1、本科毕业设计（20_届）纳米TIO2对斑马鱼肝损伤基因表达的影响所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月I目录1引言22材料与方法321实验材料3211动物材料1212主要试剂1213主要设备322实验方法3221斑马鱼的驯养3222斑马鱼的染毒处理4223斑马鱼总RNA的提取42231使用BIOZOL试剂提取RNA42232总RNA完整性检测42233总RNA浓度及纯度分析4224RTPCR扩增42241RTPCR反应体系42242PCR反应条件52243扩增产物的检测623数据处理63结果631斑马鱼肝总RNA完整性检测632总RNA的浓度及纯度检测733纳米TIO2对
2、各基因表达的影响7331纳米TIO2对ACTIN基因表达的影响7332纳米TIO2对CTR1基因表达的影响8333纳米TIO2对MTF1基因表达的影响9334纳米TIO2对NKA基因表达的影响10335纳米TIO2对HSP70基因表达的影响11336纳米TIO2对HIF基因表达的影响124分析与展望1341纳米TIO2对斑马鱼肝CTR1基因表达影响的机理分析1342纳米TIO2对斑马鱼肝MTF1基因表达影响的机理分析1343纳米TIO2对斑马鱼肝NKA基因表达影响的机理分析1444纳米TIO2对斑马鱼肝HSP70基因表达影响的机理分析1444纳米TIO2对斑马鱼肝HIF基因表达影响的机理分析1
3、545展望15参考文献16I摘要为探讨纳米TIO2（NANOTIO2）颗粒对斑马鱼（DANIORERIO）肝损伤相关基因表达的影响，选取浓度为56MGL1的TIO2培养斑马鱼，运用半定量RTPCR技术分析相关基因在不同处理时间（6H，12H，24H，48H，72H）的表达量。共检测了HSP70（HEATSHOCKPROTEIN，热休克蛋白）、HIFHYPOXIAINDUCIBLEFACTOR，低氧诱导因子、CTR1（COPPERTRANSPORTER1，铜离子转运蛋白）、MTF1（METALRESPONSIVETRANSCRIPTIONFACTOR1，金属调节转录因子）、NKA（NAKATPA
4、SE，钠钾ATP酶）。实验结果显示，纳米TI02对CTR1基因的表达影响不显著，而对其他相关基因表达有着较明显的影响，并且对不同基因的表达的影响呈多样性。本研究旨为深入研究鱼类基因表达与重金属解毒分子机制间的关系，以及为研究纳米材料毒理奠定基础。关键词纳米TIO2；肝损伤；基因表达ABSTRACTTOINVESTIGATETHEEXPRESSIONOFZEBRAFISHDANIORERIOGENERELATEDTOLIVERINJURYUNDERTHEINFLUENCEOFNANOTIO2PARTICLESUSINGNANOTIO2PARTICLESWITHCONCENTRATIONOF56M
5、GL1TOFEEDZEBRAFISHANDUSINGSEMIQUANTITATIVERTPCRTECHNOLOGYTOANALYSISTHEEXPRESSIONOFASSOCIATEDGENESINDIFFERENTTIME6H,12,24H,48H,72HINTOTAL,HSP70HEATSHOCKPROTEIN,HIFHYPOXIAINDUCIBLEFACTOR,CTR1COPPERTRANSPORTER1,MTF1METALRESPONSIVETRANSCRIPTIONFACTOR1ANDNKANAKATPASEWERECHECKEDEXPERIMENTALRESULTSSHOWEDTH
6、ATNANOTIO2PARTICLESHAVENOSIGNIFICANTEFFECTONCTR1GENEBUTNANOTIO2PARTICLESHAVEASIGNIFICANTEFFECTONTHEEXPRESSIONOFOTHERGENESTHEEFFECTONTHEEXPRESSIONOFDIFFERENTGENESWASDIVERSITYTHISSTUDYISDESIGNEDFORINDEPTHSTUDYOFTHERELATIONSHIPSBETWEENTHEGENEEXPRESSIONOFFISHANDHEAVYMETALDETOXIFICATIONMOLECULARMECHANISM
