1、本科毕业设计（20_届）梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B克隆和序列分析所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录摘要（ABSTRACT）1引言12材料和方法121材料1211原料与试剂1212主要仪器2213主要试剂及其配制222方法3221实验动物3222总RNA提取3223构建寄生虫CDNA文库构建3224CDNA第一链的合成3225CDNA第二链的合成4226适配体连接ADAPTORLIGATION4227限制酶XHOI酶切反应5228使用SPINCOLUMN除去短链CDNA5229短链CDNA的除去52210连接到特定质粒载体62211质粒转化62212随机测序722
2、13生物信息学分析73结果与分析731生物信息学分析7311同源性及ORF分析分析7312分子量、等电点、信号肽、及电荷分布分析7313功能域分析9314二级结构分析9316胞内定位及疏水性分析932氨基酸多序列比对1033进化树构建124讨论13参考文献15致谢错误未定义书签。2摘要组织蛋白酶B（CATHEPSINB，CB）为半胱氨酸蛋白酶，具有广谱的蛋白水解活性，从而破坏一系列组织屏障。目的本研究旨在为梅氏新贝尼登虫病的预防和治疗提供科学理论依据。方法通过序列克隆和分析，鉴定梅氏新贝尼登组织蛋白酶B序列特征及进化关系。结果梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B基因的CDNA序列全长1056个核苷酸，最
3、大开放阅读框编码一个352个氨基酸的蛋白，分子量394KDA，等电点为586，含有一个肽酶C1A结构域。系统进化树分析均表明梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B与广州管圆线虫（ANGIOSTRONGYLUSCANTONENSIS最近。关键词组织蛋白酶B；梅氏新贝尼登虫；序列分析；进化树ABSTRACTCATHEPSINBISACYSTEINEPROTEASESANDHASAWIDEPROTEOLYSISACTIVITY,THEREFOREITCANDECOMPOSETISSUEBARRIERAIMTHEPURPOSEOFTHISSTUDYISTOAFFORDTHEORETICALBASISFORPREV
4、ENTIONANDCUREOFNEOBENEDENIAMELLENIDISEASEMETHODSCLONINGANDSEQUENCEANALYSISOFCATHEPSINBWASEMPLOYEDTOIDENTIFYTHESEQUENCEFEATUREANDEVOLUTIONARYRELATIONSHIPOFCATHEPSINBOFNEOBENEDENIAMELLENIRESULTTHECDNASEQUENCEOFCATHEPSINBOFNEOBENEDENIAMELLENIHAS1056NUCLEOTIDESCATHEPSINBCONTAINS352AMINOACIDS,THEMOLECULA
5、RWEIGHTOFITIS394KDA,ISOELECTRICPOINTIS586,APEPTIDASEC1ADOMAINISINTHEMOLECULEPHYLOGENETICTREEANALYSISREVEALSTHATCATHEPSINBOFNEOBENEDENIAMELLENIISCLOSERTOTRICHOBILHARZIAKEYWORDSCATHEPSINBNEOBENEDENIAMELLENISEQUENCEANALYSISPHYLOGENETICTREE11引言梅氏新贝尼登虫NEOBENEDENIAMELLENI，属扁形动物门PLATYHELMINTHES、吸虫纲TREMATOD
6、A、单殖吸虫目MONOGENEA、多室科CAPSALIDAE、贝尼登亚科BENEDENIINAE。其繁殖速度很快，所寄主范围遍及数百种海产鱼类，可以寄生在鳃丝和体表上取食鱼体表皮肤和粘液12。如真鲷、大黄鱼和牙鲆等，梅氏新贝尼登虫破坏其的黏液组织，吞食体表组织，吸取血液，致使其皮肤搔痒而不断地摩擦，皮肤会糜烂。最终病鱼会躁动不安，厌食或者拒食，易因体力衰竭而死亡34。每只成虫大约可产数百枚卵，虫卵抵抗外界不利因素的能力很强。这些卵孵化成钩毛蚴后又再度侵袭，养殖上采用的一般的防治手段是很难将虫卵杀死的。而且，我国福建、浙江等地近年来非常流行梅氏新贝尼登虫病，自然感染率平均为5214，死亡率近70
