1、本科毕业设计（20_届）酶法提取乌贼眼中透明质酸的研究所在学院专业班级食品质量与安全学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录0前言11材料与方法211实验材料与仪器2111原料2112实验试剂2113仪器与设备212实验方法2121乌贼眼玻璃体基本成分测定2122酶活力的测定福林（FOLIN）法3123透明质酸含量测定4124工艺流程4125操作要点5126酶解工艺单因素实验5127酶解相应面试验分析62结果与分析621乌贼眼液中基本成分测定622酶种类的选择6221酶活力测定6222酶种类的确定723加酶量对透明质酸提取率的影响724酶解时间对透明质酸提取率的影响825酶解温度对透明质酸提取
2、率的影响826PH对透明质酸提取率的影响927酶解条件的优化10271优化试验结果方差分析10272响应面直观分析及酶解工艺的优化1128验证试验133小结14致谢错误未定义书签。参考文献15摘要本文以乌贼眼为原料，以透明质酸提取率为指标，采用单酶法研究了从乌贼眼液中提取透明质酸的工艺。研究结果表明，胃蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶三种蛋白酶中，中性蛋白酶的酶解效率最高。选取中性蛋白酶进行了单因素试验，以酶解温度、酶解时间、加酶量、PH值作为试验因素，初步确立了中性蛋白酶酶解的各水平最佳条件。最后，通过响应面试验优化确定了中性蛋白酶酶解提取乌贼眼中透明质酸的最佳工艺条件酶解时间309H，酶解温度
3、6057，加酶量为823995U/G。通过实验验证，在该条件下，中性蛋白酶对提取透明质酸有较好的酶解效果，其透明质酸提取率为1069，与模型预测值相符。说明单酶法可较好地应用于乌贼眼中透明质酸的提取，通过响应面分析法可以得到一个较好预测试验结果的模型方程。关键词乌贼眼睛；透明质酸；酶法；提取；响应面分析法ABSTRACTINTHISPAPER,WITHTHEEXTRACTIONRATEOFHYALURONICACIDASTHEINDEX,SQUIDEYEDROPSOFHYALURONICACIDWASEXTRACTEDFROMSQUIDEYESBYUSINGENZYMATICHYDROLIZA
4、TIONSTUDYRESULTSSHOWEDTHAT,NEUTRALPROTEASESELECTEDFORMAXIMUMEFFICIENCYFROMPEPSIN,NEUTRALPROTEASEANDTRYPSINTHESETHREEPROTEASEHASCHOSENNEUTRALPROTEASECARRYINGONSINGLEFACTORTEST,WITHENZYNOLYSISTEMPERATURE,ENZYNOLYSISTIME,PLUSENZYMEQUANTITYANDPHVALUE,ASTHEEXPERIMENTALFACTOR,HAVEESTABLISHEDEVERYHORIZONTA
5、LOPTIMUMCONDITIONOFENZYNOLYSISOFNEUTRALPROTEASETENTATIVELYFINALLY,OPTIMIZEDBYRESPONSESURFACETESTTODETERMINETHEOPTIMUMTECHNOLOGICALCONDITIONSOFNEUTRALPROTEASEZYMOLYSINGEXTRACTIONHYALURONICACIDFROMSQUIDEYESZYMOLYSINGTIME309H,ZYMOLYSINGTEMPERATURE6057,ADDENZYMEQUANTITY823995U/GTHROUGHTHEEXPERIMENT,INTH
6、ISCONDITION,NEUTRALPROTEASEFORTHEEXTRACTIONOFHYALURONICACIDHAVEBETTERZYMOLYSINGEFFECT,ITSHYALURONICACIDEXTRACTIONRATEIS1069CORRESPONDWITHMODELPREDICTIONTHATSINGLEENZYMATICQUITEGOODTOAPPLIEDTOEXTRACTHYALURONICACIDFROMSQUIDEYES,THEEXTRACTIONBYRESPONSESURFACEMETHODCANGETABETTERPREDICTTHERESULTSOFTHETRI
