1、本科毕业设计（20_届）酶解法提取牛皮胶原蛋白的条件优化所在学院专业班级食品质量与安全学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录0前言141材料与方法1511实验材料15111原料来源15112酶制剂15113仪器与设备15114试剂1512测定方法15121酶活的测定15122牛皮中胶原蛋白含量的测定1513工艺流程1614操作要点16141原料预处理16142酶法提取牛皮胶原蛋白1615试验方法17151酶及提取介质的选择17152复合酶的复合比确定17153酶提取的单因素实验17154酶提取的最佳工艺条件正交实验172结果与分析1821牛皮中胶原蛋白含量的测定结果18211羟脯氨酸标准曲线
2、的绘制18212牛皮中羟脯氨酸含量的测定结果1822酶活测定结果1923酶及提取介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响1924复合酶的不同复合比对牛皮胶原蛋白提取率的影响2025酶提取的单因素实验结果20251料液比对牛皮胶原蛋白提取率的影响20252酶提时间对牛皮胶原蛋白提取率的影响21253酶提温度对牛皮胶原蛋白提取率的影响22254加酶量对牛皮胶原蛋白提取率的影响23255乙酸浓度对牛皮胶原蛋白提取率的影响2326酶提取的最佳工艺条件正交实验结果243结论25致谢错误未定义书签。参考文献25附录错误未定义书签。摘要胶原蛋白具有良好的物理性能和生物学特性，因而应用于化工、食品、医学等诸多领域。本文
3、以牛肉制品的下脚料牛皮为原料，以胶原蛋白提取率作为指标，比较水和05MOL/L的乙酸溶液两种不同的介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响，得出采用酸酶结合法更利于牛皮胶原蛋白的提取。此外，在酶的选择上通过比较试验，最后选择复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按11酶活比例复合）作为试验用酶。在此基础上，本实验又通过单因素试验和正交试验对牛皮酶解工艺条件进行了优化，实验结果表明酶提取的最优条件为以05MOL/L的乙酸溶液为提取介质，料液比（M/V）为125，酶提温度为42，酶提时间为8H，加酶量为3000U/G，牛皮胶原蛋白的提取率高达9056。关键词牛皮；酶解；胶原蛋白；复合酶ABSTRACTDUETOCOL
4、LAGESMANYFAVORABLEPHYSICALANDBIOLOGICALCHARACTERISTICS,ITHASAWIDERANGEOFAPPLICATIONSINMANYAREASINTHISPAPER,FRESHCOWHIDEASRAWMATERIALANDTHEEXTRACTIONRTEOFCOLLAGENASINDEX,THEENZYMICEXTRACTMETHODCOMBINGWITHACETICACIDISCONSIDERERAWONDERFULMETHODANDGREATLYIMPROVESTHERATE,WHENCOMPARINGTHEENZYMICEXTRACTMET
5、HODCOMBINGWITHWATERONTHECHOICEOFTHEENZYMES,THECOMPOUNDENZYMETHATTHEPEPSINANDTHEPAPAINARECOMPOUNDEDBY11PROPORTIONISREGARDEDASTHEENZYMEOFEXTRACTINGCOLLAGENTHROUGHTHESINGLEFACTOREXPERIMENTANDTHEORTHOGONALEXPERIMENT,THEOPTIMALCONDITIONSARECONFIRMEDEXPERIMENTALRESULTSSHOWTHATTHEOPTIMUMEXTRACTIONCONDITION