7、，经济损失比较大，浙闽沿海等地区的水产养殖业发展受到严重制约。例如福建宁德1998年因梅氏新贝尼登虫病暴发，大黄鱼的自然感染率达70以上，经济损失甚至超过了细菌性疾病带来的损失5。组织蛋白酶B是一类细胞内肽键水解酶，存在于大多数动物的组织中，活性中心含有巯基，催化苯甲酰L精氨酰胺水解。其蛋白水解活性很广泛，可以降解卵黄磷蛋白、血清蛋白、层粘蛋白和血红蛋白等细胞外基质成分67。除参与如免疫抗原的加工、激素的活化和慢性炎症等生理病理过程外，最重要的是参与细胞内蛋白质的新陈代谢8。巯基化合物（SH化合物）存在的前提下，组织蛋白酶B才具有活性，已知有B1和B2二种类别，最适PH在6附近，与木瓜蛋白酶的
8、肽链内切酶类似。CB有两种成熟的形式一种是双链形式，分子量为25KD或26KD的重链，和5KD的轻链，；另一种是单链形式，分子量为31KD9。有报道，在昆虫卵如蚊子卵中含有组织蛋白酶B成分，其在脂肪体内合成，参与胚胎发育时卵黄蛋白的水解过程；棉铃虫的卵内具有半胱氨酸蛋白酶，氨基酸序列分析后，鉴定其为组织蛋白酶B，作用与蚊子卵中的CB相同1011。在研究曼氏血吸虫降解寄主血红蛋白酶类时发现，这些酶均含有半胧氨酸蛋白酶结构域，梅氏新贝尼登虫也吸取寄主血液，也有半胧氨酸蛋白酶结构域，因此推断本研究的基因所编码蛋白也具有降解寄主血红蛋白的作用。2材料和方法21材料211原料与试剂1菌株A宿主大肠杆菌D
9、H10B由本实验室保存B大肠杆菌BL21PLYSS或BL21PLYSE由本实验室保存2质粒PBLUESCRIPTIISK由本实验室保存3工具酶ARTAQDNA聚合酶TAKARA公司B各种限制性内切酶TAKARA公司CT4DNA连接酶TAKARA公司4主要化学试剂A100BPDNAMAKERTAKARA公司B1KBDNAMAKERTAKARA公司CGELEXTRACTIONKIT50DMEGA公司2DDNALIGATIONKITVER2TAKARA公司EEB上海生物工程公司F胰蛋白胨和酵母提取物上海生物工程公司G琼脂粉上海生物工程公司H琼脂糖GENETECHI氨苄青霉素上海生物工程公司J卡那霉素
10、上海生物工程公司KIPTG上海生物工程公司L蛋白预染MARKER上海生物工程公司M溴酚兰上海生物工程公司NTEMED上海生物工程公司OTRIS上海生物工程公司P甘油浙江中星化工试剂有限公司QDTT上海生物工程公司R马斯亮蓝R250上海生物工程公司SEDTA上海生物工程公司T甘氨酸上海生物工程公司（5）引物合成INVITROGEN公司合成（6）测序上海华大公司（7）实验动物2007年8月采用咸淡水浸泡法，在浙江省宁波市象山黄避岙港湾水产养殖育苗中心养殖的大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEA体表分离梅氏新贝尼登虫成虫。212主要仪器（1）台式离心机MICROCL17，THERMO（2）电子
11、分析天平（上海科达测试仪器厂）（3）磁力加热搅拌器（国华企业）（4）DYY11B电泳仪（北京市六一仪器厂）（5）聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（BIORAD）（6）恒温培养箱（上海实验仪器厂有限公司）（7）涡旋振荡器（江苏海门市麒麟医用仪器厂）（8）PCR仪（MASTERCLERPERSONAL，EPPENDORF）（9）凝胶成像系统（UVP，W/VISIONWORKS）213主要试剂及其配制1菌体培养及保存所用试剂ALB液体培养基NACL05，酵母抽提物05，胰蛋白胨1，用NAOH调PH至74，在151BFIN（1034X105）高压蒸汽灭菌20分钟。BLB固体培养基LB液体培养基中加入琼脂至15，高
12、压灭菌。CSOC培养基2W/VTRYPTONE，05W/VYEASTEXTRACT，005W/VNACL，25MMKCL10MMMGCL2，20MMGLUCOSE，配制量100ML。3D10甘油加10ML甘油于适量水中，加水定容至100ML过压灭菌后于4保存，备用。2琼脂糖电泳缓冲液50XTAETRIS242G，冰乙酸571ML，05MOLLEDTA（PH80）100ML，加水定容至1L。22方法221实验动物2007年8月采用咸淡水浸泡法，在浙江省宁波市象山黄避岙港湾水产养殖育苗中心养殖的大黄鱼PSEUDOSCIAENACROCEA体表分离梅氏新贝尼登虫成虫，经系统寄生虫学的鉴定，暂养于海水