7、SANDTOLAYTHEFOUNDATIONFORNANOMATERIALSTOXICITYKEYWORDSNANOTIO2LIVERINJURYGENEEXPRESSION21引言纳米是英文NAMOMETER的译音，是一个物理学上的度量单位，1纳米是1米的十亿分之一，相当于45个原子排列起来的长度。当物质到达纳米尺度以后，大约是在1100纳米这个范围内，物质的性能就会发生突变，出现特殊性能。这种具不同于原来组成的原子、分子，也不同于宏观的物质的特殊性能所构成的材料，即为纳米材料1。纳米TIO2（NANOTIO2，简称NTIO2）作为应用广泛的纳米材料之一，其应用范围从民众日用品牙膏，防晒霜到
8、工业品如油漆、涂料、传感器以及污水处理等众多领域2。纳米TIO2的加入，对原物质的理化性质也会产生很大的影响3，所以，随着对纳米材料研究的深入，应用范围在不断拓宽，对人类的影响也在日益扩大。随着纳米TIO2被不断的应用于相关产业，其对人类造成的危害也凸显了出来。在一些研究中发现，纳米TIO2对生物肺上皮细胞所产生的细胞毒性影响是比较严重的，可以导致各种心血管与呼吸道疾病4。斑马鱼（DANIORERIO）又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，是一种热带观赏鱼，属鲤科短担尼尔属。原产于印度、孟加拉国5。斑马鱼容易获得，易于饲养，生殖周期短，繁殖能力强，结构简单，基因组和其它许多方面都与人类有着极大的相似
9、性。斑马鱼的特点使其在20世纪70年代开始受到科学家们的关注，并成为最重要的模式脊椎动物之一6。目前对生物体内组织损伤相关基因的研究取得了很大的进展。如HSP70（HEATSHOCKPROTEIN70，热休克蛋白70），它是一组广泛存在于微生物和动植物体内的生物进化中高度保守的多肽蛋白。由于此类蛋白的合成与热休克反应有关，所以命名为热休克蛋白（HEATSHOCKPROTEIN）。除高热之外，多种应激原如重金属、饥饿、缺氧缺血等都可以诱导HSP的表达7。HIFHYPOXIAINDUCIBLEFACTOR，低氧诱导因子，是一种分布和作用十分广泛的真核细胞转录因子，可以被多种胞外刺激活化、上调影响细
10、胞存活、生长分化以及凋亡的基因表达，具有重要的生理和病理作用。今年来，由于人为地向水体中排放过量的营养物质和有机物质，水体富营养化严重，导致缺氧现象频繁发生。HIF作为低氧相关基因调控中重要的核心转录因子已经成为相关研究中的重点8。CTR1（COPPERTRANSPORTER1，铜离子转运蛋白），CTR1蛋白是铜离子摄入蛋白，是铜进入细胞的关键运输工具，其表达量的多少直接关系到机体铜代谢的平衡9。相关研究表明，CTR1可能与机体其他金属代谢平衡有一定关系10。此外，MTF1（METALRESPONSIVETRANSCRIPTIONFACTOR1，金属反应转录因子）和NKA（NAKATPASE，
11、钠钾ATP酶）都是细胞损伤相关蛋白，在细胞损伤调控机制中有着很重要的地位11。尽管对鱼类，人类肿瘤细胞中的相关基因的表达与调控已经有了深入的研究，证明了相关基因的重要作用及调控过程12。但是对于纳米材料对生物组织损伤相关基因表达的报道尚不多。斑马鱼作为一种重要的模式生物，研究纳米TIO2对其肝损伤相关基因的表达是有非常重要的意义的。本实验以蓝色斑马鱼作为实验材料，采用ONESTEPRTPCR技术检测斑马鱼肝损伤相关基因的表达。本实验的结果不仅可以为斑马鱼肝损伤相关基因表达的分子机3制提供参考，还可以为纳米材料对生物的伤害研究提供一定的依据，具有重要的理论和实际意义。2材料与方法21实验材料21
