出广阔的应用前景。121凝集素的分布与分类凝集素（LECTIN）首先是从豆科植物种子中发现的，后来其来源扩展到根、茎、叶各个部份，进而扩展到非豆科植物、动物、微生物，包括真核生物、原核生物、单细胞生物、多细胞生物，几乎无处不在（SH
13、ARONN等，1993）。已发现的微生物凝集素一般分布在体表，胞质中少见。PSEUDOMONASAERUGINOSA是原核生物中仅知的分布于胞质内的凝集素（GARBERN等，1992）。对于凝集素通常有3种分类法（1）根据其在细胞中存在的部位分可溶性和膜结合两类，前者主要存在于胞浆，核质中也有；（2）根据单糖对凝集素活性的抑制作用来研究凝集素的糖结合专一性，以此可分为6类（郭锰等，1990）与D甘露糖或D葡萄糖结合；与2乙酰氨基2脱氧D葡萄糖结合；与2乙酰氨基2脱氧D半乳糖结合；与D乳糖结合；与L岩藻糖结合；与唾液酸结合；（3）根据其来源分，这是人们较为习惯和常用的分类法，此法将凝集素分为植物
14、包括细菌、真菌等微生物凝集素和动物凝集素，也有称前者为外源性凝集素，后者为内源性凝集素（张世明，崔贞福，吴孟超等，1991）。122凝集素的结构凝集素是一类专一识别糖并与之非共价、可逆地结合的蛋白质或糖蛋白。凝集素的生物学作用，主要是由凝集素对糖的专一识别发生的，而凝集素与糖的结合是通过其分子肽链中的活性部位，即专一结合糖的区域实现的，与凝集素分子中共价结合的糖无关（陈惠黎等，1997）。现有的研究资料表明，虽然来源各异的凝集素在结构上确有不同，但一些同源家族的凝集素却具有一些共同的结构性质，这正是凝集素最新分类法的基础。构成凝集素的蛋白质和糖两个部分，蛋白质占的百分比大，糖的含量较少（曾麒燕
15、，周德义等，2001）。一般都是几个单糖构成寡糖链，寡糖链再以两类方式与蛋白质肽链相连。一类糖链与肽链通过GLCNAC1ASN连接，称血清型糖蛋白，亦称天冬酰胺ASN连接或N连接的糖蛋白；另一类糖链与肽链由GALNAC1SER/THR连接为粘蛋白型糖蛋白，亦称O连接糖蛋白（孙册等，1994）。N连接的糖蛋白合成过程是以长萜醇DOLICHO1作为糖链载体，在糖基转移酶的作用下，先将UDPGLCNAC分子中GLCNAC转移至长萜醇，然后再逐个加上糖基，形成N连接寡糖链。此寡糖链再作为一个整体和天冬酰胺残基的酰胺氮连结；而O连接糖蛋白合成过程中不需要糖链载体，只在GALNAC转移酶作用下，将UDPG
16、ALNAC中GALNAC基转移至多肽7链的丝氨酸或苏氨酸的羟基上，形成O连接寡糖（胡业华等，2001）。123凝集素的作用动物凝集素包括C型和S型，以膜整合及水溶性的形式存在，通过与体液中的糖配体如某些激素、细胞因子、生长调节因子等或细胞表面的糖配体相互作用，进行识别与结合来对细胞产生信号作用，引发细胞产生一系列反应，参与动物体的进化、内环境的稳定以及机体防御等功能（周柔丽等，1995）。动物凝集素在无脊椎动物的免疫识别中具有重要作用。如贝类只有细胞免疫而无体液免疫，血细胞表面的凝集素是它们识别异己的因子。这些细胞借助凝集素的作用，对病原体加以识别，并具有化学趋化性使之向病原体移动，伴随着吸附
17、作用最终将病原体吞噬（时丽冉，2001）。研究表明，鱼类凝集素通过有效地识别和结合异己物质，提高吞噬细胞对异己物质的吞噬、杀灭作用。可作为防止外来微生物等入侵鱼体的一道防线。对植物凝集素的专一性研究表明，外源多糖可能是许多植物凝集素最可能的受体，外源多糖包括真菌或植物病毒表面、昆虫或草食动物肠道细胞表面的糖蛋白（李润植，高武军，季道藩等，2000）。基于凝集素和糖的相互作用，植物凝集素被认为和糖的运输、储存物质的积累、细胞间的互作以及细胞分裂的调控等有关（黄炳球，侯学文等，2002）。植物凝集素可抵御细菌、真菌、病毒等病原体的入侵，具有杀虫作用。自然界中凝集素介导的防御反应主要以两种方式进行一