13、中至肠道内含物排空后，用无菌双蒸水反复冲洗虫体后置于EPPENDOFF管中，70OC冰箱保存备用。222总RNA提取1213利用RNAISO试剂提取梅氏新贝尼登虫组织总RNA1将100MG70保存的样品在液氮中研磨成粉末，然后加入1MLRNAISO组织以下为加入1MLTRIZOL试剂标准。2研磨后转入15MLEPPENDORF管中，剧烈振荡混匀，室温放置5MIN。4，12000RPM离心5MIN。3取上清，移至新的EP管中，加入1/5体积氯仿，用力振荡15S，充分混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。4底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相。将上清转入一新
14、的离心管注意不要吸入蛋白层，加入05ML氯仿于上清，振荡混匀，室温放置23MIN。4，12000RPM离心10MIN。5将上清转入一新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10MIN。412000RPM离心10MIN，去上清。6加入DEPC水配制的体积分数75乙醇1ML，振摇，洗涤沉淀。412000RPM离心5MIN。重复步骤6一次，以彻底将盐份除净。7去上清，真空干燥，用DEPC水溶解。注意所有待用的非TRIS的试剂用01DEPC水溶液配制。离心管、枪头、研钵及玻璃器皿等用01DEPC水处理过夜后121高压灭菌20MIN。提取过程中要勤换手套及戴口罩，以免RNA降解。8RNA
15、样品OD值检测。取1LRNA溶液加入到69LDEPC处理水中，用紫外分光光度计测定230NM、260NM和280NM的OD值。RNA浓度OD260核酸稀释倍数40/1000G/L去除蛋白指标OD260/OD28018去除盐分指标OD260/OD230209RNA电泳检测。取5LRNA样品加4LDEPC处理水和1L10BUFFER凝胶电泳上样缓冲液，混匀后上样，进行电泳。10MRNA纯化采用OLIGOTEXDT30进行纯化。223构建寄生虫CDNA文库构建实验采用的载体为PBLUESCRIPTIISK，根据选择的ECORI和XHOI酶切位点和锚定引物。224CDNA第一链的合成14（1）模板RN
16、A（POLYARNA）500G中加入不含RNA酶的灭菌水，使其总量达到108L。（2）65加热5分钟后，冰中放置5分钟（冷却。（3）在微量离心管中配制下列反应液。4试剂体积/L51STSTRANDSYNTHESISBUFFER1STSTRANDDNTPMIXTURERNASEINHIBITOR20U/LOLIGODT18ANCHORPRIMER1G/L40121020（4）向3的反应液里加入2的热处理后的POLYARNA溶液（5G），轻轻混匀。（5）室温放置10分钟后，加入REVERSETRANSCRIPTAE（MMLV10L（全量为20L，轻轻混匀。（6）42反应1小时。（7）反应结束后置于
17、冰中冷却2分钟。225CDNA第二链的合成在CDNA第一链合成液（20L）中按下列顺序加入反应试剂，进行2NDSTRANDCDNA的合成反应（反应液总量为146L。试剂体积/L灭菌DEPC水52NDSTRANDSYNTHESISBUFFER2NDSTRANDDNTPMIXTURERNASEFREEH2OECOLIRNASEH/ECOLIDNALIGASEMIXTUREECOLIDNAPOLYMERASEI总体积可变304587522146（2）用移液枪轻轻混匀后16反应2小时。（3）70加热10分钟后，室温放置5分钟。（4）加入4L的T4DNAPOLYMERASE后，轻轻搅拌。（5）37反应1
18、0分钟。（6）向2NDSTRANDCDNA合成反应液（150L）中加入等量（150L）的苯酚/氯仿/异戊醇（25241）溶液。VORTEX搅拌510秒钟。（7）室温下15，000RPM离心5分种，液体分为二层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中注意切勿取出中间层。（8）向水相中加入等量（150L）的氯仿/异戊醇（241）溶液，VORTEX搅拌510秒钟。（9）在室温下15，000RPM离心5分钟，液体分为二层。小心取出水相（上层）移至另一个新的微量离心管中。（10）加入1/10量（15L）的3MSODIUMACETATEPH52、4L的DRGENTLEPRECIPITATIONCA