6、SAREOBTAINEDASFOLLOW05MOL/LACETICACIDASEXTRACTIONMEDIA,THERATIONOFMATERIALTOLIQUOR125,THEENZYMECONCENTRATIONFOR3000U/G,ANDEXTRACTIONAT42FOR8H,ANDTHEEXTRACTIONRATEOFCOLLAGENIS9056KEYWORDSCOWHIDEENZYMATICEXTRACTIONCOLLAGENTHECOMPOUNDENZYME0前言胶原蛋白是一种白色、不透明、无支链的纤维蛋白质1。胶原蛋白是哺乳动物体内含量最丰富、分布最广泛的蛋白质。胶原蛋白在脊椎动
7、物体内占蛋白质总量2530，占腱和骨骼的细胞外蛋白质总量90以上，其中动物皮中胶原蛋白含量达到50以上2。胶原蛋白是结缔组织极重要的结构蛋白质，是动物结缔组织中的骨、软骨、皮肤、腱、韧等的主要成分，对机体和脏器起着支持、保护、结合以及形成界隔等作用34。胶原蛋白是细胞外基质（ECM）的主要成分，分子量为300KU左右。胶原蛋白最普遍的结构特征是三螺旋结构，其由3条链多肽组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型，3条左手螺旋链相互缠绕成右手螺旋结构形成胶原蛋白独特的三重螺旋结构，使其分子结构非常稳定5。结构决定性质，性质决定用途。正由于胶原蛋白独特的结构，使得胶原蛋白具有独特的生物学性能和重要的生理作
8、用。胶原蛋白具有低免疫原性，生物相容性，可生物降解性等6，另外还具有止血，修复皮肤骨骼以及美容保健等作用7。胶原蛋白结构的多样性和复杂性决定其在许多领域的重要地位，因而胶原蛋白产品具有良好的应用前景。如在生物医学上，胶原蛋白具有能够自发将体外胶原蛋白组装成各种紧密结构的能力，因而是作为组织工程支架、医用敷料系统和药物输送工具的潜在材料89。同时，目前有学者还开始研究胶原蛋白的其他功能，如在去除自由基和降血压等10方面的研究。由于胶原蛋白的诸多优点，因此胶原蛋白的提取一直是研究的热点。胶原蛋白的提取方法通常有酸法、碱法、酶法以及酸、酶结合法和碱、酶结合法等方法1112。在几种胶原蛋白的提取方法中
9、，酸法提取迅速而彻底，但是一些氨基酸会被破坏，如丝氨酸和酪氨酸部分被破坏，同时提取率较低；碱法提取速度很快，但是胶原蛋白结构被破坏，产生消旋作用，同时含羟基和巯基的氨基酸全部被破坏；酶法提取提取对胶原蛋白破坏性小，能更好更完全地得到活性蛋白13。同时，随着生物技术水平的提高，酶制剂的来源广泛，活性也不断提高，价效比也大幅度降低，为其在工业化生产中的应用提供了极大空间，特别是蛋白酶制剂应用已不少见，并取得明显成效。因此，酶法提取胶原蛋白是胶原蛋白生产的一个方向14。但是，一般酶法的水解率不彻底，提取率一般较低，因而目前采用酸酶结合或者碱酶结合来提取胶原蛋白。同时，就目前的消费趋势来看，我国胶原蛋
10、白的需求量逐渐增加，特别是随着人们对饮食和健康的不断重视，因此市场前景较为关阔。另一方面在肉制品和制革加工过程中含有富含胶原物质的副产物（皮、内脏、肉骨头），但是其利用的附加值很低。利用这些废弃物生成胶原蛋白，既实现资源的合理和有价值利用，又实现经济和社会效益的双赢。本实验以牛肉制品的下脚料牛皮为原料，采用酶解法提取牛皮中俄胶原蛋白，同时通过试验条件的优化，得到较优的提取条件，为今后的进一步研究提供参考。1材料与方法11实验材料111原料来源新鲜牛皮宁波莱盛农业科技实业有限公司提供112酶制剂胃蛋白酶生化试剂AMRESCO木瓜蛋白酶生化试剂国药试剂113仪器与设备HWS26型电热恒温水浴锅上海
11、一恒科技有限公司DHG9140AS型电热鼓风干燥箱宁波江南仪器厂ACCULABALC2103电子天平ACCULAB公司T6新锐可见分光光度计北京普析通用有限责任公司RE522旋转蒸发仪上海沪西分析仪器厂PB10PH计德国SARTORIUS公司其他电冰箱，锥形瓶，试管，烧杯等。114试剂L羟脯氨酸生化级上海润成生物科技有限公司高氯酸分析纯国药试剂正丙醇分析纯国药试剂高氯酸分析纯国药试剂异丙醇分析纯国药试剂柠檬酸分析纯国药试剂乙酸钠分析纯国药试剂氯胺T分析纯国药试剂硫酸分析纯国药试剂对二甲基苯甲醛分析纯国药试剂其他为实验室常规试剂12测定方法121酶活的测定酶活力测定按照中华人民共和国专业标准SB
