1、本科毕业设计（20_届）鮸鱼VIBRIOPONTICUS的分离鉴定所在学院专业班级水产养殖学学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言12材料与方法错误未定义书签。21材料122病原菌的分离223菌体形态观察及常规生理生化鉴定224病原菌的回归感染225药物敏感性实验226细菌基因组序列扩增，测序和分析2261细菌基因组DNA提取2262PCR扩增2263扩增产物的检测和克隆2264序列分析23结果和分析231形态观察及常规生理生化鉴定232病原菌的回归感染433药物敏感性实验434细菌基因组序列扩增、测序和分析54讨论55总结7致谢7参考文献8摘要该论文主要是鉴定一株分离自鮸鱼的菌株。主
2、要采用了TCBS平板分离优势菌，形态学观察，生理生化特征测定，回归感染试验，计算LD50，药敏试验测定，16SRRNA序列分析鉴定细菌等鉴定此分离物。通过上述鉴定，该菌株MIIUYCROAKERY090909为革兰氏阴性，直杆，在25下TCBS琼脂上培养菌落呈黄色的。菌株能在无气条件下发酵葡萄糖，氧化酶和过氧化氢酶阳性。它们生长需钠离子，不能再不添加NACL的培养基上生长。能8浓度NACL下生长，不能再10浓度NACL下生长。16SRRNA序列表明与VIBRIOPONTICUS形成一簇，亲缘关系最近。本文主要就鮸鱼VIBRIOPONTICUS病菌的生理生化、药敏实验及16SRRNA序列做了简单
3、研究，希望能对将来的研究有参考价值。关键词VIBRIOPONTICUS；鮸鱼；常规生理生化鉴定；药物敏感性实验；16SRRNA测序和分析ABSTRACTTOIDENTIFYANDCHARACTERIZATIONOFASTRAINFROMTHESPLEENOFMIIUYCROAKERINTHISSTUDY,WEUSEDCONVENTIONALBIOCHEMICALIDENTIFICATION,EXPERIMENTALINFECTION,DRUGSENSITIVITYTESTS,16SRRNASEQUENCINGANDANALYSIS,ETCTHISEXPERIMENTUSEDTCBSPLATET
4、OISOLATETHEDOMINANTBACTERIATHEMORPHOLOGYISGRAMNEGATIVEANDSTRAIGHTRODTHECOLONIESWEREYELLOWONTCBSIN25OXIDASEANDCATALASEWEREPOSITVEITCANGROWONTHEPLATEWITH8NACL,BUTNOTGROWONTHEPLATEWITH10NACL16SRRNASEQUENCESANALYSISREVEALEDTHATITWASGROUPEDWITHVIBRIOPONTICUSTHEISOLATESFROMTHESPLEENOFMIIUYCROAKERISVIBRIOP
5、ONTICUSINTHISPAPER,THERESULTSFROMTHEEXPERIMENTSWILLBEOFTHEREFERENCEVALUEFORFUTURERESEARCHKEYWORDSVIBRIOPONTICUSMIICHTHYSMIIUYBASILEWSKYCONVENTIONALBIOCHEMICALIDENTIFICATIONEXPERIMENTALINFECTION16SRRNASEQUENCINGANDANALYSIS31引言鮸鱼（MIICHTHYSMIIUYBASILEWSKY），一作米鱼，形似鲈鱼，但肉质略粗糙，体色发暗，灰褐并带有紫绿色，腹部灰白。背鳍鳍棘上缘黑色，鳍