19、RRIER、225倍量的100乙醇。（11）均匀混合后立即进行15，000RPM、30分钟的离心室温下。（12）除去上清后用70的乙醇清洗。（13）干燥沉淀后，用125L的不含RNA酶的灭菌水溶解沉淀。226适配体连接ADAPTORLIGATION向上述双链CDNA溶液125L中加入下列试剂，全量20L。5试剂体积/L灭菌DEPC水10T4DNALIGASEBUFFERECORISMAIADAPTOR04G/LT4DNALIGASE350U/L总体积可变2352202轻轻混匀后，8过夜反应（16小时以上。370保温30分钟后，室温放置5分钟。44下12000G离心15分钟，小心弃去上清液，用7
20、0乙醇洗涤沉淀，4下12000G离心5分钟。227限制酶XHOI酶切反应1向ADAPTORLIGATION溶液20L中加入下列试剂，全量50L。试剂体积/L灭菌DEPC水XHOISUPPLEMENTXHOI50U/L总体积可变27350轻轻混匀后，37反应3小时。228使用SPINCOLUMN除去短链CDNA以下的COLUMN处理可以除去400BP以下的短链CDNA。SPINCOLUMN的准备（1）反复上下颠倒悬浊COLUMN内的GEL。（2）先取下上盖后，慢慢取下下盖，COLUMN上下盖不要丢弃。（3）让COLUMN内的BUFFER自然流出（大约需要15分钟。（4）安装下盖，向COLUMN中
21、加入2ML的TEBUFFER后再盖上盖，反复上下颠倒悬浊GEL。（5）重复上述操作24。（6）取下COLUMN的上下盖，让COLUMN内的BUFFER自然流出。（7）将去盖的15MLMICROTUBE放置于FALCONTUBE中，然后将SPINCOLUMN插入FALCONTUBE中，将COLUMN的下端安装于FALCONTUBE中的15MLMICROTUBE内2，400G离心2分钟。（8）丢弃FALCONTUBE中的15MLMICROTUBE，向FALCONTUBE中放入新的去盖的15MLMICROTUBE，再将SPINCOLUMN的下端安装于FALCONTUBE中的15MLMICROTUBE
22、内。229短链CDNA的除去（1）向XHOI酶切溶液（50L）中加入下列试剂，充分混合。试剂体积/LTEBUFFERTRNA10G/L401（2）将上述1的溶液向操作1中准备好的SPINCOLUMN中添加。请注意要添加在COLUMN中的GEL表面的中央位置，每次添加约10L，分数次慢慢添加。（3）400G离心2分钟。6（4）COLUMN洗脱液约100L转移至新的15MLMICROTUBE中，加入等量（100L）的苯酚/氯仿/异戊醇（25241）溶液，剧烈振荡混匀。（5）室温下15，000RPM离心5分钟，液体分为二层，小心取出水相（上层）转移至另一个新的微量离心管中注意切勿取出中间层。（6）加
23、入等量（100L）的氯仿/异戊醇（241）溶液，剧烈振荡混匀。（7）室温下15，000RPM离心5分钟，液体分为二层，小心取出水相（上层）转移至另一个新的微量离心管中。（8）加入1/10量（10L）的SODIUMACETATE（PH52、4L的DRGENTLEPRECIPITATIONCARRIER，225倍量的100乙醇，充分混匀。（9）室温下15，000RPM离心30分钟，除去上清，再用70乙醇清洗沉淀。（10）干燥沉淀后用15L的RNASEFREEH2O溶解沉淀。2210连接到特定质粒载体15载体结合反应配制下列LIGATION反应液。试剂体积/LPURIFIEDCDNA10T4DNAL
24、IGASEBUFFERPBLUESCRIPTIISKT4DNALIGASE350U/L15212（2）轻轻混合后12过夜反应。（3）向LIGATION反应液中加入80L的TEBUFFER，用等量100L）的苯酚/氯仿/异戊醇（25241）抽提1次，再用等量（100L）的氯仿/异戊醇（241抽提1次。（4）向上清中加入1/10量（10L）的3MSODIUMACETATEPH52）、4L的DRGENTLEPRECIPITATIONCARRIER，225倍量的100乙醇，充分混合。（5）室温15，000RPM离心30分钟，除去上清。（6）用70乙醇清洗沉淀。（7）干燥沉淀后，用20L的TEBUFFE
25、R溶解沉淀。（8）20保存。2211质粒转化16（1）将80保存的DH10BELECTROCELLS于冰上融解。（2）将LIGATION溶液的一部分（0510L）加入至DH10BELECTROCELLS中，轻轻混匀。（3）将2的菌液迅速转移至冰上预冷的01CM冲击槽中，施加电压脉冲进行电击转化。参数参数LIGATION溶液宿主大肠杆菌机种冲击条件0510LDH10BECOLIPULSER（BIORAD公司）15KV，200，25F7（4）向冲击槽内快速加入冰上预冷的SOC。（5）全量取出回收后，转移至培养TUBE中（FALCONTUBE等，37振荡培养1小时（使用1ML的SOC培养基。（6）取