7、ALMODELEQUATIONSKEYWORDSSQUIDEYESHYALURONICACIDHAENZYMATICEXTRACTIONRESPONSESURFACEMETHODRSM10前言乌贼，俗称墨鱼,是我国四大海产大黄鱼、小黄鱼、带鱼、乌贼之一，是沿海常见的一种产量很高的软体动物，肉厚味美,营养丰富,具有重要的经济价值与药用价值。目前，人们对乌贼的利用与开发主要为其骨、肉、墨、血、卵及内脏。乌贼骨又名海螵蛸，是一种常用的中药材，可治多种内外出血,单用有效表现为制酸,可中和过多胃酸1,在皮肤、粘膜包括体内表面还有制泌、收敛、降低血管通透性的作用,化学处理过的海螵蛸还可用作接骨材料,相容性
8、好且不引起炎症、毒性及排斥反应2，并且还有抗肿瘤、防辐射的功效。乌贼肉质鲜美,营养丰富,有活血化淤之效,不但补气、补血且可滋阴3。乌贼墨在我国最初用于止血,当今对其的研究包括增强对细胞免疫功能及抗肿瘤功能，以及提取物制毛发强壮剂,用于生发、黑发1。乌贼血可主治耳聋。乌贼卵可用于开胃利水1，乌鱼蛋是雌墨鱼的缠卵腺加工制成的，有冬食去寒夏食解热之功效。乌贼内脏粉蛋白质含量高，氨基酸组成较理想，除具备必需氨基酸外，还含有丰富的牛磺酸，富含卵磷脂和胆固醇，可作为对于甲壳类动物的的饲料4。然而乌贼头两侧一对发达的眼睛，却没有得到很好的利用。据统计，水产品加工过程中产生大约1540的下脚料，其中鱼眼约占2
9、5，通常这些下脚料包括乌贼眼会被人们忽视。乌贼眼较大，如果对其加以利用，从中提取具有广泛应用的透明质酸，不仅能丰富我们对乌贼的开发利用，同时能带动水产品的加工利用，减少渔业资源浪费，而且提取出的透明质酸，能应用于人们的日常生活之中，提高人们的生活质量。透明质酸HYALURONICACID,简称HA,又名玻璃酸,玻尿酸,它是由132乙酰氨基2脱氧D葡萄糖14DD葡萄醛酸双糖重复单位所组成的直链粘多糖5。HA具有许多天然粘多糖共有的性质，呈白色，无定形固体，无嗅、无味，有吸湿性，溶于水，不溶于有机溶剂6。HA最突出的特点是水溶液有独特的黏弹性，由于透明质酸含多个羟基、羧基,能与水分子形成氢键,有很
10、强的保水作用,是国际上公认的最好的保湿剂7。HA广泛存在于动物的各种组织中,其中以哺乳动物体内的玻璃体、关节滑液和脐带、鸡冠含量最高8。1934年MEYER和PALMER首先从牛眼玻璃体内提取分离得到该物质。此后，人们对HA的分布、化学结构、理化性质、生理作用、制备工艺及其应用方面进行了广泛深入的研究，在医药、化妆品、食品领域中广泛应用9。因HA化学结构具有单糖间氢键的作用和螺旋空间外侧具有疏水性，HA具有很强的保水性，成膜性和润滑性10。HA具有抗氧化功能，通过与自由基的反应,HA在体内可成为消除自由基的清道夫11。因而，HA现已广泛地用在基础化妆品品乳剂、霜剂、化妆水、美容液、润肤等妇女用
11、化妆品底霜、口红、唇青、眼睑膏、粉饼、描眉脂等和各类香波、发乳等日化产品中。目前含透明质酸的化妆品被国际上公认为第四代化妆品、仿生化妆品等,许多国家在竞相研究开发8。HA还应用于医学美容中，一是对皮肤科的应用，HA能用来治疗皮肤炎症，促进组织的再生、重塑和愈合过程中，对肌肤进行再生性修复，不留疤痕；二是透明质酸作为皮肤填充剂用于注射美容12。在眼科手术，HA具有保护角膜上皮，维持角膜透明，维护正常前房，保护眼内组织，协助散瞳，防止玻璃体脱出，帮助止血，支撑囊袋，润滑缝线等作用，故广泛用于穿透性角膜移植术、抗青光眼术、白内障超声乳化吸出术、人工晶体取除术、玻璃体视网膜术、眼外伤等各项眼科复杂手术