12、1动物材料斑马鱼（DANIORERIO），购自宁波天胜花鸟市场，体型大小相似，长约35CM，健康，活力正常。212主要试剂（1）纳米TIO2购于杭州大洋纳米新材料有限公司；（2）BIZOLRNA提取试剂盒购于上海生工生物工程技术服务有限公司；（3）异丙醇；（4）氯仿（三氯甲烷）；（5）75乙醇；（6）TAKARAPRIMESCRIPTONESTEPRTPCRKITVER2购于宝生物工程（大连）有限公司；（7）RIBONUCLEASEINHIBITOR（核糖核酸酶抑制剂）；（8）DEPCH2O；（9）KMNO4（高锰酸钾）；（10）DNAMARKER，6LOADINGBUFFER购于宝生物工程（
13、大连）有限公司。213主要设备（1）SWCJ3FD型双人单面净化工作台；（2）装备控温装置及充气的鱼缸；（3）NEOFUGE15R型高速冷冻离心机；（4）AB104N型电子分析天平；（5）超声波振荡仪；（6）JUNYI600双控电泳仪；（7）PX2THERMALCYCLERPCR自动分析仪；（8）液氮罐；（9）ALPHAIMAGER2200凝胶图像处理系统；（10）THERMONANODROP1000超微量分光光度计。22实验方法221斑马鱼的驯养将购买来的斑马鱼在去氯离子水中驯养。调节鱼缸内温度为28左右，于每天0900和1700按斑马鱼体重的510的量投放饲料。调节投放饲料量以使斑马鱼健康
14、的生长。23天换水一次，每次大约换去缸内2/3的水。每天观察并作记录，检查缸内温度及充气装备是否正常，清洁鱼缸。4222斑马鱼的染毒处理驯养两周后，取25尾大小相似，身体健壮的斑马鱼，投放于放有20L去氯离子水的鱼缸中饲养。称取0112G的纳米TIO2颗粒，放于烧杯中。用200ML的去氯离子水溶解，置于超声波振荡仪中振荡约30MIN后观察。若TIO2颗粒均匀的分散于溶液中，溶液颜色均匀，烧杯底部无沉淀。将溶液倒入鱼缸中，对斑马鱼进行染毒处理。染毒时间持续72H，在第6H，12H，24H，48H，72H各取5尾鱼，提取斑马鱼肝放入液氮中冻存，备用。223斑马鱼总RNA的提取2231使用BIOZO
15、L试剂提取RNA按照试剂盒操作说明书进行操作（1）将提取的肝组织在已用液氮预冷的研钵中研磨，直至组织被研磨至粉末。将1ML的BIZOL加入研钵中进行裂解。（2）将裂解液静置约30MIN，待裂解液完全溶化后，用RNA专用枪头吸入EP管中，在室温下放置1520MIN。（3）加入200UL的氯仿，盖紧管盖，剧烈震荡混匀30S。再于冰上孵育15MIN。台式高度冷冻离心机上，于4，12000R/MIN条件下离心15MIN。RNA存在于离心后混合物的上清层中。将上清液转移至15MLEP管中，加入等体积冰浴的异丙醇，缓慢混匀，用以沉淀RNA。（4）将样品在20条件下孵育20MIN以上。台式高速冷冻离心机上，
16、以4，12000R/MIN条件离心10MIN。RNA沉淀胶状形成于管底或者管壁上。（5）小心弃去上清液，防止RNA沉淀丢失。用冰浴的75的乙醇洗涤两次，颠倒洗涤管壁，漩涡振荡样品。使RNA沉淀悬浮。4，12000R/MIN下离心5MIN，小心弃去上清液，防止RNA沉淀丢失。晾干RNA沉淀。（6）用50ULDEPCH2O溶解沉淀，并加入05UL的RNA酶抑制剂。放于40冰箱保存。2232总RNA完整性检测采用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性。取5UL已处理好的总RNA样品，于1琼脂糖凝胶中，电泳20MIN左右，使用凝胶图像处理系统观察条带。如果观察到电泳后的琼脂糖凝胶上有三条带28SRRNA、1
17、8SRRNA和58SRRNA。28SRRNA与18SRRNA条带明亮，58SRRNA条带较弱。且，28SRRNA的亮度约为18SRRNA的两倍，则提取出的总RNA的完整性是比较好的。2233总RNA浓度及纯度分析为了保证提取到的RNA的纯度，使用THERMONANODROP1000超微量分光光度计对RNA进行浓度测量和纯度检测。核酸的最大吸收波长为260NM，蛋白质最大吸收波长为280NM，盐和小分子为230NM。质量较好的RNA，其OD260/OD280应该在1720之间。小于17说明有蛋白质或酚的存在；大于20则说明有异硫氰酸的存在。其OD263/OD230应该在225之间。如果较低则说明