18、种是通过直接作用来抵御摄食者的入侵；另一种是植物凝集素对病毒、细菌和真菌的间接作用方式（刘勇，倪汉祥等，2000）。而决定它们抗性的就是它们的糖结合活性，即通过识别并结合入侵者上的糖结构，来参与抵抗植物病原和摄食者（杨晓泉等，2001）。凝集素对微生物来说是与寄主发生关系的决定因素。目前发现的微生物凝集素大多通过其壁上凝集素对糖基的识别来实现对宿主的感染，所以它们往往在吸附作用中发挥重要作用（SHARONN等，1987）。微生物凝集素与其他生物凝集素一样，它们可与细胞膜表面的单糖或寡糖进行专一性的结合，以识别外来的各种信息。微生物凝集素正是通过这种专一性来识别寄主细胞膜上的糖链，与寄主发生关系
19、。如不具有细胞壁凝集素的细菌突变株失去致病力（SHARONN等，1990）。细菌凝集素的抑制剂可以降低细菌的侵染几率。类似的，真菌和病毒的凝集素也与糖复合物结合有关。流感病毒可以与末端是唾液酸的受体结合，用唾液酸酶来处理受体细胞可以使其对流感产生抗性。同时，一些细菌的凝集素参与吞噬作用，这具有重要的临床价值和研究意义。有研究表明，微生物凝集素还具有贮存蛋白的功能，这些凝集素多分布在微生物体的胞质内（STEFENROSEN等，1997）。82实验材料及仪器21主要化学试剂TRIZOL购自INVITROGEN公司；MMLV和RQ1DNASEI购自PROMEGA公司；TAQDNA聚合酶、核酸MARK
20、ER、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物克隆载体体系PMD18TVECTOR购自TAKARA公司；质粒提取试剂盒购自OMEGA公司；其他常规试剂购自上海生工生物工程公司；各种常见菌株为本实验室保存。22仪器设备凝胶分析系统PHARMACIABIOTECH，IMAGEMASTERVDSPCR仪MJRESEARCH，PTC100紫外可见分光光度计BECKMANDU650凝胶电泳系统BIORAD，WIDEMINISUBTMCELL高速冷冻离心机HERAEUS，BIOFUGE28RS微量离心机SIGMA，113超低温冰箱SANYOMDF382E电泳仪JIMX恒温水浴锅DK8D超净工作台YJ
21、电热恒温干燥箱DHG9023A电热恒温培养箱DHP9052普通冰箱ELECTROLUXBCD247E制冰机SCOTSMANFRIMONT高压灭菌锅LDZX50KB微量可调移液器EPPENDORF23实验材料及其处理所购买的曼氏无针乌贼在232暂养一周，然后进行实验。抽取胰脏1ML，加入等体积抗凝剂（RODRIGUEZJ等，1995），然后42000G离心5MIN，收集胰脏细胞供后续RNA提取用。93实验方法31实验用品的预处理塑料制品使用一次性无RNASE塑料制品。对国产塑料制品，用01DEPC水浸泡处理过夜，高压蒸汽灭菌30MIN。将灭菌的塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。玻璃器皿用铝箔包裹后
22、180烘烤4H备用（母昌考，2009）。32曼氏无针乌贼总RNA的提取1）分离相将备用样品从超低温冰箱中取出，室温融化。每1MLTRIZOL加入200L氯仿。剧烈摇动15S，然后在1530环境中放置5MIN。4条件下12000G离心15MIN。离心后，混合物分为淡红色的酚仿相、中间相和无色的上层水相。RNA存在于水相中。2）RNA沉淀将水相移至EPPENDORF管中，加入等体积异丙醇，缓慢混匀。样品在1530条件下放置5MIN，以12000G4离心10MIN。3）RNA洗涤弃上清。加1ML75的乙醇悬浮样品，7500G4离心5MIN，重复一次。4）RNA溶解小心去掉上清，室温干燥，加入无RNA