12、6。HA对骨性关节炎OA、类风湿性关节炎RA等关节疾病的治疗效果明确、安全，具有很好的应用前景13。黄建艳等142制备成琼脂糖一HA共聚物，再用该共聚物包载胰岛素，释药实验表明包载的胰岛素具有缓释行为；LEE等15研制出一种HA一紫杉醇结合物，它在水溶液中可形成纳米级胶束聚集体，且在酸性条件下紫杉醇可完整地从胶束中解离，具有靶向性和控释作用，作为特异性肿瘤拮抗剂具有潜在的应用前景；KUMAR等16研究发现，FE2O3可以作为将HA与纳米粒连接的桥梁，并成功地研制出新型HAFE2O3纳米级脂质体，同时发现这种新型脂质体几乎能够全部将多肽药物输送至靶点。此外，作为诊断某些疾病的指标,MARIA、P
13、OLYXENI等人研究发现透明质酸（HA）在肝纤维化的发病机制中发挥了显着的作用，通过比浊法测量201个地中海贫血患者体内的HA含量，如果体内的HA含量增高，则可评估患者的肝纤维化的程度17。因此，本课题以透明质酸得率为指标，确定温度、PH、加酶量以及酶解时间对中性蛋白酶水解提取乌贼眼中透明质酸的影响，采用响应面法优化中性蛋白酶的酶解条件，确定最佳酶解工艺，对透明质酸的研究与乌贼的开发利用具有重要的意义1材料与方法11实验材料与仪器111原料乌贼眼新鲜金乌贼购于宁波庄市新鲜金乌贼洗净，挑破眼珠，取眼液，滤去泥沙、色素等杂质，18冻藏；实验用时4解冻，匀浆。112实验试剂中性蛋白酶（20万U/G
14、）、胃蛋白酶、胰蛋白酶、D葡萄糖醛酸、葡萄糖、蒽酮硫酸试剂、咔唑、十水合四硼酸钠（四硼酸钠）（分析纯）、氯化钠（分析纯）、双氧水（质量分数30）、浓硫酸、无水酒精（分析纯）、三氯乙酸（15）113仪器与设备电子分析天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；DKS24型电热恒温水浴锅上海精宏实验设备有限公司；冷冻高速离心机湖南湘仪离心机仪器有限公司；T6新锐可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；SHZ82气浴恒温振荡器金坛市科技仪器有限公司；ZJ1U11型恒温干燥箱浙江诸暨市实验仪器厂。凯氏定氮装置，消化炉，马福炉等。12实验方法121乌贼眼玻璃体基本成分测定1211水分测定直接干燥法（GB/
15、T500932010）1212灰分测定灰化法（GB/T500942010）1213总蛋白测定凯氏定氮法法（GB/T500952010）1214总糖测定蒽铜硫酸法样品处理称取一定量匀浆后样品，加适量的水于90水浴提取3H，将提取液稀释一定倍数后备用。标准曲线制作分别移取05ML、1ML、2ML、5ML、8ML、10ML浓度1G/L的标准葡萄糖溶液于100ML容量瓶定容，即得浓度为0005G/L、001G/L、002G/L、005G/L、008G/L、010G/L葡萄糖系列标准溶液。取蒸馏水、葡萄糖系列标准液各1G/L，加入4G/L蒽酮硫酸试剂摇匀，迅速将试管放入冰水3浴中冷却，避光处存放，各管加
16、完后一起放入沸水浴中加热，自水浴重新沸腾起加热7MIN，流动水冷却，室温放置10MIN，在620NM波长处比色测定。样品测定同标准品的处理，记录吸光值A。122酶活力的测定福林（FOLIN）法试剂配制（1）福林试剂FOLIN试剂于2000ML磨口回流装置内，加入钨酸钠NA2WO42H2O100G，钼酸钠NA2MOO42H2O25G，蒸馏水700ML，85磷酸50ML，浓盐酸100ML，文火回流10H。取去冷凝器，加入硫酸锂LI2SO450G，蒸馏水50ML，混匀，加入几滴液体溴，再煮沸15MIN，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴液，再煮沸除去之。冷却后
17、，定容至1000ML，用细菌漏斗过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。（2）04MOL碳酸钠溶液称取无水碳酸钠NA2CO3424G，定容至1000ML。（3）04MOL三氯乙酸TCA溶液称取三氯乙酸CCL3COOH654G，定容至1000ML。PH72磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠NAH2PO42H2O312G，定容至1000ML，即成02MOL溶液A液。称取磷酸氢二钠NA2HPO412H2O7163G，定容至1000ML，即成02MOL溶液B液。取A液28ML和B液72ML，再用蒸馏水稀释1倍，即成01MOLPH72的磷酸盐缓冲液。（4）2酪蛋白溶液准确称取