18、有盐的存在。根据以上数据分析提取到的总RNA纯度。224RTPCR扩增2241RTPCR反应体系5表1PCR反应体系TAB1REACTIONSYSTEMOFPCR成分体积（UL）2ONESTEPPCRBUFFERRNASEFREEH2OFPRIMERPRIMEONESTEPRTPCRENZYMEMIXRNA12555050515参照宝生物工程（大连）有限公司PRIMESCRIPTONESTEPRTPCRKITVER2使用说明书进行，反应总体积为25UL。2242PCR反应条件表2ACTIN基因的PCR反应条件TAB2PCRREACTIONCONDITIONSOFACTINGENE反转预变性26
19、个循环最后延伸保存变性退火延伸50（30MIN）94（2MIN）94（30S）54（30S）72（30S）72（10MIN）16表3MTF1基因的PCR反应条件TAB3PCRREACTIONCONDITIONSOFMTF1GENE反转预变性28个循环最后延伸保存变性退火延伸50（30MIN）94（2MIN）94（30S）58（30S）72（30S）72（10MIN）16表4HIF基因的PCR反应条件TAB4PCRREACTIONCONDITIONSOFHIFGENE反转预变性28个循环最后延伸保存变性退火延伸509494597272166（30MIN）（2MIN）（30S）（30S）（30S）
20、（10MIN）表5NKA基因的PCR反应条件TAB5PCRREACTIONCONDITIONSOFNKAGENE反转预变性26个循环最后延伸保存变性退火延伸50（30MIN）94（2MIN）94（30S）58（30S）72（30S）72（10MIN）16表6CTR1基因的PCR反应条件TAB6PCRREACTIONCONDITIONSOFCTR1GENE反转预变性28个循环最后延伸保存变性退火延伸50（30MIN）94（2MIN）94（30S）58（30S）72（30S）72（10MIN）16表7HSP70基因的PCR反应条件TAB7PCRREACTIONCONDITIONSOFHSP70GE
21、NE反转预变性28个循环最后延伸保存变性退火延伸50（30MIN）94（2MIN）94（30S）55（30S）72（30S）72（10MIN）162243扩增产物的检测扩增后的产物进行电泳检测。采用琼脂糖凝胶电泳法，使用凝胶图像处理系统观察条带。23数据处理使用EXCEL软件和SPSS130软件处理数据，使用QUANTITYONE软件进行电泳之后的信息处理。将内参基因ACTIN的信息量设为100，计算各目的基因的相对表达量，并结合文献进行分析。3结果31斑马鱼肝总RNA完整性检测所提取的斑马鱼肝组织总RNA，通过1琼脂糖凝胶电泳检测，看到清晰的28SRRNA与18SRRNA条带，表明所提取的总
22、RNA完整性较好（图1）。同时，泳道无残留物，说明提取的RNA里基本无DNA残留。以上结果说明，所提取的肝组织RNA可以供下步实验使用。7图1斑马鱼肝组织总RNA电泳图FIG1ELECTROPHORESISPATTERNOFTOTALRNAOFTHELIVEROFDANIORERIO32总RNA的浓度及纯度检测使用THERMONANODROP1000超微量分光光度计对RNA进行浓度测量和纯度检测，检测结果见表8所示，对照组及各处理组的OD260/280的值处于199到204之间，表明所提RNA纯度较高，可供下一步实验使用。表8总RNA的浓度及纯度TAB8CONCENTRATIONANDPURI