6、条部中央有一纵行黑色条纹。胸鳍腋部上方有一晴斑。其余各鳍灰黑色。鮸鱼体形为两侧扁平向后延长状，背、腹部浅弧形。鮸鱼分布于北太平洋西部，包括中国的渤海、黄海及东海，朝鲜和日本南部。中国沿海主要产鮸鱼的渔场有广东潮汕鱼场福建平潭岛和兄弟岛，浙江岱山和舟山群岛，江苏大沙渔场，山东沿海和渤海，尤以东海的舟山群岛产量最大，是宁波一带的海渔特产之一。鮸鱼的主要捕捞方法为底拖网或延绳钓，冬春之际产量较高。每年农历68月为舟山群岛鮸鱼的渔汛期，渔汛期鮸鱼以春季生殖洄游和冬季越冬洄游为主，7月为旺汛。每逢大潮汛，渔船竞相出海作业，晨出晚归，捕获甚丰。鮸鱼肉味鲜美，为海产经济鱼类之一，也是经济价值较高的鱼类。除鲜
7、食外，肉是作鱼丸、敲鱼面的上等原料，在温州颇有盛名；全鱼还可制作罐头或加工成鮸鱼鲞；鱼鳔可制鱼胶，有较高的药用价值，具养血、补肾、润肺健脾和消炎作用；鱼鳞可制鳞胶；内脏、骨可制鱼粉、鱼油；耳石有清热去瘀、利尿的作用。鮸鱼还是我国的出口鱼类品种，每年通过浙江、上海、江苏、辽宁等出口口岸大量输往日本、香港、澳门等国家和地区。鮸鱼性甘、咸、平，有养血、止血、补肾固精、润肺健脾和消炎功效。对治疗再生障碍性贫血，吐血，肾虚遗精，疮疖、痛肿、无名肿毒、乳腺炎等有效。鮸鱼的耳石有清热去瘀、利尿的作用；鮸鱼鳔俗称鮸鱼胶或鳘肚，具有养血、补肾、润肺健脾和消炎作用；采用鮸鱼鳔，与当归、红枣适量煎汤，长期坚持食用，
8、对再生障碍性贫血有一定疗效。鮸鱼鳔的与等量的酒和水了炖食，可治疗男子遗精和女子白带了。随着鮸鱼养殖规模的不断扩大，由于养殖密度过高，养殖区域水质恶化严重，以及鮸鱼经过多代人工繁殖造成性状退化，导致机体抵抗力下降等原因,病害频繁发生且日趋严重。近年流行的病害主要是细菌性疾病弧菌病、肠炎病、烂鳃病等、寄生虫病纤毛虫、指环虫等、水霉病等。其中由弧菌属细菌引起的疾病，危害最为严重，每年都给养殖从业者造成了极大的经济损失。弧菌病是一种常见的水产动物疾病，在世界各地具有较高的死亡率。弧菌属有近20个种，包括副溶血性弧菌，霍乱弧菌，创伤弧菌和鳗弧菌。一些新的海洋病原弧菌属，已在近几年被报告。我们可以确定在不
9、久的未来，随着流行病学研究的不断发展，更多病菌很可能将更多的被发现和鉴定。鮸鱼弧菌病的病原主要为哈氏弧菌VIBRIOHARVEYI。弧菌属的多种弧菌均能引起养殖鱼类弧菌病，症状表现为多种多样溃疡、烂尾、腹水、烂眼等，其中溃疡和烂尾是最常见的症状13。这是一种病程短、范围广、死亡率高的疾病，流行时间为610月，78月为高峰期，一般死亡率为3040最高可达80以上。在典型的发病网箱内，从出现少量病鱼到大部分发病死亡历时约7D。致病菌的准确快速鉴定是鱼病防治的基础，如何快速准确检测养殖鮸鱼弧菌病，已成为当前鮸鱼养殖业十分重要而突出的问题。VIBRIOPONTICUS是弧菌属的一员，2004年发现的一
10、个新种。目前关于此类鮸鱼弧菌病的研究主要是对该菌的分离鉴定以及该菌的致病性还有一些基本的培养特性，其他方面如免疫学、病理学等方面很少涉及。然而作为新发现的海洋致病菌，对其的研究有着极其重要的经济价值和生态价值。本文主要通过传统方法及16SRRNA序列分析的方法鉴定分离自鮸鱼的细菌，分别从生理生化、药敏实验和16SRRNA序列分析等方面鉴定该菌株为VPONTICUS。2实验方法21主要试剂和仪器离心机和超低温冰柜均购自德国THERMO公司，恒温振荡器购自江苏省华利达试验设备公司，电热恒温培养箱购自日本EYELA公司，高压蒸汽灭菌锅购自日本ALP公司，PCR仪购自美国BIORAD公司；普通营养琼脂