26、部分5的培养液（1L或10L）涂布于LB/AMP琼脂平板培养基上培养，剩余的培养液请于4保存。（7）37过夜培养。（8）计算菌落数，求取CDNAPRIMARYLIBRARY效率。（9）使用T7PROMOTERPRIMER及T3PROMOTERPRIMER进行COLONYPCR反应，确认本LIBRARY的INSERT分布情况。2212随机测序得到的宿主细胞（大肠杆菌DH10B）进行平板涂布，然后用牙签挑取平板上阳性单克隆，进行序列测定。序列测定和分析采用ABIPRISMTM3770DNA自动测序仪双向测序，由上海华大公司测定。2213生物信息学分析利用INTERNETWWWNCBINLMNIHG
27、OV/BLAST中的BLASTN在线对新基因进行核酸同源性分析；利用INTERNETWWWNCBINLMNIHGOV/GORF/GORFHTML中的ORFOPENINGREADFRAMEFINDER对新基因进行ORF分析；利用INTERNETWWWNCBINLMNIHGOV/BLAST中的BLASTP对新基因编码的氨基酸序列进行同源性分析；利用INTERNETWWWEXPASYCH/TOOLS/在线蛋白分析对新基因进行氨基酸组成统计、分子量、等电点分析和亮氨酸拉链预测；利用SAPS软件HTTP/WWWEBIACUK/TOOLS/SAPS/对新基因进行电荷分布分析；通过PMHTTP/NPSAPB
28、ILIBCPFR/CGIBIN/NPSA_AUTOMATPLPAGENPSA_SOPMHTML工具预测基因编码蛋白质的二级结构；利用NCBI中的CONSERVEDDOMAINDATABASE预测该蛋白的结构域WWWNCBINLMNIHGOV/STRUCTURE/CDD/CDDSHTML；蛋白质的功能区由PROSITETOOLSHTTP/AUEXPASYORG/PROSITE/预测；蛋白质在细胞内的定位由在线软件TARGETP11（HTTP/WWWCBSDTUDK/SERVICES/TARGETP/）分析；利用SIGNALP30软件HTTP/WWWCBSDTUDK/SERVICES/SIGNAL
29、P/）进行该新基因所编码蛋白序列中信号肽的剪切位点分析。多重序列比对采用DNAMAN软件，系统进化分析由HTTP/WWWEBIACUK/TOOLS/MSA/CLUSTALW2/程序完成。3结果与分析31生物信息学分析311同源性及ORF分析分析通过BLASTP在线同源性分析，梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B与豌豆蚜（ACYRTHOSIPHONPISUM）组织蛋白酶B348和桃蚜（MYZUSPERSICAE）组织蛋白酶B的同一性为99；与旋毛虫（TRICHINELLASPIRALIS）组织蛋白酶B和斑马鱼（DANIORERIO）组织蛋白酶BA的同一性为97。新基因的ORF分析显示该基因含有一个大的开放
30、阅读框，起始于第8位的一个ATG起始密码子，终止于第1064位的一个TAG终止密码子，共1056BP，编码352个氨基酸，无多腺苷酸化信号序列“TATAAA”。5端和3端各有一段非编码区，分别由7个和29个核苷酸组成，3末端具有POLYA尾巴。该阅读框起始密码子ATG的3位碱基为腺嘌呤A，符合KOZAK规律既在阅读框起始密码子ATG的周围序列如果碱基为嘌吟碱基A或G，则是有效的翻译起始位点，否则在4位必须出现G，这表明该阅读框是一个最大的完整阅读框。312分子量、等电点、信号肽、及电荷分布分析该基因所编码蛋白的氨基酸序列见图1。通过在线分析新基因编码的氨基酸序列，其分子量为394KDA，等电点
31、PI为586，为一略偏酸性氨基酸；该氨基酸序列不含亮氨酸拉链。ANTHEPRO分析N8端信号肽切割位点在21和22之间（见图1）。组织蛋白酶的信号肽通常在跨膜的过程中被水解掉，剩下的肽链为没有活性的前体，该前体经过限制性蛋白水解酶水解或在酸性条件下自动激活，除去前肽序列而表现其生物活性17。利用全面而实用的蛋白质电荷分布分析软件EXPASY的PROTSCALE软件对基因编码的蛋白进行预测，其电荷分布情况如见图2。由此我们可以看出，此蛋白含带正电荷的氨基酸残基为37个105，带负电荷的氨基酸残基为42个119，总电荷为79224，净电荷为514，表明蛋白带有负电荷。图1梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B