23、SE水溶解RNA。5）RNA产率和质量鉴定用双蒸水稀释RNA，于紫外分光光度计检测A280、A260的相对吸收值。RNA产率通过测定样品在A260下的紫外吸收值获得，RNA浓度（G/ML）A260稀释倍数37G/ML，1个单位大约相当于40G单链RNA/ML。纯净RNA的A260/A280在1822之间。同时采用电泳检查RNA的完整性（母昌考，2009）。33曼氏无针乌贼CDNA文库的构建利用INVITROGEN公司的TRIZOL试剂从曼氏无针乌贼血淋巴细胞中提取总RNA，按照ZAPCDNASYNTHESISKIT及ZAPCDNAGIGAPACKIIIGOLDCLONINGKIT（STRATA
24、GENE）试剂盒使用说明书分离纯化MRNA，合成第一链、第二链，补平CDNA末端，连接ECOR接头并磷酸化，XHO限制酶消化，获得了两端具有不同粘性末端的完全单向CDNA。将该CDNA片段插入UNIZAPXRVECTOR（LAMBDAPHAGE，INVETROGEN）。经包装，滴度测定和扩增，利用EXASSISTHELPERPHAGE和SOLR菌株从UNIZAPXRVECTOR上体外切割PBLUESCRIPT噬菌粒，大规模提取质粒DNA，最后进行PCR测序（母昌考，2009）。34序列分析与目的基因片段的获得曼氏无针乌贼CDNA文库EST序列的大规模测定文库中筛选阳性克隆，使用载体通用引物T3
25、在MEGABACE1000测序仪上进行序列测定，将得到的原始峰图文件（ABI，ABD文件）数据经PHRED程序处理转化为序列文件（SEQ）和质量文件（SEQQUAL），依据质量文件提供的数值确定获得序列的误差概率，去除低质量的碱基，用CROSSMACH程序屏蔽数据中的载体序列，从得到的数据中选取连续碱基质量大于Q13（准确率大于95）且长度大于100BP的序列作为EST数据，具体参见基因表达序列标签（EST）数据分析手册（胡松年，2005）。将获得的全部有效的EST数据进行聚类拼接，生成CONTIGS和SINGLETONS，10分别将所获的CONTIGS与SINGLETONS在数据库中进行BL
26、ASTN和BLASTX分析，根据相似性分析结果分别找出凝集素基因同源的EST序列（母昌考，2009）。35编码凝集素基因成熟肽DNA的扩增和验证根据所得到的凝集素基因的EST序列（不含NDE和XHO的酶切位点）和表达载体PET21（）的序列特征（图31），设计特异性引物CB1（含有NDE酶切位点）和CB2（含有XHO酶切位点），以曼氏无针乌贼EST序列为模板，扩增编码凝集素蛋白的基因片段。PCR反应程序为94变性5MIN，1个循环；94变性30S，60退火30S，72延伸45S，35个循环；72延伸10MIN，1个循环。PCR产物在10的琼脂糖凝胶中进行电泳，经过凝胶成像系统观察照相后切下特异
27、性目的条带，用DNA凝胶回收试剂盒纯化目的片段，连入PMD18T载体，转化TOP10F感受态细胞，然后通过PCR（使用特异性引物）筛选阳性克隆并进行测序。引物如下CB1CATATGCTGAGGTTCGAATACAAGCTCA（划线部分表示NDE）CB2CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAGGGGGCGTGCATGGAATGAGT（划线部分表示XHO）图31表达载体PET21（）的多克隆位点区（NOVAGEN技术手册）351PCR产物的回收纯化1）PCR反应结束后，用10琼脂糖凝胶（含EB05G/ML）电泳分离目的片段，在紫外灯下将目的DNA片段切下，放入离心管中，称重；
28、2）每100MG凝胶加入300L溶液I，65水浴10MIN，使凝胶完全溶化；3）将上述溶液转入收集管吸附柱内，室温放置2MIN后10000G离心1MIN；4）倒掉收集管中废液，在吸附柱内加入500L溶液II，于10000G离心1MIN；5）重复上一步，将吸附柱放入同一个收集管中，空柱12000G离心2MIN；6）将吸附柱放入15ML离心管中，在吸附柱中央加入30L洗脱缓冲液进行洗脱，室温放置2MIN，12000G离心1MIN回收纯化的DNA片段。（母昌考，2009）1136感受态细胞的制备、连接及转化361感受态细胞的制备1）从37培养1218H的TOP10F菌株的新鲜平板上挑取单菌落，接种到