12、/T103171999蛋白酶活力测定法测定。122牛皮中胶原蛋白含量的测定1221实验原理胶原蛋白含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸等，其中羟脯氨酸是胶原蛋白的特有氨基酸，在胶原蛋白中含量固定，通常为10左右。不同来源的生物胶原蛋白含量不同，因此换算系数也不同。例如，水生生物一般采用111，周爱梅等15在研究淡水鱼胶原蛋白提取优化工艺研究中就采用111作为换算系数。而郭恒斌、曾庆祝16在研究酶法提取鱿鱼皮胶原蛋白工艺条件中采用142作为换算系数。查阅相关的资料17，在本实验中决定取100作为牛皮中胶原蛋白的换算系数。胶原蛋白的含量按公式（11）计算牛皮中胶原蛋白的含量羟脯氨酸含量10
13、0（公式11）1222羟脯氨酸标准曲线的绘制按照GB/T9695232008肉与肉制品羟脯氨酸含量的测定的方法绘制标准曲线，空白对照用蒸馏水替代，过程同前。1223样品处理与羟脯氨酸的测定准确称取4G牛皮原料于锥形瓶中，量取30ML左右配置好的3MOL/L硫酸溶液加入锥形瓶中，用表面皿盖住，置于105干燥箱内水解16H。水解结束后用滤纸趁热将水解液过滤到250ML的容量瓶中，再用蒸馏水定容至刻度。按照GB/T9695232008测定稀释后的样品溶液中羟脯氨酸的浓度，样品中的提取出的羟脯氨酸含量计算按公式（12）计算WFCV103公式12式中C标准曲线上相应的羟脯氨酸浓度，G/ML；W提取出的羟
14、脯氨酸含量，MG/G；V稀释后溶液的总体积，ML；M称取样品的质量，G；F稀释倍数。1224胶原蛋白提取率的测定将酶解后的溶液进行离心收集上清液，测定上清液体积，并从上清液中吸取50ML于锥形瓶中，分别加入50ML3MOL/L的硫酸并用表面皿盖住，放入105烘箱中水解16H，将水解液转移至100ML容量瓶定容至刻度；吸取50ML上述溶液定容至100ML。其余各步按GB/T9695232008测定其羟脯氨酸测定法操作18。提取率的计算公式为提取率（）溶液中羟脯氨酸的浓度体积稀释倍数/牛皮中羟脯氨酸的含量100（公式13）13工艺流程新鲜牛皮原料整理原料预处理酶法提取牛皮胶原蛋白胶原蛋白提取率测定
15、14操作要点141原料预处理1411去脂肪在对原料进行酶解之前，一般需要对原料进行预处理。脱脂是预处理的一部分。提取胶原蛋白的过程中，需要尽可能的去除脂肪组织。因为在胶原蛋白中一旦有脂质的混入以后不管是进行中性还是酸性溶解都很难把脂肪去除，最后得到乳浊状的胶原蛋白，最终影响产物的纯度19。查阅资料，通常使用的脱脂方法有有机溶剂浸泡脱脂16与碳酸钠浸泡脱脂。本实验采用6碳酸钠溶液浸泡脱脂20H。1412去杂蛋白在原料预处理中，除了要对原料去脂肪外，还需要对原料进行去杂蛋白。从查阅的资料15来看，在提取胶原蛋白过程中用得最多的除杂蛋白试剂是氯化钠溶液。本实验以5氯化钠溶液为去牛皮杂蛋白溶液，按11
16、5混合，室温下浸泡12小时除去盐溶性非胶原成分，再用清水冲洗牛皮数次去除残留氯化钠，沥干后捣碎备用。142酶法提取牛皮胶原蛋白将预处理好的碎牛皮置于某种提取介质，以一定的料液比进行混合，加入适量的酶，在适宜的温度下酶提一定时间。酶提结束后，将酶解液离心收集上清液进行提取率的测定。15试验方法151酶及提取介质的选择将预处理的牛皮原料以相同的量称取三份，以水为介质，分别加入3000U/G的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按11酶活比例复合），以125的料液比，温度为37，提取8H后测定提取率。其中胃蛋白酶的PH调节为25。再以相同的量称取预处理的牛皮原料三份，以05MOL/L