11、和TCBS培养基、药敏纸片（链霉素、新生霉素、氯霉素、四环素、青霉素G、先锋霉素V、头咆哌酮、羧苄青霉素和氨苄青霉素共10种）（杭州天河微生物试剂有限公司）和细菌微量生化反应管（乳糖、木糖、肌醇、VP试验、MR试验、靛基质试验、蔗糖、鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶等共38种）均购置杭州天河微生物试剂有限公司；T4DNA连接酶、PMD19T载体和EXTAQ聚合酶等均购自TAKARA公司。422病原菌的分离样品选取症状典型的濒死病鱼。无菌条件下取病鱼体表溃疡、肝、脾、肾等部位作为材料，用普通营养琼脂和TCBS平板做细菌分离，置28C培养24H。结果从被检材料中分离到纯度一致的菌株，命名为MIIUYCR
12、OAKERY090909，纯培养后70C保存备用。23菌体形态观察及常规生理生化鉴定用普通光镜观察分离细菌的形态。参照常见细菌系统鉴定手册和伯杰氏细菌学鉴定手册方法对其进行生理生化特征测定。取分离的纯培养菌，接种于普通液体培养基中，并放置于28的摇床中培养24H，使用细菌微量生化反应管测定鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、半乳糖苷（ONPG）、氧化酶、接触酶、乳糖、木糖、蔗糖、半乳糖、鼠李糖、甘露糖、麦芽糖、阿拉伯糖、蜜二糖、葡萄糖、甘露醇、肌醇、山梨醇、丙二盐酸、明胶、硫化氢、尿素、七叶苷、水杨素、葡萄糖（产气）、葡萄糖磷酸盐VP试验、蛋白胨水（靛基质）、葡萄糖磷酸盐（MR试验）、
13、葡萄糖酸盐、西蒙氏枸橼酸盐的生理生化特性测定，以及分离病原菌在无盐胨水、3氯化钠胨水、6氯化钠胨水、8氯化钠胨水、10氯化钠胨水的生长状况。24病原菌的回归感染选择无外伤、游动活泼，重量在200G左右的健康鮸鱼作为供试鱼，将鮸鱼置于塑料桶中暂养1周，稳定后随机分组进行试验，每4尾鱼为1组。试验用水为天然海水，水温为201。分别取01ML菌悬液，对试验组鱼进行腹腔注射感染，同时给对照组鱼腹腔注射无菌生理盐水01ML。试验期间连续充气，每天换水1次，投饵1次。人工感染后连续观察7D，连续观察鱼的体色、活动力、摄食、发病症状和死亡情况。用酒精棉球对病鱼的体表消毒，对濒死病鱼进行病理变化检验，然后在无
14、菌条件下取下肌肉、肾、肝和脾等部位的组织小块划线接种于TCBS培养基平板，在28下恒温倒置培养24H。挑取平板中形态特征一致的优势菌，接种于TCBS培养及平板，在28下恒温倒置培养24H，观察菌落形态。25药物敏感性实验用药敏纸片法在普通营养琼脂平板上测定鮸鱼病原菌对药物的敏感性。在28恒温培养24H后，测量抑菌圈直径大小。再根据纸片法药敏试验抑菌圈直径判断标准得出对各种抗菌药物的敏感性。26细菌基因组序列扩增、测序和分析261细菌基因组DNA提取采用WILSON描述的方法提取鮸鱼病原菌的基因组DNA作为模板。262PCR扩增16SRRNA基因PCR扩增所需要的两个引物为16S（）5AGAGT
15、TTGATCATGGCTCAG3、16S（）5GGTTACCTTGTTACGACTT3。在20L的PCR反应体系中含有引物各02L，模板DNA1L，25U/L的TAQDNA聚合酶02L，4DNTP混合物04L，1PCR缓冲液2L，无菌蒸馏水144L，15MMOL/LMGCL216L。PCR反应条件为94预变性3MIN，接着94变性30S、55复性1MIN和72延伸2MIN如此30个循环后，72温育6MIN。263扩增产物的检测和克隆琼脂糖凝胶检测PCR产物，预期大小的扩增条带回收后克隆至PMD19T载体，序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成。264序列分析采用CLUSTALW程序进行多重序列