23、TYOFTOTALRNA处理组OD260/280含量NGL1对照6H12H24H48H72H199204201200201200844810844558756537610538233纳米TIO2对各基因表达的影响331纳米TIO2对ACTIN基因表达的影响看家基因又称管家基因，是所有细胞中均要表达的一类基因。其表达水平受环境因素影响较小。斑马鱼ACTIN基因（肌动蛋白基因）是典型的看家基因，以斑马鱼ACTIN基因作为内参来消除相关基因表达由原始RNA浓度不同所带来的误差。将在不同时间处理后提取的RNA稀释到相同浓度（100NGL1），用于基因检测。图2为将斑马鱼暴露培养在56MGL1纳米TIO
24、2ACTIN基因的表达情况。如图2所示，ACTIN在不同的处理组表达量一致，为测量相关基因的表达情况提供了准确的依据。8图2ACTIN基因在不同时间的表达量FIG2EXPRESSIONOFACTINGENEINDIFFERENTTIME332纳米TIO2对CTR1基因表达的影响将斑马鱼暴露培养在在56MGL1纳米TIO2中所提取到的肝组织CTR1基因表达情况随着处理时间的延长，CTR1基因的表达与对照组比无显著变化（图3）。如图4所示，在整个处理期间，CTR1的基因表达量与对照组相比均无显著变化（P005）。图3CTR1基因与在不同时间的表达量FIG3EXPRESSIONOFCTR1INDIF
25、FERENTTIME注左起为MAKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12H肝；4处理24H肝；5处理48H肝；6处理72H肝9图4纳米TIO2对CTR1基因表达的影响FIG4THEEXPRESSIONOFCTR1GENEUNDERTHEINFLUENCEOFNANOTIO2333纳米TIO2对MTF1基因表达的影响经纳米TIO2处理不同时间MTF1基因的表达情况见图5,6H条带的亮度要明显高于对照组，在之后的处理时间中，条带整体呈下降趋势。如图6所示，在使用纳米TIO2处理6H后，MTF1基因的表达量相比对照组有较显著的上升，相对表达量达到7884。在之后的处理时间中，MTF1基因的相对
26、表达量总体呈下降趋势。除了48H处理组外，各处理组均与对照组有显著差异（P005）。图5MTF1基因在不同时间的表达量FIG5EXPRESSIONOFMTF1INDIFFERENTTIME注最右为MAKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12H肝；4处理24H肝；5处理48H肝；6处理72H肝10图6纳米TIO2对MTF1基因表达的影响FIG6THEEXPRESSIONOFMTF1GENEUNDERTHEINFLUENCEOFNANOTIO2334纳米TIO2对NKA基因表达的影响NKA基因在不同处理时间的表达量如图7所示。除处理24H组外，其余处理组均与对照组有显著差异（P005）。处理
27、6H后，NKA的表达量有一定增加，12H表达量有下降至最低值，相对表达量达到2275。在之后的处理时间表达量上升，48H达到最大值；72H表达量出现明显下降（图8）。图7NKA基因在不同处理时间的表达量FIG7EXPRESSIONOFNKAINDIFFERENTTIME注左起为MAKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12H肝；4处理24H肝；5处理48H肝；6处理72H肝11图8纳米TIO2对NKA基因表达的影响FIG8THEEXPRESSIONOFNKAGENEUNDERTHEINFLUENCEOFNANOTIO2335纳米TIO2对HSP70基因表达的影响经纳米TIO2处理后，各组的