29、一个含有100MLLB培养基的1000ML烧瓶中。于37条件下，220RPM振荡培养36H。每隔2030MIN测量OD600值来检测生长情况。2）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ML聚丙烯管（FALCON2070）中，在冰上放置10MIN，使培养物冷却至0。以下步骤均在无菌操作条件下完成。3）于42000G离心10MIN，弃上清。4）将管倒置1MIN以去除残留培养液。5）用10ML冰预冷的01MCACL2重悬沉淀，放置于冰上。6）于4用SORVALLGS3转头（或与其相当的转头）以2000G离心10MIN，以回收细胞。7）倒出培养液，将管倒置1MIN以去除残留培养
30、基。8）每50ML初始培养物用2ML冰预冷的01MCACL2重悬细胞沉淀，加入终浓度为15的甘油。将细胞分装成小份（80L/份），于70冻存（母昌考，2009）。362感受态细胞的连接在200L的PCR管中加入载体05L，PCR纯化产物45L，连接缓冲液（在冰中融化）5L，16连接过夜（母昌考，2009）。363感受态细胞的转化1）在融化的80L感受态细胞中加入10L连接产物，冰浴30MIN；2）将此混合物于42水浴热激90S，冰浴2MIN；3）加入200LSOB液体培养基，于37，220RPM，振摇45MIN；4）将菌液涂布于含100G/ML氨苄青霉素的平板上，37培养过夜；5）1016H后
31、，检查平板并用PCR法筛选阳性克隆送测序。（母昌考，2009）37序列比较与系统进化分析对所得到的DNA片段用VECTORNTISUITE8软件进行拼接；利用PRIMER5软件进行序列翻译，信号肽查找用SINGALP（NIELSENH等，1997）软件；。采用BLASTP（ALTSCHULSF等，1997）软件将曼氏无针乌贼乌贼凝集素基因编码的氨基酸序列与NCBI上已知的氨基酸序列进行初步的比较，寻找同源蛋白序列。所得的同源蛋白序列用CLUSTALW（THOMPSONJD等，1997）程序进行比较，同时运用MEGA41软件包（KUMARS等，2004）的NEIGHBORJOINING法进行进化
32、树构建。38重组表达载体的构建经过测序验证后，按照质粒提取试剂盒的操作说明书提取质粒，具体操作如下1）从新划线培养的平板上挑取单克隆接种到5ML新鲜的含卡那霉素（L00G/ML）的LB培养基，37条件下300RPM振荡培养1216H；2）室温10000G离心1MIN收集细菌沉淀；与此同时，在吸附柱内加入100L平衡12BUFFER，13000G离心1MIN，弃液体；3）加入250LSOLUTION（含RNASEA），旋涡混合使细胞完全悬浮；4）加入250LSOLUTION，上下颠倒使液体混合（轻柔地操作）2MIN；5）立即加入350LSOLUTION，上下颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀；6）室
33、温13000G离心10MIN，小心吸取上清转入HIBINDDNA吸附柱；7）室温13000G离心1MIN，使液体全部流出；8）加入500LBUFFERHB，室温13000G离心1MIN；9）弃液体，加入700LDNAWASHBUFFER，室温13000G离心1MIN；重复操作一次；10）空管在室温13000G离心空管2MIN，以去除液体；11）把柱子置于15MLEPPENDORF管上，往柱内填料上加入50LELUTIONBUFFER。室温放置2MIN后，13000G离心洗脱质粒。质粒提取完成后，进行NDE和XHO双酶切，酶切体系为NDE10LXHO10LNEBUFFER450LBSA05L待切