16、比对后，用MEGA40软件构建系统进化树。3结果及分析31形态观察及常规生理生化鉴定菌株为革兰氏阴性菌（见图1），直杆，长度约30M，宽度约15M，有12根极生鞭毛。菌落光滑，圆形，无色素，不发光，不泳动。它们培养基上培养在25下，经48小时，长出的菌落为23MM。在255下TCBS琼脂上培养48小时后是黄色的。菌株生长需要NA。能在8NACL条件下能生长，不能在10NACL中生长。在4、40下不生长。图1优势菌革兰氏染色100XFIG1GRAMSTAINOFTHEDOMINANTBACTERIA100X生理生化特征对半乳糖，甘露糖，甘露醇，麦芽糖，葡萄糖磷酸盐（MR），赖氨酸脱羧酶，赖氨酸脱
17、羧酶，精氨酸双水解酶，氧化酶，接触酶等显阳性；对乳糖，木糖，肌醇，蔗糖，山梨醇，鼠李糖，丙二盐酸，阿拉伯糖，明胶，蜜二糖，硫化氢，葡萄糖磷酸盐VP，西蒙氏枸橼酸盐，蛋白胨水（靛基质），半乳糖苷（ONPG），尿素，七叶苷，水杨素等显阴性（见表1）。表1VIBROPONTICUS常规生理生化鉴定TAB1PHYSIOLOGICALANDBIOCHEMICALCHARACTERISTICSOFISOLATES编号NUMBER产品名称PRODUCTNAME现象描述DESCRIPTIONOFTHPHENOMENON结果RESULTS01乳糖LACTOSE无变化（紫）02木糖XYLOSE无变化（紫）03肌醇
18、INOSITOL无变化（紫）04蔗糖UCROSE无变化（紫）05半乳糖GALACTOSE紫变黄06山梨醇SORBITOL无变化（紫）07鼠李糖RHAMNOSE无变化（紫）08甘露糖ANNOSE紫变黄09甘露醇ANNITOL紫变黄10麦芽糖ALTOSE紫红变黄11丙二盐酸UCROSE无变化（黄绿）12阿拉伯糖RABINOSE无变化（紫）13明胶GELATIN4度下呈固态14蜜二糖MELIBIOSE无变化（紫）15硫化氢HYDROGENSULFIDE未变黑16葡萄糖GLUCOSEOXIDATION由蓝色均变黄17葡萄糖酸盐GLUCONATE蓝变黄6续表118葡萄糖（产气）GLUCOSEGAS产气1
19、9葡萄糖磷酸盐GLUCOSEPHOSPHATEVP无变化20葡萄糖磷酸盐GLUCOSEPHOSPHATEMR变红21鸟氨酸脱羧酶ORNITHINEDECARBOXYLASE无变化（黄）22赖氨酸脱羧酶LYSINEDECARBOXYLASE由蓝色均变黄23西蒙氏枸橼酸盐GLUCOSEOXIDATION无变化（绿）24蛋白胨水（靛基质）PEPTONEWATERINDOLE无变化25精氨酸双水解酶DOUBLEARGININEHYDROLASE黄变红26半乳糖苷GALACTOSIDASEONPG无变化（黄）27氧化酶OXIDASE变紫红色28尿素UREA无变化（黄）29七叶苷AESCINGLYCOSI
20、DES无变化30水杨素SALICIN无变化31接触酶CATALASE产气32无盐胨水SALTFREEPEPTONEWATER不生长333氯化钠胨水3NACLPEPTONEWATER生长346氯化钠胨水6NACLPEPTONEWATER生长358氯化钠胨水8NACLPEPTONEWATER不生长3610氯化钠胨水10NACLPEPTONEWATER不生长32回归感染实验注射无菌的对照组安然无恙。对鱼进行腹腔注射，在感染后的3天，不同程度呈现出溃疡及皮下出血症状。该菌株可重新从死鱼肾脏中分离得到。33药物敏感性实验用纸片法测定了具有代表性的12种抗菌药物对菌株MIIUYCROAKERY090909