17、乙酸溶液为介质，分别加入加酶量为3000U/G的胃蛋白酶、木瓜蛋白酶以及复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按11酶活比例复合），以125的料液比，温度为37，提取8H后测定提取率。对这两组实验比较后，选择合适的提取介质和酶。152复合酶的复合比确定将预处理的牛皮原料以相同的量称取三份，分别加入加酶量为3000U/G的复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按11酶活比例复合）、复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按12酶活比例复合）、复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按21酶活比例复合），以105MOL/L乙酸溶液为介质，料液比为125，温度为37，提取8H后测定提取率，选择合适的复合比。153酶提取的单因素实验1531料液
18、比的选择根据以上确定的05MOL/L的乙酸溶液作为提取介质，以及实验所得的复合酶作为试验用酶，将预处理的牛皮原料以相同的量称取五份，在37下，加酶量为3000U/G，提取时间为8H,分别以115，120,125，130，135的料液比下提取牛皮中的胶原蛋白。评价不同料液比对牛皮胶原蛋白的提取率影响，选定最适的料液比。1532酶提时间的选择根据以上确定的料液比，将预处理的牛皮原料以相同的量称取五份，以05MOL/L的乙酸溶液作为提取介质，在37下，加酶量为3000U/G,分别以4，6，8，10，12的酶提时间下提取牛皮中的胶原蛋白。评价不同酶提时间牛皮胶原蛋白提取率的影响，选定最适的浸提时间。1
19、533酶提温度的选择根据以上确定的料液比和酶提时间，将预处理的牛皮原料以相同的量称取七份，以05MOL/L的乙酸溶液作为提取介质，加酶量为3000U/G，分别以4，15，27，32，37,42,47的酶提温度下提取牛皮中的胶原蛋白。评价不同酶提温度对牛皮胶原蛋白提取率的影响，选定最适的浸提温度。1534复合酶添加量的选择根据以上确定的料液比、浸提时间和浸提温度下，将预处理的牛皮原料以相同的量称取五份，以05MOL/L的乙酸溶液作为提取介质，分别以1000U/G、2000U/G、3000U/G、4000U/G、5000U/G的加酶量下提取牛皮中的胶原蛋白。评价不同的复合酶添加量对牛皮胶原蛋白提取
20、率的影响，选定最适的加酶量。1535乙酸浓度的选择根据以上确定的料液比、浸提时间、浸提温度和加酶量下，将预处理的牛皮原料以相同的量称取五份，分别以01MOL/L、03MOL/L、05MOL/L、07MOL/L、09MOL/L的乙酸浓度下提取牛皮中的胶原蛋白。评价不同的乙酸浓度对牛皮胶原蛋白提取率的影响，选定最适的乙酸浓度。154酶提取的最佳工艺条件正交实验在单因素试验的基础上，以胶原蛋白的提取率为指标采用正交试验对提取工艺进行优化，其因素与水平见表11，按L934正交表进行正交试验。表11正交试验因素水平表TAB11THEFACTORSANDLEVELSOFORTHOGONALEXPERIME
21、NT水平因素A酶提温度（）B酶提时间（H）加酶量（U/G）13762000242830003471040002结果与分析21牛皮中胶原蛋白含量的测定结果211羟脯氨酸标准曲线的绘制按照GB/T9695232008肉与肉制品羟脯氨酸含量的测定的方法，以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，结果见图21Y02014X0001R20999900102030405005115225羟脯氨酸浓度（UG/ML）AU558图21羟脯氨酸标准曲线FIG21THESTANDARDCURVESOFHYDROXYPROLINE如图21所示，羟脯氨酸标准样品的回归方程为Y02014X0001，Y为吸光度值
22、，X为羟脯氨酸的浓度。羟脯氨酸浓度与光密度值几乎呈直线相关（R209999）。因此，由此标准回归方程计算羟脯氨酸浓度准确可靠。212牛皮中羟脯氨酸含量的测定结果将牛皮按1223的方法处理后，于558NM处测定其吸光值，从标准曲线上查出其相应的浓度，按照公式（22）计算出牛皮中羟脯氨酸的含量，结果见表21。从表21中可知，牛皮中羟脯氨酸含量的平均值为287。羟脯氨酸为胶原蛋白的特异氨基酸，根据公式（11）计算牛皮中胶原蛋白的含量。计算可得胶原蛋白的平均含量为287，占牛皮总质量的1/4以上。表21牛皮中羟脯氨酸含量的测定结果TAB21THECONTENTOFHYDROXYPROLINEINCAT