28、HSP70基因表达量如图9。与对照组相比，各处理组的HSP70表达量均有显著差异（P005）。6H处理组相对表达量有显著上升；在12H处相对表达量降至最低，为2033，在之后的处理时间中表达量逐渐上升（图10）。图9HSP70基因在不同处理时间的表达量FIG9EXPRESSIONOFHSP70INDIFFERENTTIME注左起为MAKER标记；1对照组；2处理6H肝；3处理12H肝；4处理24H肝；5处理48H肝；6处理72H肝12图10纳米TIO2对HSP70基因表达的影响FIG10THEEXPRESSIONOFHSP70GENEUNDERTHEINFLUENCEOFNANOTIO2336
29、纳米TIO2对HIF基因表达的影响如图11所示，加入纳米TIO2后HIF基因的表达量出现了明显的变化。各处理组与对照组之间均有显著差异（P005）。在6HHIF基因的表达量相对对照组有明显的上升；在12H处表达量下降，但仍高于对照组，在之后的处理时间中，HIF基因的表达量逐渐上升（图12）。图11HIF基因在不同处理时间的表达量FIG11EXPRESSIONOFHIFINDIFFERENTTIME13图12纳米TIO2对HIF基因表达的影响FIG12THEEXPRESSIONOFHIFGENEUNDERTHEINFLUENCEOFNANOTIO24分析与展望41纳米TIO2对斑马鱼肝CTR1基
30、因表达影响的机理分析CTR1存在于所有物种及机体的各个组织中，在肝脏和肾脏的表达量最高。CTR1是铜进入细胞的大门，其表达量的多少直接关系到机体铜代谢的平衡，是铜在细胞内进行代谢的前提条件和重要基础。CTR1受可利用的铜水平的调控，铜缺乏可促进基因表达，铜过量时抑制表达。CTR1在细胞代谢中起着非常重要的作用，当机体内缺乏CTR1时，细胞内缺铜，表现为一系列铜缺乏状况9。在其他研究中显示，铜离子转运蛋白不仅参与调节体内铜的代谢平衡，在某些药物如化疗药物顺铂的跨膜转运过程中也起着重要的作用。于海林10等研究铂类药物对人卵巢癌细胞中CTR1基因的表达影响发现，CTR1基因参与了相关药物的转运，并且
31、其高表达与外界药物的浓度有关。本实验结果说明，随着处理时间的延长，CTR1基因的表达量并无显著变化。分析其原因可能为CTR1基因的表达对外界刺激的金属或者药物有特异性；处理的浓度不当，未能影响CTR1基因的表达。改变处理浓度及处理时间可能会使CTR1基因的表达发生变化，有待下一步研究。42纳米TIO2对斑马鱼肝MTF1基因表达影响的机理分析在分子生物学中，转录因子（TRANSCRIPTIONFACTOR）是指能够结合在某基因上游特异核苷酸序列上的蛋白质，这些蛋白质能调控其基因的转录。金属反应转录因子为锌指结构之转录14因子，它能与金属硫蛋白启动子上的金属感应序列结合，藉以调控金属硫蛋白的表现。
32、金属硫蛋白（METALLOTHIONEIN,MT）为富含巯基，能螯合大量的金属离子的蛋白。MT广泛存在于人体、动物、植物以及微生物中，其理化性质基本一致。随着人类对金属硫蛋白的研究逐渐深入，对其在重金属的解毒过程和参与微量元素代谢中的作用了解日益深入14。金属硫蛋白具有广泛的生物效应，体现在一些金属代谢引起的遗传性疾病、重金属中毒疾病、心血管系统疾病中。相关研究表明，重金属可诱导MT的表达。NOREY15等人在注射CD到虹鳟体内诱导MT表达的实验中发现，注射后6到12H，肝中的表达量急剧上升，在612H最高诱导后，肝中的表达水平开始下降，这与本实验结果一致。由于MTF1表达与MT表达具有协同性
33、，故MT基因表达情况一定程度上可以代表MTF1的表达情况。实验结果显示，纳米TIO2影响了MTF1基因的表达。在诱导6H后，其表达量急剧上升。MTF1作为转录因子，调控MT的表达，可以将细胞内过多的纳米材料粒子泵出，以维持细胞的稳态。在6H后MTF1的表达量逐渐下降，分析这可能因为在6H后，MT代谢加快，细胞内纳米材料的浓度降低。随着染毒时间的延长，纳米TIO2与MT结合的形式和类型也发生了变化，进而导致了MTF1基因表达的下降。在纳米材料胁迫下，斑马鱼肝中MTF1基因表达变化机理需要我们从相关酶的活性及更多相关调控基因的表达方向入手研究。43纳米TIO2对斑马鱼肝NKA基因表达影响的机理分析