21、的抑制作用，结果表明该菌对链霉素，四环素，氨苄青霉素，丁胺卡那，青霉素G等药物表现为中敏；而对头咆哌酮，羧苄青霉素，新生霉素，氯霉素，先锋霉素V，O/129诊断试纸等药物表现为高敏见表2。表2VIBROPONTICUS药物敏感性实验TAB2PHARMICSENSITIVITYOFISOLATES编号NUMBER药品名ANTIMICROBIALAGENTS每片含量CONTENT/PIECE抑菌圈直径/MM敏感度SENSITIVITY平行1平行2平行301链霉素纸STREPTOMYCIN10G121211I02新生霉素纸ALBAMYCIN30G222322S03氯霉素纸CHLOROMYCETIN3
22、0G242524S04四环素纸片ACHROMYCIN30G121211I05氨苄青霉素纸AMPICILLIN10G131112I06丁胺卡那纸片AMIKACIN30G121112I07羧苄青霉素CARBENICILLIN100G191918S08青霉素G纸片ENICILLING10G131211I09头咆哌酮CEFOPERAZONE75G252526S10先锋霉素V纸CEPHAZOLIN30G242223S11O/129诊断试纸150G221517S12O/129诊断试纸10G81411I注表示无抑菌圈，S表示敏感，I表示中介，R表示耐药。NOTENOZONEOFINHIBITIONAROUN
23、DDISK；SSENSITIVE；IINTERIM；RRESISTANT734细菌基因组序列扩增、测序和分析菌株MIIUYCROAKERY090909的16SRRNA基因扩增产物纯化后，分别克隆并测定序列。细菌16SRRNA基因1513个核苷酸序列比较表明，MIIUYCROAKERY090909与VIBROPONTICUS核苷酸序列同源性最高，为9949954。16SRRNA基因系统进化树分析表明，MIIUYCROAKERY090909与VIBROPONTICUS系统进化相关性最高，与同科的弧菌属成员进化相关性次之，但与同属其他两个成员进化相关性较远（图2）。序列分析结果揭示，菌株MIIUYC
24、ROAKERY090909与VIBROPONTICUS是一个分离物5。图2部分弧菌科成员16SRRNA基因核苷酸序列的系统进化树分析FIG2MEMBERSOFVIBRIONACEAENUCLEOTIDESEQUENCESOF16SRRNAGENEPHYLOGENETICANALYSIS4讨论VPONTICUS是弧菌属的一员，2004年发现的一个新种。目前关于此类弧菌病的研究主要是对该菌的分离鉴定以及该菌的致病性还有一些基本的培养特性，其他方面如免疫学、病理学等方面很少涉及。然而作为新发现的海洋致病菌，对其的研究有着极其重要的经济价值和生态价值。本文主要通过传统方法鉴定该菌。分别从生理生化、药敏
25、实验和16SRRNA序列分析等方面来鉴定菌株，得出分离出的细菌为VPONTICUS。本次对VPONTICUS的菌种判定，是通过比较系统的表观生物学分类指征检验与16SRRNA基因序列测定与系统发育学分析相结合在一起进行的。就个别的生理生化特性指标来讲，该分离菌与记载的生化性质存在着一些差异。这些表明在对细菌进行种的鉴定时不能仅仅依赖于生化指标的完全一致性，从不同地方分离而来的同种菌株间可能存在着个别生理生化特性的差异。药敏测定结果显示，在所测得10种药物中，结果表明该菌对链霉素，四环素，氨苄青霉素，丁胺卡那，青霉素G等药物表现为中敏；而对头咆哌酮，羧苄青霉素，新生霉素，氯霉素，先锋霉素V，O/