23、TLESKIN编号样品质量（G）吸光值A558浓度C（UG/ML）含量（）14100375185728924260389192628333940367181828822酶活测定结果根据中华人民共和国专业标准SB/T103171999蛋白酶活力测定法，实验测得所用胃蛋白酶的酶活力为378103U/G，木瓜蛋白酶的酶活力为663103U/MG。23酶及提取介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响实验中分别采用水和05MOL/L乙酸溶液作为提取介质，以木瓜蛋白酶、胃蛋白酶以及复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按11酶活比例复合）三种酶作为试验酶，在加酶量为3000U/G，温度为37，提取时间为8H，料液比为125下
24、提取牛皮中的胶原蛋白。提取结束后，按照143的方法测定牛皮中胶原蛋白的提取率，比较酶和提取介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响，结果见图22。2245249113567831777670102030405060708090胃蛋白酶木瓜蛋白酶复合酶（木胃为11）酶种类胶原蛋白提取率（）水介质乙酸介质图22酶及提取介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响FIG22EFFECTOFENZYMEANDMEDIUMONEXTRACTIONOFCOLLAGEN不同的酶对牛皮酶解效果的影响很大。在常用的蛋白酶中，胃蛋白酶常常被用来提取动物组织中的胶原，此外也有用木瓜蛋白酶和胰酶提取胶原蛋白的报道。本实验中选择了胃蛋白酶、木
25、瓜蛋白酶和复合酶来提取牛皮中的胶原蛋白。从图22可以看出，在以水为介质中，木瓜蛋白酶的提取率比胃蛋白酶的提取率略高。这与王川、李燕、马志英等20在研究不同酶对猪皮胶原蛋白提取率的影响的结果一致。同时，从图中所示，复合酶的提取率比木瓜蛋白酶与胃蛋白酶的提取率低很多。分析原因可能为一方面，复合酶提取时的PH值适合木瓜蛋白酶的酶解作用，但是不适合胃蛋白酶的发挥作用。根据文献2122查得，胃蛋白酶作用的最适PH值在1525之间，木瓜蛋白酶对酶解作用最适PH为5而复合酶提取时的PH值为中性，因而胃蛋白酶的活性受抑制。另一方面，复合酶中的木瓜蛋白酶含量比第二组的木瓜蛋白酶含量低。而以05MOL/L的乙酸溶
26、液作为介质时，胃蛋白的提取率高于木瓜蛋白酶的提取率，这与所查得文献14一致。可能原因为05MOL/L的乙酸溶液PH在23之间，接近于胃蛋白酶的最适PH，利于胃蛋白酶发挥作用；而对于木瓜蛋白酶而言，此环境略偏酸性，会使木瓜蛋白酶的作用有所抑制。此外，从图中很明显看出，复合酶的提取率最高，与以水介质时的情况相反。可能原因是一开始时，胃蛋白酶活性较高，发挥作用；随着酶解过程的进行，溶液PH有所升高，使得木瓜蛋白酶活性增强，两种酶一起作用，使得酶解效果更佳，胶原蛋白提取率得到提高。因此以下实验选择复合酶作为实验的酶制剂。同时，不同的提取介质对酶解效果也存在着影响。目前，在酶解法提取胶原蛋白中，一般结合
27、酸性条件下进行酶解。根据查阅的文献23，通过酸性膨胀并结合酶的作用，既可以保证胶原蛋白结构的完整性，又可以提高胶原蛋白的提取率。因此，本次实验中分别以水和05MOL/L的乙酸溶液作为提取介质，比较不同的提取介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响。由图22可知，以05MOL/L的乙酸溶液作为介质时的提取率远远高于以水作为介质时的提取率。因此，以下实验中选择05MOL/L的乙酸溶液作为提取介质。24复合酶的不同复合比对牛皮胶原蛋白提取率的影响将预处理的牛皮原料分为三份，分别加入不同复合比的复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶分别按11，12，21酶活比例复合），在以05MOL/L乙酸溶液为提取介质，加酶量为300