18、干酪素2G，称准至0002G，加入01MOL/L氢氧化钠10ML，在水浴中加热使溶解必要时用小火加热煮沸，然后用PH72磷酸盐缓冲液定容至100ML即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存。（5）100G/ML酪氨酸溶液精确称取在105烘箱中烘至恒重的酪氨酸01000G，逐步加入6ML1MOL/L盐酸使溶解，用02MOL/L盐酸定容至100ML，其浓度为1000G/ML，再吸取此液10ML，以02MOL/L盐酸定容至100ML，即配成100G/ML的酪氨酸溶液。酶活力标准曲线制作分别吸取不同浓度酪氨酸1ML，各加入04MOL碳酸钠5ML，再各加入已稀释的福林试剂1ML。摇匀置于水浴锅中。40保温
19、发色20MIN在660NM波长测OD值。一般测三次，取平均值，同时做空白试验。样品测定称取酶粉0100G，加入PH72磷酸盐缓冲液定容至100ML，吸取此液5ML，再用缓冲液稀释至25ML，即成5000倍的酶粉稀释液。取样品稀释液1ML，置于40水浴中预热2MIN，再各加入经同样预热的酪蛋白1ML，精确保温10MIN，时间到后，立即再各加入04MOL三氯乙酸2ML，以终止反应，继续置于水浴中保温20MIN，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取滤液1ML，再加04MOL碳酸钠5ML，已稀释的福林试剂1ML，摇匀，40保温发色20MIN后进行光密度OD测定。空白试验测定方法同上，唯在加酪蛋白之前
20、先加04MOL三氯乙酸2ML，使酶失活，再加入酪蛋白。计算在40下每分钟水解酪蛋白产生1G酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。样品蛋白酶活力单位干基10A4NW11式中A由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数或OD值K；44ML反应液取出1ML测定即4倍；N酶液稀释的倍数；10反应10MIN；4W样品水分百分含量。123透明质酸含量测定关于透明质酸含量的测定，有咔唑法【18】和浊度试验法【19】，前者利用结合或游离的葡萄糖醛酸在浓硫酸中能够与咔唑试剂反应而生成有颜色的物质原理，后者利用透明质酸和十六烷基三甲基溴之间能形成不溶性复合物可以通过酶标仪测定，JUNGMINSONG等人最佳研究
21、发现后者更简便更快速，但是由于目前应用的太少，故本实验使用BITTER和MUIR建立的改良咔唑法，通过测定葡萄醛酸的方法，选用直接比色法进行测定透明质酸的含量【18】。一般葡萄糖醛酸约占透明质酸质量的4844，根据换算可得出透明质酸的含量。试剂配制（1）0025MOL/L硼砂硫酸液称取四硼酸钠945G，溶于浓硫酸AR1000ML中,加盖,不定时振摇,直至四硼酸钠完全溶解。室温下贮存。（2）01咔唑试液称取咔唑0125G，溶于乙醇AR100ML中,置于棕色瓶中冰箱内保存。（3）葡萄糖醛酸（GA）标液精称20MG葡萄糖醛酸，置于100ML容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，4以下贮存。葡萄糖醛酸标准曲线制
22、作精密称取葡糖醛酸AR20MG，置100ML量瓶中，加水溶解至刻度，摇匀备用。精密量取标准溶液05、10、15、20、25ML，分别加入10ML量瓶中，加水稀释至刻度，得10、20、30、40和50G/ML浓度的对照品溶液。取6只具塞刻度试管分别加入硼砂硫酸液5ML，置冰浴中冷至4左右。然后分别取空白溶液蒸馏水和不同浓度的对照品溶液各1ML加入试管中，先轻轻振摇，再充分混匀，并不断用冰浴冷却，将试管置沸水中加热10MIN，置常水中冷至室温。加入咔唑试剂02ML，混匀，水浴中再加热15MIN，冷至室温。在530NM处测定吸收度，以吸收度对浓度作图即可绘出标准曲线,或作直线回归数据处理,计算出吸收