26、129诊断试纸等药物表现为高敏。可能因为该菌株为新型变异的菌株，对药物的敏感性还较高。但是我们在平时的用药过程中还是要注意适度原则，避免使该菌株出现对大量的药物耐药的现象。总之，本实验对分离菌株进行了较为系统的生理生化特性的检验，相对地丰富了VPONTICUS的一些生物学性状内容，将可能有益于对该菌的分离与鉴定。VPONTICUS研究报道较少。最早在2004年，MACIAN等首次分离自在西班牙海水中贻贝和病变鲷（金头鲷）。其研究发现，四个VPONTICUS株（AJ630103，AJ630102，AJ630202，AJ630203）和河流弧菌和VFURNISSII在16RDNA序列上有高度同源（
27、大于97），但吲哚和赖氨酸脱羧酶基因处有所不同，这两个酶与表型功能密切相关。此外，河流弧菌和VFURNISSII在40均能生长，并且能水解明胶，但VPONTICUS却不能。VIBRIOFURNISSIISTRAIN911982NR037067VIBRIOFLUVIALISSTRAINJC238FJ176464VIBRIOVULNIFICUSATCC27562TX76333MIIUYCROAKERY090909VIBRIOPONTICUSAJ630103VIBRIOAESTUARIANUSAJ845014LISTONELLAANGUILLARUMFM866241VIBRIOSPLENDIDUSA
28、J874367VIBRIOPARAHAEMOLYTICUSCLONEVP27AF388389VIBRIONATRIEGENSSTRAINCM3EU660320VIBRIOALGINOLYTICUSSTRAINSM1HM045516999987997093789998001VIBRIOPARAHAEMOLYTICUSSTRAINMM21FJ5470938XIE等研究中还利用了UPPCRDGGE技术迅速检测细菌病原体，在DGGE模式研究的基础上，鉴定结果所有分离出的VPONTICUS菌株是同一种类。这证明VPONTICUS是广东流行的日本鲈鱼的病原。传统方法检测包括直接培养、生理生化方法、组织切片
29、观察法和超薄切片电镜观察法，是目前养殖鱼类弧菌病诊断的主要方法。另外，关于鱼类弧菌病的检测方法，还有一种先进的比较常用的技术免疫学技术。免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应,观察和研究组织细胞特定抗原或抗体的定位和定量技术。具有高特异性、高灵敏性等特点，该技术将抗原、抗体的免疫反应相结合，缩短了病原菌的检测时间,提高了诊断的准确性，是目前养殖鮸鱼弧菌病早期检测技术中研究较为广泛深入的检测技术。荧光抗体技术是根据抗原抗体反应具有高度的特异性，以荧光素作为标记物，与已知的抗体结合不影响其免疫特性作为标准试剂，用于鉴定未知的抗原，可在荧光显微镜下检查呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及其存在部位。此项技术