28、0U/G，料液比为125，温度为37，提取时间为8H下进行牛皮胶原蛋白的提取，研究不同复合比对牛皮胶原蛋白提取率的影响，结果如图23747694784505560657075808590复合酶（木胃为12）复合酶（木胃为21）复合酶（木胃为11）复合酶的复合比胶原蛋白提取率（）复合比图23复合酶的复合比对牛皮胶原蛋白提取率的影响FIG23EFFECTOFDIFFERENTCOMPOUNDPROPORTIONONEXTRACTIONOFCOLLAGEN从图23中，可以看出，木瓜蛋白酶与胃蛋白酶酶活比为11复合时提取率最高，因此确定复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按11酶活比例复合，以下统称为复合酶）
29、作为酶制剂来提取牛皮中的胶原蛋白。25酶提取的单因素实验结果251料液比对牛皮胶原蛋白提取率的影响以05MOL/L的乙酸溶液为介质，加酶量为3000U/G，浸提时间为8H，温度为37下，考察不同料液比对牛皮胶原蛋白提取率的影响，结果见图24。65757082799265435921505560657075808590115120125130135料液比M/V胶原蛋白提取率（）料液比图24料液比对牛皮胶原蛋白提取率的影响FIG24EFFECTOFDIFFERENTSOLIDLIQUIDRATIOONEXTRACTIONOFCOLLAGEN由图24可知，料液比（M/V）在115135范围内，随着提
30、取介质的增加，提取率不断增加，当料液比在125时达到最大值；但当提取介质继续增加时，提取率开始缓慢降低。产生该现象的原因可能是随之提取介质的增加，底物浓度随之降低。当底物浓度较高时，提取一段时间后溶液中胶原蛋白达到较大值，但是溶液较粘稠，必然会影响胶原蛋白的溶解；当底物浓度降低到一定程度后，溶液较稀，对胶原的继续溶解影响较小；同时酶与底物的接触机率降低，酶与底物的作用减少使得提取率降低24。因此，从提高提取率、减少醋酸溶液用量和降低后续操作负荷的角度考虑，料液比控制在125左右。总体上看，料液比对提取率的提高不是很明显。252酶提时间对牛皮胶原蛋白提取率的影响以05MOL/L的乙酸溶液为介质，
31、加酶量为3000U/G，温度为37，料液比为125（M/V），研究不同酶提时间对牛皮中胶原蛋白提取率的影响，结果见图25。由图25可知，在前8H内随酶提时间延长，胶原蛋白提取率增加较快，超过8H提取率增加缓慢。分析原因当提取时间较少时，牛皮中的胶原蛋白还没有完全溶解到溶液中，因此随着时间的增加胶原蛋白的提取率也会增加；胶原蛋白的提取率达到某一极限值后，再增加提取时间，胶原的提取率也不会有明显的增加20。因此，为缩短提取工艺周期，提高生产效率，提取时间应控制在8H以内。291747188066800979070204060801002468101214酶提时间（H）胶原蛋白提取率（）酶提时间图2
32、5酶提时间对牛皮胶原蛋白提取率的影响FIG25EFFECTOFDIFFERENTIMMERSIONTIMEONEXTRACTIONOFCOLLAGEN253酶提温度对牛皮胶原蛋白提取率的影响确定酶提时间为8H，以05MOL/L乙酸溶液为介质，加酶量为3000U/G，料液比为125（M/V），研究不同酶提温度对牛皮中胶原蛋白提取率的影响，结果见图26。19242386360263475899156947901020304050607080901000102030405060酶提温度（）胶原蛋白提取率（）酶提温度图26酶提温度对牛皮胶原蛋白提取率的影响FIG26EFFECTOFDIFFERENTI