32、氨基酸序列。边框为螺旋，“”为延伸折叠股，“”为转角，“”为无规卷曲。字符底纹为信号肽，黑体加粗为肽酶C1结构域。FIG1CATHEPSINBAMINOACIDSEQUENCEOFNEOBENEDENIAMELLENIFRAMEREPRESENTALPHAHELIX,“REPRESENTEXTENDEDSTRAND,“REPRESENTBETATURN,“REPRESENTRANDOMCOIL9图2组织蛋白酶B氨基酸序列的电荷分布。FIG2CHARGEDISTRIBUTIONOFAMINOACIDSEQUENCEOFCATHEPSINB313功能域分析利用NCBI中的CONSERVEDDOMA
33、INDATABASE预测该蛋白的结构域，分析表明该蛋白序列中含有一个肽酶C1APEPTIDASEC1A结构域（见图3），系木瓜蛋白酶家族中的半胧氨酸蛋白酶。PROSITETOOLS软件分析显示该结构域序列在第296306个氨基酸位点，见图1。在曼氏血吸虫的降解宿主血红蛋白的酶类的研究中发现，其都含有半胧氨酸蛋白酶结构域，梅氏新贝尼登虫吸取宿主的血液，因此推断该新基因所编码蛋白也具有降解宿主血红蛋白的作用1819。图3NCBICONSERVEDDOMAINDATABASE搜索结果。检索到肽酶C1A结构域FIG3THERESULTOFNCBICONSERVEDDOMAINSEARCH。THETYP
34、ICALCONSERVEDDOMAINOFPEPTIDASEC1AHASBEENDETECTEDINNCBIBLASTP314二级结构分析通过PM工具，预测基因编码蛋白质的二级结构构成螺旋（ALPHAHELIX）的有106（3011）个氨基酸，构成延伸折叠股（EXTENDEDSTRAND）有65（1847）个氨基酸，构成转角（BETATURN）有733（938）个氨基酸，构成无规卷曲（RANDOMCOIL）有148（4205）个氨基酸，详见图1。可见无规卷曲和螺旋占据主要的空间结构。316胞内定位及疏水性分析在线软件TARGETP11分析蛋白质在细胞内的定位，预测定位含有分泌通路，该蛋白具有信
35、号肽，可靠性为1，DIFF0800，即预测可靠性强。因此，该蛋白为一分泌蛋白。由图可以看出，在前10个氨基酸内有一个较高的疏水峰，峰值34，为信号肽所在的序列，对比图1其二级结构为螺旋；在第200250个氨基酸内有两个较高的亲水峰，峰值分别为29和35，对比图1其二级结构为无规卷曲。总体上看，亲水峰较疏水峰数量更多，平均峰值更大，既蛋白质的亲水性更强20。10图4蛋白质疏水域分布FIG4HGDROPHILIEITYPROFILEOFPROTEINSEQUENC表110个多重对比的氨基酸序列TAB1TENPROTEINSEQUENCOFMULTIPLEALIGNMENT代号中文名拉丁名基因登录号
36、NEMECB梅氏新贝尼登虫NEOBENEDENIAMELLENI/ACPICB348豆无网长管蚜ACYRTHOSIPHONPISUMNP_0011196081MYPECB桃蚜MYZUSPERSICAEBK0063241TRRECB1毛毕吸虫TRICHOBILHARZIAREGENTIAY6481241TRSPCB16旋毛虫TRICHINELLASPIRALISAY6481241TRSZCB2毛毕吸虫TRICHOBILHARZIASZIDATIEU8777631TRRE2CB2毛毕吸虫TRICHOBILHARZIAREGENTIEF6821291FAHE2肝片吸虫FASCIOLAHEPATICA
37、AJ4889281ANCACB广东住血线虫ANGIOSTRONGYLUSCANTONENSISHQ1101001FAGICB大片形吸虫FASCIOLAGIGANTICAAY2276741SPEXCB甜菜夜蛾SPODOPTERAEXIGUAEF068255132氨基酸多序列比对将组织蛋白酶B所编码蛋白的氨基酸序列做BLASTP检索，结果显示与多种组织蛋白酶BCATHEPSINB同源性较高，并通过网站在数据库中取10个氨基酸序列做多重对比，序列见表1，比对结果见图5。多个代表性物种的CATHEPSINB同源基因的多重排列分析发现，来自不同物种的CATHEPSINB的N端的信号肽长度和序列差异较大。