34、质粒425L37水浴酶切过夜。酶切完成后，用琼脂糖凝胶电泳检查酶切是否完全，然后用凝胶回收试剂盒进行纯化。最后将得到的目的产物与经双酶切后纯化的PET21（A）质粒进行连接。连接体系为10L，包含目标片段375L，PET21（A）载体125L，连接缓冲液（含T4噬菌体DNA连接酶）5L。该反应体系在16连接过夜。将连接产物转化TOP10F感受态，挑取单克隆通过PCR（特异性引物）进行阳性克隆筛选。反应体系10PCRBUFFER25LDNTPMIXTURE25L菌液1L特异性引物CB11L特异性引物CB21LRTAQ02LDDH2O158L总体系25L反应条件943MIN9430S6030S72
35、1MIN13进行35个循环7210MIN39重组表达载体转化宿主菌PCR法筛选得到的阳性克隆进行测序。测序确定读码框正确后，用OMEGA质粒提取试剂盒提取质粒，取3L质粒转化表达宿主菌DE3感受态，过夜培养。然后挑选阳性克隆，用特异性引物进行菌落PCR筛选。然后进行测序确认。144实验结果41曼氏无针乌贼总RNA的提取采用大连宝生物的TRIZOLREGANT提取曼氏无针乌贼总RNA经电泳检测可以清晰地看到5S、18S和28S三条带（如图41由下而上），无明显拖带。超微量分光光度计检测所提取的RNA，260/280值为191，浓度为1533NG/L。综上表明曼氏无针乌贼总RNA提取完整性良好，总
36、RNA浓度较高。图41曼氏无针乌贼总RNA42序列分析与目的片段（EST）的获得凝集素基因EST序列GGGGGTATTTGCATTCTTGCACCAGTCAAAATGGCTGTCGTAGCGATACGCTGGTGTCCAGCTGTCCTCTTCTCAGCGGTTTTTATTCTGGTACTGTTGTCTAACATTGTTATCTGCTCGTCCACGGCACCCTGGCTGAGGTTCGAATACAAGCTCAGCTTTAAAGGCCCACACTTAACCCAAAAGGATAAGGGAATCCCATTCTGGGAACACGGAGGAGATGCTATAGCTGGAGATGACAATGTTCGAA
37、TCACACCTTCCCTGAGAAGTAAGAAGGGTTGGGTGTGGAGTAAAAACTCTGTTCCACATGACAACTGGGTAATTGAAGTGACCTTTAGAGTAACTGGTCGGGGTCGTGTAGGGGCTGATGGCTTGGCCATTTGGTACACACAACAGAAAGGTGTTGAGGGTCCAGTTTTTGGCAGCAATGACAAATGGAATGGCCTGGGTATCTTTTTTGATTCCTTTGACAATGATGCTCAGCGTAACAATCCCTACATTCTGGTTATGCTAAACAATGGAACTAGAGAATATGATCACATGAACGATG
38、GTCATGACCAGCAGCTTGGTGGCTGTTTGCGGGATTTCAGAAATAAACCTTTTCCACTCCATGCCAAAATTGAATACTACAAGAATGCTCTCACTCTTTTTATCCACAATGGTATGTCAAATAGTCAAGAATATGAACTGTGTATGCGGACGGAAAGTGTACAGCTTCCTAAGAATGGCTTCTTTGGCATCACTGCTGCAACTGGAGGATTGGCAGATGACCATGATGTCCTTTGCTTTTATGACTCATTCCATGCACGCCCCCTGCTGACCAGTTGGCTGCTGATCCTAAAGTATCAGA
39、TGACG28S18S5S15氨基酸序列MAVVAIRWCPAVLFSAVFILVLLSNIVICSSTAPWLRFEYKLSFKGPHLTQKDKGIPFWEHGGDAIAGDDNVRITPSLRSKKGWVWSKNSVPHDNWVIEVTFRVTGRGRVGADGLAIWYTQQKGVEGPVFGSNDKWNGLGIFFDSFDNDAQRNNPYILVMLNNGTREYDHMNDGHDQQLGGCLRDFRNKPFPLHAKIEYYKNALTLFIHNGMSNSQEYELCMRTESVQLPKNGFFGITAATGGLADDHDVLCFYDSFHARPLLTSWLLILKYQMT129信号