23、度和浓度的线性回归方程CBKA，B截距，K斜率。0010203040506070102030405060葡萄糖醛酸浓度G/ML吸光度图1葡萄糖醛酸标准曲线图FIG1STANDARDCURVEOFGLUCURONICACID所得标准曲线回归方程为Y00129X00153,相关系数R209958,其中Y为吸光度X为葡萄糖醛酸浓度UG/ML,标准曲线见图1。样品测定取本品01G/L的溶液1ML，照标准曲线项下的方法测定吸收度。从标准曲线上查出相应的葡糖醛酸浓度，按下式计算含量透明质酸提取率透明质酸含量（G）/玻璃体干重（G）100124工艺流程乌贼眼破眼珠取眼液盐溶处理调PH加酶保温酶解灭酶离心TC
24、A（三氯乙酸）去蛋5白H2O2脱色醇沉冷冻干燥透明质酸粗品125操作要点1251原料预处理将新鲜的乌贼洗净，剪下乌贼头部，然后将乌贼的眼从眼眶中挑出来，挑的时候注意不要将乌贼眼珠挑破，挑出来后用干净的剪刀将其戳破（乌贼眼珠置于干净的小烧杯内），去除眼中的晶状体，将眼中的红褐色眼液滴入干净的小烧杯内。等所有乌贼眼珠都处理完后，滤去泥沙、色素等杂质，将其盛放于干净小烧杯中并用保鲜膜封口并用橡皮筋圈住，贴上标签，置于冰箱冷冻室中贮存以备用。1252盐溶处理按料液比15在乌贼眼液中加入02MOL/L氯化钠溶液，于SHZ82气浴恒温振荡器内振摇4H。调节溶液PH时，先测定原液的PH,再在这基础上用1MO
25、L/L的NAOH和1MOL/LHCL溶液调节。1253酶解在酶解之前，先调节好所用水浴锅的温度。将已经加入酶的溶液振荡均匀，将其放入水浴锅中进行保温酶解，注意固定好锥形瓶，每隔20MIN左右，振荡均匀锥形瓶内溶液，使其充分反应。1254灭酶将酶解好后的溶液取出，放盛放有沸水的锅内煮沸10MIN进行灭酶处理。在该过程中要注意水量要适中，水量过多锥形瓶会漂浮不容易固定，而且所贴的标签也会脱落，可能会使各样品难以区别；水量过少，则水容易烧干。1255离心灭酶后摇匀将样品倒入干净的标好号的离心管内，于离心机内6000R/MIN离心8MIN。1256TCA（三氯乙酸）去蛋白取离心后的上清液，加入2倍体积
26、的15的TCA，静置05H后于4000R/MIN离心20MIN。1257H2O2脱色取离心后的上清液，将其PH调至中性,再加入10体积的质量分数为30的双氧水脱色4H。1258醇沉脱色好后,尽快加入354倍体积的95的乙醇进行醇沉,将其置于4冰箱内过夜,隔天离心过滤取沉淀。126酶解工艺单因素实验1261酶种类的选择将胃蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶三种蛋白酶，依据各自的酶活力确定加酶量，并在各自最佳酶解条件下酶解乌贼眼液，根据透明质酸得率的多少，确定最佳的酶解蛋白酶。1262加酶量的确定在样液中分别加入10、15、20、25、30、35、40、45、50（W/V）选定的最佳蛋白酶,与40下酶解
27、2H,然后测溶液的吸光度,计算出透明质酸得率,从而得出最适合的加酶量。1263酶解时间的确定对于选定的最佳蛋白酶,在相同的酶解条件下进行酶解,选用不同的水解时间,05H、1H、2H、3H、4H、5H，根据最后透明质酸的得率,确定最佳的酶解时间。1264酶解温度的确定对于选定的最佳蛋白酶,在其他条件相同的酶解条件下,分别于30、40、50、60、70、806下水解2H,然后通过测定结果确定最佳酶解温度。1265酶解PH的确定对于选定的最佳蛋白酶,在其他条件相同的酶解条件下,分别调节其PH为60、65、70、75、80和维持原溶液PH进行酶解，根据最后透明质酸的得率,确定最佳的酶解PH。127酶解
28、相应面试验分析根据BOXBENHNKEN的中心组合试验设计原理20，综合单因素影响实验结果，选取对透明质酸提取率影响显著的三个因素，在单因素实验的基础上采用三因素三水平的响应面分析方法进行试验设计，对酶解提取乌贼眼中透明质酸的工艺条件进行优化。2结果与分析21乌贼眼液中基本成分测定本实验得按照最新国家标准对乌贼眼液中的基本成分进行了测定，经过设定平行试验与多次测量取平均值，最后获得各基本成分的含量，如表1所示。从表1可知，乌贼眼中含量最多的成分是水分，其次是总糖的含量，包括本次实验要测定的透明质酸粘多糖，此外乌贼眼中还含有一定量的蛋白质。表1乌贼眼液中基本成分含量TABLE1THEBASICC