38、同源性较高的序列集中在（以梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B序列为参考）105144、163190、306435三段（集中在中段和后段），而蛋白序列中含有的肽酶C1A结构域在第296306个氨基酸位点，在这里氨基酸完全同源的有6个（GAHGWGG），其中一个A具有80的同源性，其余5个氨基酸也有具有一定的同源性，表明这6个氨基酸是催化结构必需的，催化位点序11列有一定保守性。就整个序列而言，同源性5640，序列保守性不高。图5组织蛋白酶B的氨基酸多序列比对FIG5MULTIPLEALIGNMENTOFAMINOACIDSEQUENCEOFCB1233进化树构建从NCBIBLASTP结果中选择了40条组
39、织蛋白酶B的序列进行系统进化分析。从组织蛋白酶B的系统进化树图6上可以看出，不同动物中的组织蛋白酶B可以分为三个簇。从上到下，第一、二簇为寄生虫组织蛋白酶B，第三簇的组织蛋白酶B构成比较复杂。其中，第一簇有梅氏新贝尼登虫、广州管圆线虫、大片形吸虫、毛毕吸虫的组织蛋白酶B；第二簇包括华支睾吸虫、毛毕吸虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫；第三簇组成复杂，包括了第一枝的哺乳类、鱼类，和第二枝的昆虫（其中特别的是包含了一寄生虫华支睾吸虫，CLONORCHISSINENSIS）。哺乳类有鼠属、褐家鼠、恒河猕猴、恒河猕猴、智人、野猪、大熊猫，鱼类有胡瓜鱼、虹鳟鱼、斑马鱼，昆虫有家蚕、烟夜蛾、甜菜夜蛾、果蝇、热带家
40、蚊、豌豆蚜、桃蚜、锥蝽。分析第一簇，其下分了三枝，第一枝包括梅氏新贝尼登虫和广州管圆线虫，第二枝为大片形吸虫组织蛋白酶的几种亚型，第三枝为毛毕吸虫的几种组织蛋白酶。根据进化树亲缘关系分析，梅氏新贝尼登虫与广州管圆线虫（ANGIOSTRONGYLUSCANTONENSIS亲缘关系最近，与广州管圆线虫、大片形吸虫、毛毕吸虫一起来自同一寄生虫祖先，构成一个分支。与研究较多的来自第二簇的日本血吸虫不属于同一簇，亲缘关系较远2122。图6梅氏新贝尼登虫组组织蛋白酶B的系统进化树FIG6PHYLOGENETICTREEBASEDONAMINOACIDSEQUENCESOFCBSOFNEOBENEDENIA
41、MELLENI134讨论在本研究中，测定了梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B基因的CDNA序列，最大开放阅读框序列全长1056个核苷酸，这是梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B序列的首次报道。其5端和3端各有一段非编码区，分别由7个和29个核苷酸组成，3末端具有77个A的POLYA尾。这是梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B序列的首次报道。最大开放阅读框编码一个由352个氨基酸组成的蛋白，N端信号肽切割位点在21和22之间，分子量为394KDA，等电点为586，为一略偏酸性氨基酸，不含亮氨酸拉链。该蛋白序列中含有一个肽酶C1APEPTIDASEC1A结构域，系木瓜蛋白酶家族中的半胧氨酸蛋白酶。PROSITETOOLS软件
42、分析显示该结构域序列在第296306个氨基酸位点。此蛋白含带正电荷的氨基酸残基为37个105，含带负电荷的氨基酸残基为42个119，总电荷为79224，净电荷为514，表明蛋白带有负电荷。结构域分析表明其具有降解宿主血红蛋白的作用，二级结构分析表明无规卷曲和螺旋占据主要的空间结构，细胞内的定位分析表明该蛋白为一分泌蛋白，疏水性分析表明亲水峰较疏水峰数量更多，且平均峰值更大，既蛋白质的亲水性更强。多个代表性物种的CB同源基因的多序列比对表明，来自不同物种的CB的N端的信号肽长度和序列差异较大。同源性较高的序列集中在114142、168178、313336三段（主要集中在中后段）。蛋白序列中含有的
43、肽酶C1A结构域氨基酸完全同源的有6个（GAHGWGG），表明这几个氨基酸是催化结构必需的，催化位点序列有一定保守性。就整个序列而言，同源性5640，序列保守性不高。根据进化树亲缘关系分析，梅氏新贝尼登虫与广州管圆线虫（ANGIOSTRONGYLUSCANTONENSIS亲缘关系最近，与广州管圆线虫、大片形吸虫、毛毕吸虫一起来自同一寄生虫祖先，构成一个分支。与研究较多来自第二簇的日本血吸虫不属于同一簇2122。这些年来，因为进行高密度养殖，以及养殖生态环境变化较大等的原因，梅氏新贝尼登虫病害频繁爆发在我国福建、广东和浙江的重要海水养殖区，自然感染率平均高达5214，致使沿海的水产养殖业发展受到