30、是应用免疫反应的特异性与灵敏性，并与显微镜的精确性相结合，成为现代免疫学研究中的标记免疫检测方法之一。王军6、鄢庆枇7等分别建立了检测鮸鱼溶藻弧菌,副溶血弧菌的间接荧光抗体快速检测技术。免疫荧光技术不仅能快速检测患病动物的病原，检测的时间一般不超过3H，为疾病的及时对症治疗赢得了宝贵的时间，而且该方法还能够检测到带菌状态或未发病的被感染个体。姚斐8等报道了利用间接免疫荧光技术还可检出处于活的非可培养状态的细菌，由于活的非可培养状态的细菌仍具有毒性，并可在一定条件下复苏造成疾病的暴发流行，因此加强活的非可培养状态病原菌的检测在鮸鱼弧菌病的预测预报上是很有意义的。但免疫荧光技术的缺点是非特异性染色
31、问题难以完全解决；操作程序较繁琐需要特殊的昂贵仪器荧光显微镜；染色标本不能长期保存等。免疫酶技术也是免疫学诊断的一条新途径,与免疫荧光技术相比，它只需普通光学显微镜即可进行观察。它利用了抗原抗体反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性，通过肉眼或显微镜观察及分光光度计测定,达到在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的位置,以及对其进行定量的目的。该方法具有高效、经济、方便等特点。按是否将抗原或抗体结合到固相载体上,免疫酶技术可分为固相、均相和双抗体酶免疫测定技术。酶联免疫吸附试验ELISA是目前应用最广泛的固相免疫酶测定技术。杨鸢劼9等建立了检测鳗弧菌的间接ELISA技术，其检测的敏感性阈值为110
32、5个/ML。鄢庆枇10、王军11分别改良了间接ELISA法检测鮸鱼溶藻弧菌和副溶血弧菌，其最低检测极限分别为为97104CFU/ML和50104CFU/ML。酶联免疫吸附试验ELISA不仅可以用于患病鮸鱼的诊断，也可以用于无病症带菌鮸鱼的检测,结果可多次重复，稳定，底物显色清晰，不需特殊仪器用肉眼即可观察，快速，并同时可测大量的样品。为了更好地将这种快速、灵敏、准确的检测方法应用于养殖生产实践，必须要在缩短检测时间、提高检测灵敏度和降低检测成本等方而做更深入地研究，如果能将研究成果转化为商品化的检测试剂盒，将会具有良好的应用前景。若再将这些检测鮸鱼弧菌病的ELISA法进行有机组合，确定相应的检
33、测程序，即可以建立起养殖鮸鱼弧菌病早期诊断和预防系统，这对指导鮸鱼弧菌病的防治工作具有重要意义。免疫学方法虽比传统方法在许多方面有了较大进步，也存在不少问题。抗体在体内的形成往往需要一段时间，而且抗体一旦产生,即使病愈后还可能长时间存在，阳性结果还不能做出确诊。酶联免疫吸附实验具备免疫学方法的长处，灵敏度高，但操作麻烦，除了对抗血清要求严格外，还可能存在一定程度的交叉反应，并且其结果受样品浓度影响，易出现假阳性或微阳性。随着现代分子生物学技术的高速发展，聚合酶链式反应和分子杂交等手段为鮸鱼弧菌病检测提供了新N的研究思路。分子生物学检测技术是最近新流行的一种检测方法，它包括PCR及其衍生技术，P
34、CR与分子杂交联用技术和16SRRNA和热激蛋白基因检测技术PCR及其衍生技术即酶链反应技术PCR，是指在引物的作用下,体外酶促反应，迅速扩增DNA片段的一种方法。该技术具有特异性好、对感染早期诊断非常有效、检测速度快且灵敏等优点。国内外关于弧菌的分子检测主要集中在霍乱弧菌，副溶血弧菌的研究上,偏重于医学、食品安全和水域环境方向12,13，但对养殖鮸鱼弧菌病早期检测具有很强的借鉴意义，是未来鮸鱼弧菌病检测发展的主流。KIM，LEE等针对副溶血弧菌部分TOXR基因，直接溶血素基因,PR72H片段分别建立了多种特异性PCR检测方法1417。CONEJERO和LPANG针对哈维氏弧菌的部分TOXR基