33、MMERSIONTEMPERATUREONEXTRACTIONOFCOLLAGEN由图26可知，当温度在30以下时，随着温度的增加提取率相应增加，但是增加速率较慢；当温度在3040左右，随着温度的增加，提取率增加较快；到超过40后，增加速率比较缓慢。分析原因根据查得文献得，胃蛋白酶的最适温度在37，木瓜蛋白酶的最适温度在60。当温度低于30时，两种酶的活性受到抑制，无法正常发挥作用；当温度在3040左右，达到胃蛋白酶的最适温度，同时靠近木瓜蛋白酶的最适温度，因此提取速率增加加快；当温度超过45后，可能部分胃蛋白酶失活，同时胶原蛋白也可能发生变性，因此增加速率较缓慢。从提高提取率兼顾节省成本角度
34、考虑，可选用42作为提取温度。254加酶量对牛皮胶原蛋白提取率的影响以42作为酶提温度，以05MOL/L乙酸溶液为介质，确定酶提时间为8H，料液比为125（M/V），研究不同加酶量对牛皮中胶原蛋白提取率的影响，结果见图27。从图27所示，随着加酶量的增加，胶原蛋白的提取率增加速率较快；当达到3000U/G时，达到最大值；但当加酶量继续增加时，增加很缓慢，几乎在同一条直线上。分析原因当加酶量较小时，底物浓度相对较大，足以使酶饱和，在此种情况下，反应速度与酶浓度成正比，因此，当酶用量增加时，酶解反应的速度随之增加，提取率增加较快；当酶用量增加到一定程度后，底物浓度不足以使酶饱和，在增加酶用量也不会
35、使反应速度明显增加,这与查得的文献25类似。故从节约成本的角度考虑，复合酶的加酶量选择在3000U/G。60677223899690769118505560657075808590950100020003000400050006000加酶量（U/G）胶原蛋白提取率（）加酶量图27加酶量对牛皮胶原蛋白提取率的影响FIG27EFFECTOFDIFFERENTENZYMECONCENTRATIONONEXTRACTIONOFCOLLAGEN255乙酸浓度对牛皮胶原蛋白提取率的影响在加酶量为3000U/G，酶提温度为42，酶提时间为8H，料液比为125（M/V）下，研究不同乙酸浓度对牛皮中胶原蛋白提取
36、率的影响，结果见图28。从图28所示，不同的乙酸浓度会影响牛皮中胶原蛋白的提取率。乙酸浓度在0507MOL/L时，提取率较高，低于05MOL/L或者高于07MOL/L时，提取率有所降低。分析原因当乙酸浓度低于05MOL/L时，PH值有所提高，适合木瓜蛋白酶的作用，但是不适合胃蛋白酶发挥作用，提取率有所限制；当高于07MOL/L，酸性较强，木瓜蛋白酶活性受抑制，提取率无法提高；总体上而言，乙酸浓度对牛皮中胶原蛋白提取率的影响不是很明显。在本实验中，从乙酸用量的角度和提取率的角度，选择05MOL/L的乙酸溶液作为提取介质。77678462919910879770758085909501030507
37、09乙酸浓度（MOL/L）胶原蛋白提取率（）乙酸浓度图28乙酸浓度对牛皮胶原蛋白提取率的影响FIG28EFFECTOFACETICACIDCONCENTRATIONONEXTRACTIONOFCOLLAGEN26酶提取的最佳工艺条件正交实验结果在单因素试验的基础上采用正交试验对酶解工艺进行优化，按L934正交表进行正交，结果见表22。表22正交试验的结果与分析TAB22THERESULTSANALYSISOFORTHOGONALEXPERIMENT序号因素水平提取率（）A（）B（H）CU/G空白11111443821222760231333908142123696352231907862312
38、6621731329573832137477933217804K1211212097418536K2226622415722369K3248542350627732K1704069916178K2755480527456K3828478359244R124410613066QA3B2C3从表22可以看出，三个因素对胶原蛋白提取率的影响依次为CAB,优化所得条件为A3B2C3，即酶提温度为47，酶提时间为8H，加酶量为4000U/G。但从极差分析的三个平均值（K值）来看，温度的后两个水平相差不大，同时从经济与实际应用的角度考虑，酶提温度应选42，酶提时间为8H,加酶量为4000U/G通过验证实验