44、严重地影响。因此，在当前紧迫的形势下，梅氏新贝尼登虫病的预防和治疗对于我国水产养殖业的发展具有重要意义。一些已有的研究，报道过一些常规防治梅氏新贝尼登虫成虫的技术。例如，在实验室条件下，使用敌百虫、高锰酸钾及福尔马林等药物，能有效对付梅氏新死贝尼登虫病。但此类物质若大量在开放水域使用，必然带来生态环境的破坏，并危害人身安全。又比如淡水浸泡虫体2MIN，虫体可以全部从寄主身上脱落并死亡。但是此类操作鱼体易受伤，且鱼体会重新被寄生虫所感染。另外，因水体环境的盐度变化较大也会导致鱼体的应激反应。梅氏新贝尼登虫每只成虫可产卵数百枚，卵孵化成钩毛坳后再度侵袭鱼体，整个生活史在1522天23。研究表明，养
45、殖水体中寄生虫卵的数量，与相关病害发生的严重程度紧密相关，因此，阻止水体梅氏新贝尼登虫虫卵的孵化或杀灭虫卵对防治梅氏新贝尼登虫病也有重大意义。CB很可能参与胚胎发育时卵黄蛋白的水解过程，为虫卵提供营养，又推测CB也可能是成虫降解寄主血红蛋白的消化酶类，对梅氏新贝尼登虫体内的组织蛋白酶B开发专一性的酶抑制剂，可能为其病害提供新的防治技术。CB有三类主要的抑制剂一类为KININOGENS，其对CB的抑制作用较弱；第二类为CYSTATINS，主要包括CYSTATINC，它是CB重要的生理调节因子之一；第三类为STEFINS。另具研究，波生坦可以抑制组织蛋白酶B的表达和活力24。日本血吸虫CBDNA疫
46、苗SI31BIN给小鼠接种后，成虫的发育率、粪卵、肠组织减卵率显著降低。结果显示，日本血吸虫CBDNA疫苗具有高度的抗生殖作用。体外转录合成CB基因的特异性SIRNA后，转染EC9706细胞，研究表明不同浓度的SIRNA对CB及MRNA的表达都有抑制。因此推测，SJ31B1N免疫后产生了细胞免疫，对血吸虫的产卵和发育具有一定的影响25。利用植物基因工程技术已经克隆了水稻、小麦等L5种不同来源的蛋白酶抑制剂CDNA，并转人不同植物，其中大部分获得了对昆虫的明显14抗性，解决了因大量使用化学药剂控制害虫而造成的环境污染问题。这给人类的抗寄生虫感染带来了新的启迪。既让宿主表达组织蛋白酶B的抑制剂，或
47、让水草表达后再释放到水体中，引起寄生虫CB的功能不能正常发挥，正常代谢扰乱。其虫卵不能发育，成虫的一些必须氨基酸不能供给，进而导致死亡。这样就可达到阻止虫卵发育和杀灭成虫的目的。同时抑制剂具有专一性，不影响到哺乳动物酶的活性，也会自然降解，应用中就不会在开放水域引起生态环境破坏和人身安全危害。梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B克隆和序列分析为进一步研究该蛋白结构、功能、抑制剂创造了条件，同时也为今后研究该蛋白的抑制剂是否可作为梅氏新贝尼登虫病的治疗药物奠定了基础。15参考文献1BONDADREANTASOMG,OGAWAK,FUKUDOMEMREPRODUCTIONANDGROWTHOFNEOBENE
48、DENIAGIRELLAEMONOGENEA,CAPSALIDAEASKINPARASITEOFCULTUREDMARINEFISHESOFJAPANJFISHPATHOLOGY,1995,3032272312KOESHARYANII,ZAFRANI,YUASAK,ETA1TWOSPECIESOFCAPSALIDMONOGENEANSINFECTINGCULTUREDHUMPBACKGROUPERCROMILEPTESALTIVELISININDONESIAJFISHPATHOLOGY,1999,3431651663张纹,王军,苏永全,等两种新贝尼登虫28SRRNA序列分析及其亲缘关系探讨J海
49、洋学报,2004,2651161224徐昌隆,黄智铭,陈民新,等组织蛋白酶B及其基因在肝癌中的表达及意义J温州医学院学报,2004,3464144165李杰平,张平,张书杰,等实验性肺纤维化大鼠肺组织CATHEPSINB表达的动态变化J中国现代医学杂志,2008,18165686卢士英,任洪林,柳增善,等组织蛋白酶B研究进展J河北师范大学学报自然科学版,2004,2833063097SKRZYDLEWSKAE,SULKOWSKAM,WINCEWICZA,ETA1EVALUATIONOFSERUMCATHEPSINBANDDINRELATIONTOCLINICOPATHOLOGICALSTAGINGOFCOLORECTALCANCERJWORLDJGASTROENTEROL,2005,11274254298任洪林,柳增善,卢士英,等大腹园蛛AVG1CDNA的克隆和序列分析J中国生物化学与分子生物学报,2004,2045615649肖庆,唐深,樊晓晖组织蛋白酶B及抑制剂与肿瘤J现代肿瘤医学,2008,16467467610徐夏莲,赵小凡,