35、因和溶血素基因分别建立了特异性PCR检测技1820。常规的PCR检测法为单对引物扩增一种病原体DNA，一次只能检测一种病原体或一个基因型别，基因型别和混合感染的9检测显得操作烦琐，费时且成本高，而且容易产生漏诊。而养殖鮸鱼可能致病性弧菌种类多，病症表现多样，难以用一种方法进行确诊。多重PCR技术是将多对引物混合后于一个反应管中同时进行多种病原体扩增,能有效地解决上述问题,一种方法能检出多种致病性弧菌,使得诊断及分型变得简捷。DIPINTOA21根据胶原酶基因设计引物建立的多重PCR技术能同时检测溶藻弧菌和副溶血弧菌。但多重PCR容易产生非特异性条带,对引物特异性要求较高，PCR体系和反应条件需
36、要反复摸索优化。PCR与分子杂交联用技术在国内外构建弧菌的基因文库或部分基因文库的研究工作并不算多，对于一些弧菌的特异性核酸探针的制备尚有较大困难。另外，分子杂交检测灵敏度要比PCR方法低，分子杂交联用法来检测病原可以提高灵敏度。蒋鲁岩22等在PCR技术基础上，合成探针，应用DIG标记试剂盒对特异扩增产物进行标记，标记探针可与副溶血弧菌DNA的TDH基因特异性地杂交，从而建立了副溶血弧菌的斑点杂交检测方法。可以同时处理数百甚至上千份样品,适于大批量标本检测，同时应用非放射性探针，快速简便且对操作者健康无害。副溶血弧菌也是鮸鱼弧菌病的可能致病菌之一，将之进行改良制成试剂盒也可应用于鮸鱼弧菌病的检
37、测中。16SRRNA为所有生物体生存所必需的基因序列并且也是较保守的序列之一。16SRRNA的序列检测已被成功地建立为一种鉴定微生物种、属、家族种类的标准方法。目前，16SRRNA检测技术在人医及兽医开始得到广泛应用，在水产病害方面也开始运用。但由于16SRRNA的进化速度非常慢，即太保守，无法区分某些种系非常接近的菌种及同一菌种的不同菌株。而热激蛋白HEATSHOCKPROTEIN,HSP是另一类常用于生物进化和分类研究的大分子物质。广泛存在于细菌及真核生物细胞中。其主要功能是作为分子伴侣参与蛋白质肽链折叠和组装。进化速度比16SRRNA快,携带更多的多态信息。我们对养殖鮸鱼多种致病性弧菌分
38、别进行16SRRNA和HSP分子鉴定，发现HSP60基因更适合用于研究海洋弧菌系统分类鉴定，以HSP60基因构建的系统树在置信度上普遍明显高于16SRRNA基因。这与李宁求23、张伟妮24、KWOK25等的研究结论一致。5总结本次对VPONTICUS的菌种判定，是通过比较系统的表观生物学分类指征检验与16SRRNA基因序列测定与系统发育学分析相结合在一起进行的。就个别的生理生化特性指标来讲，该分离菌与记载的生化性质存在着一些差异。这些表明在对细菌进行种的鉴定时不能仅仅依赖于生化指标的完全一致性，从不同地方分离而来的同种菌株间可能存在着个别生理生化特性的差异。药敏测定结果显示，在所测得10种药物
39、中，结果表明该菌对链霉素，四环素，氨苄青霉素，丁胺卡那，青霉素G等药物表现为中敏；而对头咆哌酮，羧苄青霉素，新生霉素，氯霉素，先锋霉素V，O/129诊断试纸等药物表现为高敏。可能因为该菌株为新型变异的菌株，对药物的敏感性还较高。但是我们在平时的用药过程中还是要注意适度原则，避免使该菌株出现对大量的药物耐药的现象。总之，本实验对分离菌株进行了较为系统的生理生化特性的检验，相对地丰富了VPONTICUS的一些生物学性状内容，将可能有益于对该菌的分离与鉴定。参考文献1林克冰,周宸,刘家富,等海水网箱养殖鮸鱼弧菌病的病原菌J台湾海峡,1999,1233423452王军,苏永全,张朝霞,等闽南地区养殖鮸
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