34、NKA（NAKATPASE，钠钾ATP酶）实际上就是钠钾泵，一般认为是由两个大亚基、两个小亚基组成的四聚体。其作用是维持细胞的渗透性、保持细胞的体积、维持低NA高K的细胞内环境、维持细胞的静息电位16。侯彦峰16等人在研究皮质醇影响青鲔鳃内钠钾ATP酶基因表达的过程中发现，青鲔鳃内NKA基因的表达在48H被显著诱导。上述研究成果对本实验具有一定的参考意义。实验结果表明，除72H外，对照组中NKA基因的表达量与处理组中均有显著差异（P005），说明纳米TIO2的加入，影响了NKA基因的表达。与对照组相比，处理6H时，NKA基因的表达量有一定的增加，可能由于加入纳米TIO2后，细胞内外渗透压发生变
35、化，NKA基因表达编码钠钾ATP酶以维持细胞的渗透性。在12H时，NKA的表达量下降，甚至低于对照组，说明NKA基因的表达受到了抑制，可能是因为NKA基因的表达调节了细胞内外渗透压的平衡，导致细胞对钠钾ATP酶的需求降低，故NKA基因的表达降低。在12H之后NKA表达量逐渐上升，在48H达到最高，随后在72H表达量下降。NKA基因的波动性表达可能是由于NKA基因的表达与细胞内外渗透压的相互作用的原因。纳米TIO2的加入对NKA基因的表达造成了影响。实验结果说明NKA基因的表达与细胞渗透压的变化可能是双向作用的。故NKA基因的表达呈波动状，可能与NKA基因表达后造成细胞内外渗透压平衡性的波动有关
36、，本实验得到的数据为短期内NKA基因的表达，要更深入的了解NKA基因作用的分子机制，可能需要延长处理时间及改变处理浓度。44纳米TIO2对斑马鱼肝HSP70基因表达影响的机理分析15HSP70（HEATSHOCKPROTEIN，热休克蛋白）是进化上高度保守的应激蛋白，通常认为具有分子伴侣的功能，参与修复和重叠受胁迫伤害的蛋白以及正常蛋白的合成、折叠和运输。其可以赋予细胞从各种应激中恢复的能力和保护它们免遭这些应激因素的损害17。在近年的研究中发现，重金属对HSP70的表达有着较明显的影响。在刘迪秋18等研究重金属对鲫鱼肝脏损伤相关基因表达影响实验中18，对HSP70的表达有着明显的影响，并且H
37、SP70基因的表达量在24H处达到最大值，在之后的处理时间表达量下降。上述实验结果与本实验结果有一定相似性，由于实验用鱼及处理材料的不同，上述实验结果与本实验具有一定的差距。在本实验中，处理组均与对照组有显著差异（P005），说明纳米TIO2可以影响HSP70的表达。处理6H组中HSP70的表达量有显著上升，可能是因为HSP70作为一种分子伴侣，可以帮助变性受损的蛋白质复性或降解,保持细胞内稳态，减轻细胞损伤。在用纳米TIO2处理后，HSP70大量表达以保护机体；在12H表达量出现了显著的下降，很可能是由于纳米TIO2处理一段时间后，对肝细胞造成了一定的损害，一定数量的肝细胞DNA受损发生凋亡
38、，导致HSP70的表达量降低19。这说明HSP70对机体的保护作用不是无休止的，其表达需要付出代价，超过一定范围后HSP70的表达量将会下降；12H后HSP70的表达逐渐上升，这可能由于机体自身的调控与恢复作用，HSP70表达量恢复。44纳米TIO2对斑马鱼肝HIF基因表达影响的机理分析HIFHYPOXIAINDUCIBLEFACTOR，低氧诱导因子是一种异源二聚体的转录因子，可介导动物为适应低氧条件而发生的基因表达的改变。在低氧时，HIF蛋白得以稳定，并活化一系列基因如促进红细胞生成素、血管内皮生长因子、糖酵解酶等来增强细胞供能供氧能力，促使细胞在低氧环境下存活。除低氧外，HIF还能被热、机
39、械压、辐射、化学试剂等环境刺激活化20。近年研究发现，重金属离子处理可引起鱼鳃上皮细胞处于低氧状态，从而激活HIF进行表达21。加入纳米TIO2后6小时，HIF基因表达显著增加，这是由于加入纳米材料后造成斑马鱼肝细胞缺氧，氧减少时氧感受器激活一种信号，导致HIF表达升高，HIF基因大量表达以增强细胞供氧能力并维持细胞内环境稳定。在12H处表达量降低可能由于细胞凋亡，肝细胞DNA受损，HIF基因表达受到抑制。之后表达量稳定上升，可能由于肝细胞数量及功能的恢复，HIF表达以适应肝细胞缺氧环境。HIF基因与HSP70基因的表达情况相似，猜测它们之间可能有某种协同作用，由于HSP作为一种分子伴侣蛋白，