40、肽，36264结构域。43关键结构域重组子构建重组子序列CATATGCTGAGGTTCGAATACAAGCTCAGCTTTAAAGGCCCACACTTAACCCAAAAGGATAAGGGAATCCCATTCTGGGAACACGGAGGAGATGCTATAGCTGGAGATGACAATGTTCGAATCACACCTTCCCTGAGAAGTAAGAAGGGTTGGGTGTGGAGTAAAAACTCTGTTCCACATGACAACTGGGTAATTGAAGTGACCTTTAGAGTAACTGGTCGGGGTCGTGTAGGGGCTGATGGCTTGGCCATTTGGTACACACAACAGAAAGG
41、TGTTGAGGGTCCAGTTTTTGGCAGCAATGACAAATGGAATGGCCTGGGTATCTTTTTTGATTCCTTTGACAATGATGCTCAGCGTAACAATCCCTACATTCTGGTTATGCTAAACAATGGAACTAGAGAATATGATCACATGAACGATGGTCATGACCAGCAGCTTGGTGGCTGTTTGCGGGATTTCAGAAATAAACCTTTTCCACTCCATGCCAAAATTGAATACTACAAGAATGCTCTCACTCTTTTTATCCACAATGGTATGTCAAATAGTCAAGAATATGAACTGTGTATGCGGAC
42、GGAAAGTGTACAGCTTCCTAAGAATGGCTTCTTTGGCATCACTGCTGCAACTGGAGGATTGGCAGATGACCATGATGTCCTTTGCTTTTATGACTCATTCCATGCACGCCCCCTGCTGACCCACCACCACCACCACCACTAACTCGAG44凝集素基因的同源性分析将凝集素基因序列在NCBI上使用BLASTP软件分析发现，曼氏无针乌贼凝集素基因与其他物种的凝集素基因同源性很低（如图42）。PLUNATUSMASSKFCTVLSLALFLVLLTHANSAELFSF30VCYLINDRICAMASSTVSVVLSLFLLLLTQAYSADI
43、QSF28VFABAMASLQTQMISFYAIFLSILLTTILFFKVNSTGEITSF37HSP0GNIVALISMAKASLLILAAIFLGVITPS2016SMAINDRONIGGICILAPVKMAVVAIRWCPAVLFSAVFILVLLSNIVICS40IPLUNATUSNFQTFNAANLILQGNASVSSSGQLRLTEVKSNGEPK66VCYLINDRICASFKNFNSSSFILQGDATVSSSKLRLTKVKGNGLPT63VFABASIPKFRPDQPNLIFQGGGYTTKEKLTLTKAVK69HSPMQQDCN6GNIVALISCLSDNILYSGE
44、TLSTGEFLNYGSFVFIMQEDCN53SMAINDRONISTAPWLRFEYKLSFKGPHLTQKDKGIPFWEHGGDAIAGDD80IPLUNATUSVASLGRAFYSAPIQIWDSTTGKVASFATAFTFNILAPILS106VCYLINDRICALSSLGRAFYSSPIQIYDKSTGAVASWATSFTANIFAPNKS103VFABASTVGRALYSLPIHIWDSETGNVADFETTFILVIDAPNGY108HSPLVLYDVDKPIWASNTG22GNIVALISLVLYDVDKPIWATNTG69SMAINDRONINVRITPSLRSKKGW