29、OMPONENTCONTENTINSQUIDEYEDROPS水分灰分总蛋白总糖含量（）90107914215422酶种类的选择221酶活力测定所得酶活力标准曲线回归方程为Y00115X00095,相关系数R209987,其中Y为吸光度X为酪氨酸浓度UG/ML,标准曲线见图2。002040608112020406080100120酪氨酸浓度G/ML吸光度图2酶活力标准曲线FIG2STANDARDCURVEOFENZYMEACTIVITY根据福林（FOLIN）法操作说明与酶活力标准曲线，测得胃蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶三种酶的酶活力如表2所示。7表2不同种类酶的酶活力TABLE2DIFFEREN
30、TTYPESOFENZYMEACTIVITY酶种类胃蛋白酶中性蛋白酶胰蛋白酶酶活力U/G140002000001000000222酶种类的确定选用胃蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶三种非常常见的蛋白酶，根据各自的最佳酶解条件，胃蛋白酶酶解条件为料液比13，加酶量8000U/G，PH20,于37下酶解20H；中性蛋白酶酶解条件为料液比13，加酶量8000U/G，PH70,于40下酶解20H21；胰蛋白酶酶解条件为料液比13，加酶量8000U/G，PH80,于40下酶解20H。酶解好后,各种酶酶解透明质酸得率如表2所示。表3不同种类酶对透明质酸得率的影响TABLE3DIFFERENTKINDSOFEN
31、ZYMESONTHEYIELDOFHYALURONICACID酶种类料液比加酶量（U/G）PH值时间（H）温度（）HA提取率（）胃蛋白酶138000202037287中性蛋白酶138000702040664胰蛋白酶138000802040305由表3可以得知，用中性蛋白酶酶解乌贼眼液的透明质酸提取率远远高于使用胃蛋白酶和胰蛋白酶的透明质酸提取率，故选择中性蛋白酶作为最适蛋白酶进行酶解。23加酶量对透明质酸提取率的影响选取中性蛋白酶进行实验，在T40条件下，按料液比15加入02MOL/L氯化钠溶液，SHZ82气浴恒温振荡器中振荡4H，振荡结束后，分别按2000U/G、3000U/G、4000U/
32、G、5000U/G、6000U/G、7000U/G、8000U/G、9000U/G、10000U/G（W/V）加入中性蛋白酶，都酶解2H后，得出透明质酸提取率，结果如图3所示。012345678020004000600080001000012000加酶量U/GHA提取率HA提取率（）图3加酶量对透明质酸提取率的影响FIGURE3ENZYMECONCENTRATIONONTHEEXTRACTIONRATEOFHYALURONICACID8从图3中可以看出，随着酶用量的加大，透明质酸的提取率不断增大，特别是加酶量从2000U/G到8000U/G之间，透明质酸提取率显著增加，上升趋势较快，在加酶量为
33、8000U/G到10000U/G之间，透明质酸提取率增加得比较缓慢，趋势渐缓，几乎持平。估计在加酶量为8000U/G时，乌贼眼液中的透明质酸几乎都已经被酶解释放出来了，考虑到酶解效果与实际成本，8000U/G应为最佳加酶量。24酶解时间对透明质酸提取率的影响在T40条件下，按料液比15加入02MOL/L氯化钠溶液，SHZ82气浴恒温振荡器中振荡4H，振荡结束后，加入8000U/G（W/V）中性蛋白酶，分别酶解05H、10H、20H、30H、40H、50H后，得出其透明质酸提取率，结果如图4所示。44555566577588590123456酶解时间HHA提取率HA提取率（）HA提取率（）图4酶