40、其能帮助蛋白质折叠、稳定与运输，并能调控很多种蛋白的活化。近年研究表明，HSP蛋白与HIF之间是双向调控的23，故HSP70基因的表达情况与HIF基因的表达情况相似，符合本研究的结果。45展望当前，纳米材料被越来越多的用于商业用途，像装填物、折光剂、半导体、催化剂、化妆品、微电子学和药物载体等方面。纳米材料的广泛应用可能对环境和健康产生正面和负面16的影响。纳米材料的新颖性引起人们对其负面生物效应的关注。一些研究提出纳米材料并不完全是有益的，他们在细胞、亚细胞和蛋白质水平上影响着生物学行为22。纳米材料生产和使用过程中可以通过直接接触进入人体，而且还可能以多种方式在环境中传播，进入大气、水或者
41、土壤。在纳米材料进入生物体内的危害到底如何衡量，这都是发展纳米科技的同时需要讨论的问题。只有对纳米材料的生物效应有清楚的了解，才能正确的使用而避免它对人体产生副作用。本实验以模式生物斑马鱼作为实验材料，使用纳米TIO2暴露培养斑马鱼，观察随着培养时间的延长，斑马鱼肝损伤基因的表达情况。为斑马鱼肝损伤相关基因表达的分子机制提供参考，还可以为纳米材料对生物的伤害研究提供一定的依据。为进而研究纳米材料的生物效应提供一定的基础。实验结果说明，纳米TIO2的加入对斑马鱼肝损伤相关基因造成了一定程度的影响。在培养初期，相关基因的表达均呈上升趋势，表明纳米TIO2促进了相关基因的表达，这是机体自身保护机制的
42、体现。随着培养时间的延长，不同基因的表达呈多样性。纳米材料的应用将会更加广泛，纳米材料对人类生活许多方面将产生深远影响。例如环境保护和一些疾病的治疗方法。我们面临的挑战是我们缺乏不同纳米材料侵害生物可能带来的一些负面结果信息。所以，研究纳米材料对生物造成的伤害影响的意义重大。参考文献1方源纳米材料及其应用J应用科学,2010,171462诸平新进纳米TIO2研究文献统计分析J宝鸡文理学院学报自然科学版,2010,30233413YUNYH,HWANGKJ,WEEYJ,ETALSYNTHESIS,PHYSICALPROPERTIES,ANDCHARACTERIZATIONOFSTARCHBASE
43、DBLENDFILMSBYADDINGNANOSIZEDTIO2/POLYMETHY1METACRYLATECOACRYLAMIDEJJOURNALOFAPPLIEDPOLYMERSCIENCE,2011,120185018584KIMYH,KIMKS,KWAKNJ,ETALCYTOTOXICITYOFYELLOWSANDINLUNGEPITHELIALCELLSJJOURNALOFBIOSCIENCES,2003,2877815金珊珊,吴新荣斑马鱼,人类疾病研究的理想模式生物J生命的化学,2008,2832602636方薇,曾静,王付利模式生物斑马鱼在人类疾病中的应用J医学信息,2010,2
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45、杨廷桐食管癌中MDR基因表达及其临床意义J中国中医药,2009,75545513李成梅,刘容珍,曹华斌真核细胞内的铜转运及平衡机制研究进展J安徽农业科学,2009,3721100101001114张燕,肖婷婷,沈祥春金属硫蛋白的功能及药理作用研究进展J中国药理学通报,2010,26682182415NOREYCA,CRYERJKINDUCTIONOFMETALLOTHIONEINGENEEXPRESSIONBYCADMIUMANDTHEMETENTIONOFTHETOXICMETALINTHETISSUESOFRAINBOWTROUTJBIOCHEMPHYSIOL,1990,972152201
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