45、VWSKNSVPHDNWVIEVTFRVTGRGRV120IPLUNATUSNSADGLAFALVPVGSQPKFNGGFLGLFQNVTYDPTAQTVA146VCYLINDRICASSADGIAFALVPVGSEPKSNSGFLGVFDSDVYDNSAQTVA143VFABANVADGFTFFIAPVDTKPQTGGGYLGVFNGKDYDKTAQTVA148HSPGLARDCHLNMQSDGNL38GNIVALISGLSRSCFLSMQTDGNL85SMAINDRONIGADGLAIWYTQQKGVEGPVFGSNDKWNGLGIFFDSFDNDA160IPLUNATUSVEFDTCHN
46、LDWDPKGSHIGIDVNSIKSIKTVPWSLLNG184VCYLINDRICAVEFDTFSNTDWDPTSRHIGIDVNSIKSIRTASWGLANG181VFABAVEFDTFYNAAWDPSNGKRHIGIDVNCIKSISTKSWNLQNA188HSPVVYAPRNQVIWASNTQGENGNYVCILQKDRNVVIYG74GNIVALISVVYNPSNKPIWASNTGGQNGNYVCILQKDRNVVIYG121SMAINDRONIQRNNPYILVMLNNGTREYDHMNDGHDQQLGGCLRDFRNKP200IPLUNATUSHNAKVLITYDSSTKLLV
47、ASLVYPSGSTSYIISEKV219VCYLINDRICAQNAEILITYNAATSLLVASLVHPSRRTSYIVSERV216VFABAEEAHVAISFNATTNLLSVTLLYPNSLEEENLTGYTLSEVV228HSPTARWATGTNIHGAGIVGVPGSAPQNTTAEMI10517GNIVALISTDRWATGTHTGLVGIPASPPSEKYPTAGKI151SMAINDRONIFPLHAKIEYYKNALTLFIHNGMSNSQEYEL230IPLUNATUSELKSVLPEWVNIGFSATSGLNKGNVETHDVLSWSFASKLS259VCYLIND
48、RICADITNELPEYVSIGFSATTGFFEGYTETHDVLSWSFASKLP256VFABAPLKDVVPEWVRIGFSATTGAEYATHEVLSRTFLSELT265HSPKLVRKYLITK115GNIVALISKLVTAK157SMAINDRONICMRTESVQLPKNGFFGITAATGGLADDHDVLCFYDSFHAR270IPLUNATUSDGTPCEDLGLANIVLNQIL278VCYLINDRICADDSTTEPLDIASYLVRNVL275VFABAGPSSSKQAADA276HSP115GNIVALIS157SMAINDRONIPLLTSWLLILKY
49、QMT285I图42凝集素多序列比对结果45凝集素基因的进化分析挑选不同物种的6种类型的凝集素的氨基酸序列，使用MEGA41软件构建系统进化树（见图43）。从图中可以看到，6种类型的凝集素氨基酸序列各自聚成一支，曼氏无针乌贼单独形成分支。PLUNATUSVCYLINDRICAVFABAHSPGNIVALISSMAINDRONI图43凝集素分子系统进化树46重组质粒DNA的酶切重组质粒经限制性内切酶XHOI和NDEI进行双酶切。切后出现大约为25KB的DNA片段和30KB的载体，符合预期大小（如图44）。表明酶切下的凝集素基因已按正确方向插入表达载体中。18图44重组质粒双酶切图45重组质粒酶切前后对照（1,2,3为酶切前，4,5为酶切后）195讨论与总结固有免疫是无脊椎动物最重要的免疫机制，而凝集素作为固有免疫的重要组成部分更是发挥着重要作用。本实验通过PCR方法，设计特异性引物CB1和CB2将曼氏无针乌贼编码区与原核表达载体PET21（）连接成功构建表达载体，表达载体转化表达菌株大肠杆菌DE3（由实验室保存），经公司测序鉴定后进行诱导表达。实验数据表明凝集素基因在