34、解时间对透明质酸提取率的影响FIGURE4HYDROLYSISTIMEONEXTRACTIONYIELDOFHYALURONICACID从图4可以看出，透明质酸提取率先随着时间的增加而增大，在30H左右达到最大值，在30H以后，透明质酸提取率反而减小，可能由于时间的延长，部分透明质酸在溶液中发生了降解发应，导致其提取率在30H后不增反减。根据透明质酸提取率的最大值，将最佳酶解时间定为30H。25酶解温度对透明质酸提取率的影响先按料液比15加入02MOL/L氯化钠溶液，SHZ82气浴恒温振荡器中振荡4H，振荡结束后，加入8000U/G（W/V）中性蛋白酶，分别于30、40、50、60、70、80
35、水浴锅中，酶解20H，得出其透明质酸提取率，结果如图5所示。从图5可以看出，酶解温度对透明质酸提取率的影响是显著的，透明质酸提取率先随着温度的增加而增大，在60左右达到最大值，在60以后，透明质酸提取率反而减小。可能由于温度的增加，部分中性蛋白酶发生了变性，也可能随着温度增加透明质酸发生了降解，从而导致其提取率在60后不增反减。根据透明质酸提取率的最大值，将最佳酶解温度定为60。9468102030405060708090酶解温度HA提取率HA提取率图5酶解温度对透明质酸提取率的影响FIGURE5ENZYMATICEXTRACTIONTEMPERATUREONTHERATEOFHYALURON
36、ICACID26PH对透明质酸提取率的影响在T40条件下，按料液比15加入02MOL/L氯化钠溶液，于SHZ82气浴恒温振荡器中振荡4H，振荡结束后，按8000U/G（W/V）加入中性蛋白酶，先用PH计测出未调PH值前原液PH为66，用1MOL/L的NAOH和1MOL/LHCL溶液调节PH，将样品溶液PH分别调为PH60、PH65、PH70、PH75和PH80，酶解2H后，得出透明质酸提取率，结果如图6所示。从图6可以看出，透明质酸提取率先随着PH的增加而增大，在PH66左右达到一个峰值，随后透明质酸提取率反而有些微减小，在PH70以后透明质酸提取率又随着PH的增加而增大，在PH75左右达到另
37、一个峰值，然后随着PH的增加透明质酸提取率反而降低。在本次实验中，透明质酸提取率出现了两个峰值，分别为PH66时669的和PH75时的671，两者相差不大，考虑到操作成本与便利性，其最佳酶解PH值即为原液的PH值。456755665775885酶解PHHA提取率HA提取率图6酶解PH值对透明质酸提取率的影响FIGURE6ENZYMATICPHVALUEONTHEEXTRACTIONRATEOFHYALURONICACID1027酶解条件的优化根据单因素试验结果，采用响应面设计试验，以酶解时间、酶解温度、加酶量为自变量，透明质酸提取率为响应值。对酶解时间、酶解温度、加酶量作如下变换22AT30/
38、05，BT600/5，CZ8000/1000，以三次试验所得多糖提取率的平均值为响应值Y，选取的水平表如表4所示。采用DESIGNEXPERTV7软件设计试验并处理数据。表4响应面试验因素水平TABLE4FACTORSANDLEVELSOFRASTEST因素因素101A时间（H）250300350B温度（）550060006500C加酶量（U/G）700080009000271优化试验结果方差分析对酶解时间、酶解温度、加酶量与透明质酸提取率进行相应面分析，试验结果见表5。对每个试验点重复3次，取平均值。表5响应面试验设计及数据处理TABLE5PROGRAMANDRESULTSOFRSATEST
39、试验号ABCHA提取率（）101196821101000310190040001065511099761101035710174081019309000106810000106311011920120117201311010231400010671510172016000106717011780对各个实验结果进行方差分析，分析结果如表6所示。11表6回归模型方差分析表TABLE6VARIANCEANALYSISOFREGRESSIONMODEL方差来源平方和自由度方差F值P值（PROBF）回归模型26709297285415F值小于00500时，表明总体上模型因素水平项显著。回归模型各项的方差