39、，测得在此条件下酶提牛皮中胶原蛋白的提取率为9056。3结论31实验结果表明，牛皮中羟脯氨酸的含量为287，胶原蛋白的含量为287，占牛皮总重量的1/4以上。32实验中比较水和05MOL/L的乙酸溶液两种不同的介质对牛皮胶原蛋白提取率的影响，得出采用酸酶结合法更利于牛皮胶原蛋白的提取。33在酶的选择上，实验中分别比较胃蛋白酶、木瓜蛋白酶这两种单酶与复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按11酶活比例复合）的胶原蛋白提取效果，得出复合酶更利于牛皮胶原蛋白的提取。同时，实验中探索了复合酶不同的复合比对胶原蛋白提取率的影响，最后选择复合酶（木瓜蛋白酶与胃蛋白酶按11酶活比例复合）作为试验用酶。34在单因素和正
40、交实验的基础上并结合实际综合考虑，得到最佳的酶解工艺条件为以05MOL/L的乙酸溶液为提取介质，料液比（M/V）为125，酶提温度为42，酶提时间为8H，加酶量为3000U/G，胶原蛋白的提取率为9056。参考文献1李二凤,何小维,罗志刚胶原蛋白的提取工艺研究J食品研究与开发,2006,2764672付强胶原高得率提取法及胶原膜性能的研究C四川大学硕士学位论文四川四川大学,2006253廖艳阳胶原蛋白的研究进展J长沙大学学报,2009,23536384王丹胶原蛋白在食品工业中的应用J农产食品科技,2009,324850,545郭文宇,代敏,杨丽红等水生动物与陆生动物皮胶原特性及应用前景J中国皮
41、革,2007,361755576王丽娜,黄素珍胶原蛋白的研究进展J肉类研究,2010,116217曹荣安,李浩,李良玉等胶原蛋白的生理功能特性及其应用J肉类工业,2010,1798卢晓林胶原蛋白在医学中的应用研究现状J口腔医学研究,2009,258068089KHARAGPURFISHCOLLAGENAPOTENTIALMATERIALFORBIOMEDICALAPPLICATIONJIEEE,2010343810SMORIMURAA,HNAGATAA,YUEMURAB,AFAHMI,ATCDEVELOPMENTOFANEFFECTIVEPROCESSFORUTILIZATIONOFCOLLA
42、GENFROMLIVESTOCKANDFISHWASTEJPROCESSBIOCHEMISTRY,2002,371403141211许亮酶法水解牛皮制备胶原的关键因素研究C四川大学硕士学位论文四川四川大学,20062512郭恒斌,曾庆祝水产胶原蛋白的功能特性及其制备与应用J农产食品科技,2007,13465013肖世维,但年华,曾睿等从动物皮中提取胶原蛋白的方法J西部皮革,2009,31172114施辉阳酶法提取生猪皮胶原的研究C北京化工大学硕士学位论文北京北京化工大学,200491015周爱梅,张培丽,刘欣等淡水鱼皮胶原蛋白提取优化工艺研究J食品与发酵工业,2007,3311311616郭恒
43、斌,曾庆祝酶法提取鱿鱼胶原蛋白工艺条件的研究J南方水产,2008,4586317沈菊泉,汤俊,沈亚领等酸法制备牛皮胶原蛋白及其结构性质研究J食品工业,2009,4434618周玉惠,叶正涛,肖立芳等猪皮胶原蛋白的提取及其结构表征J湖北大学学报,2008,3028728919李二凤,何小维,罗志刚胶原蛋白的提取工艺研究J食品研究与开发2006,27646720王川,李燕,马志英等几种酶法从猪皮中提取胶原蛋白的对比研究J食品科学,2007,2820120521刘苏锐,王坤余,琚海燕猪皮型胶原蛋白的提取及其结构表征J中国皮革,2007,367434722李彦春,靳立强,危东发酶法提取牛皮胶原蛋白的研究J中国皮革,2002,32236923许亮,周荣清,石碧胃蛋白酶水解牛皮胶原成分的动力学研究J皮革科学与工程,2006,162293224胡二坤,郭兴凤,谭凤艳等猪皮中胶原蛋白的提取J河南工业大学学报,2006,271505325赵胜年,周兵,耿嘉琦等酶法水解鲜牛骨骼的研究J食品科学,1995,16103841