40、分析结果表明酶解温度的一次项A、加酶量的一次项C、酶解时间和加酶量的交互项BC,酶解温度的二次项A2，酶解时间的二次项B2，加酶量的二次项C2项也均为显著项，当值大于01000则表明该模型因素水平不显著。如果含有许多不显著的模型（不包括那些需要支持层次结构的模型），那么这些模型阶降将会提高本模型。失拟项的F值为473表明有837的几率模型的失拟项值会由于噪音干扰会发生扩大。利用DESIGNEXPERTV7软件对表中透明质酸提取率Y和三个因素A、B、C的数值进行回归分析，得到回归方程（1）。Y1066014A0026B095C0038AB0025AC027BC038A2014B2205C2（1）
41、方差分析结果显示,回归模型极显著PAB，即加酶量酶解时间酶解温度24。原因可能在于中性蛋白酶酶解时的适用酶解时间范围较大，在试验的酶解时间内，其酶解程度比较稳定，与前面的单因素试验结果一致。272响应面直观分析及酶解工艺的优化通过多元回归方程作响应面可以直观表现出各反应条件对透明质酸提取率的影响。固定一个因素于0水平，求另两个因素的交互效应方程，根据这些方程得到三个因子（酶解时间A，酶解温度B，加酶量C）的交互效应等高线图和曲面图。12图7图9是根据多元回归方程所得到的不同因素水平对乌贼眼中透明质酸提取率影响的响应面及其等高线图，通过以下组图可对任意两因素及其交互作用对透明质酸提取率的效应进行
42、分析和评价，因而可以确定最佳因素水平范围22。图7ZFA,B的响应面与等值线FIG7RESPONSIVESURFACEPLOTANDCONTOURPLOTZFA,B图7是加酶量固定为8000U/G时，酶解时间与酶解温度对透明质酸提取率的响应面及其等高线图。通过图7可以比较直观地看出，酶解时间与酶解温度的交互作用对透明质酸提取率结果的影响是显著的，透明质酸提取率随酶解时间和酶解温度先增加后减小，在酶解时间为30H，酶解温度为600时，透明质酸提取率达到最大值1067。其原因可能为随着时间的增加，透明质酸糖键结构可能在中性蛋白酶的作用下不够稳定发生了化学变化，部分透明质酸降解导致透明质酸提取率下降
43、。从等高线图上可以看出，实验范围内酶解时间较长时等高线趋向圆形排列较松散，说明交互作用较弱22，对透明质酸提取率影响不显著。酶解时间较短时等高线趋向椭圆，表明交互作用较强22，对透明质酸提取率影响显著。图8ZFA,C的响应面与等值线FIG8RESPONSIVESURFACEPLOTANDCONTOURPLOTZFA,C图8是酶解温度600时，加酶量与酶解时间对透明质酸提取率的响应面及其等高线图。由图可知，随着随着加酶量的增加透明质酸提取率呈现先升后降的趋势。观察等高线可以看出，加酶量13在70008000U/G之间时，等高线较密集，交互作用较强，表明对透明质酸提取率影响显著。而当加酶量在800
44、09000U/G之间时，等高线较稀疏，交互作用较弱，表明对透明质酸提取率影响不显著。该结果与单因素实验结果相一致，这可能是因为加酶量在8000U/G左右时，中性蛋白酶几乎已经提取完了样液中的透明质酸，提取率已经达到饱和，再加入中性蛋白酶透明质酸提取率不会增大反而会由于中性蛋白酶过量引起部分透明质酸降解而使透明质酸提取率降低。图9ZFB,C的响应面与等值线FIG9RESPONSIVESURFACEPLOTANDCONTOURPLOTZFB,C图9是酶解时间为30H时，加酶量与酶解温度对透明质酸提取率的响应面及其等高线图。由图9可见，随着酶解温度的增加透明质酸提取率呈现先增加后降低的趋势。在酶解温
45、度中心值附近时，这种变化趋势最为明显，表现为响应曲面较陡，表明加酶量对透明质酸提取率影响显著（P酶解时间酶解温度，在试验范围温度内，酶解温度对透明质酸提取率影响相对不敏感。15参考文献1杨晓燕,贾福星乌贼的综合药用J中国海洋药物,1999,246472刘艺,王和鸣海螵蛸接骨动物实验的组织学研究J中国中医骨伤科,1995,35683窦光宇亦真亦幻话乌贼J百科知识,2007,327284刘智禹,江琴乌贼内脏粉的营养价值及其安全性研究J福建农业学报,2005,2042712745罗瑞明透明质酸HA的国内外研究现状J宁夏农学院学报,2001,22162646黄光斗,赵宇,张方樱等透明质酸的制备与应用研
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