1、本科毕业设计（20_届）纳米TIO2对四膜虫细胞毒性分子机理的研究所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录摘要IABSTRACT错误未定义书签。引言41材料与方法511实验材料5111实验生物5112试剂51121四膜虫培养所使用的培养基基本配方为表151122PBS的配制表251123匀浆介质的配制表351124其他试剂及材料5113仪器与设备612实验方法6121四膜虫的培养6122四膜虫酶液的提取及测定61221四膜虫酶液的提取61222酶活力计算方法6123四膜虫RNA的提取和基因检测61231四膜虫RNA的提取61232基因的检测713数据处理72结果821不
2、同浓度纳米TIO2对四膜虫乙酰胆碱酯酶TCHE活力的影响822不同浓度纳米TIO2对四膜虫琥珀酸脱氢酶SDH活力的影响823不同浓度纳米TIO2对四膜虫MDR1及HSP70基因表达的影响93讨论12致谢错误未定义书签。附录一文献综述错误未定义书签。摘要本实验以四膜虫为材料，研究了不同浓度的纳米TIO2对其生长、生理代谢及相关基因的影响。结果表明，四个浓度组的纳米TIO21MGL1、10MGL1、100MGL1、500MGL1对四膜虫乙酰胆碱酯酶和琥珀酸脱氢酶活力均有抑制作用，随着浓度的增大，抑制作用越强，且500MGL1浓度的纳米TIO2抑制作用最强。当用不同浓度的纳米TIO2处理四膜虫后，从
3、1MGL1的纳米TIO2浓度起，MDR1的表达量明显增多；1MGL1的纳米TIO2使HSP70的表达量增大，而500MGL1的纳米TIO2使HSP70的表达量减少。关键词纳米TIO2；四膜虫；毒性ABSTRACTTETRAHYMENAWASUSEDASMATERIALINTHISEXPERIMENTANDEFFECTSOFDIFFERENTCONCENTRATIONOFNANOTIO2ONITSGROWTH,PHYSIOLOGICALMETABOLISMANDRELATEDGENEWERESTUDIEDRESULTSSHOWEDTHATFOURCONCENTRATIONGROUPOFNANOT
4、IO21MGL1、10MGL1、100MGL1、500MGL1COULDEXHIBITTHEACTIVITYOFACETYLCHOLINESTERASEANDSUCCINATEDEHYDROGENASEINTETRAHYMENACELLS,THEEFFECTOFINHIBITIONWASSTRONGERASTHECONCENTRATIONINCREASED,ANDTHEINHIBITIONWASSTRONGESTWHENCONCENTRATIONOFNANOTIO2WAS500MGL1TETRAHYMENAWASTREATEDWITHDIFFERENTCONCENTRATIONOFNANOSC
5、ALETITANIAANDTHEEXPRSSIONOFMULTIDRUGRESISTANCEMDR1GENEINCREASEDSIGNIFICANTLYFROMTHECONCENTRATIONOFNANOTIO2WAS1MGL1,NANOSCALETITANIAINCRESEDHEATSHOCKPROTEINWHENITSCONCENTRATIONWAS1MGL1,WHILETHEEXPRESSIONOFHSP70REDUCEDINTHECONCENTRATIONOF500MGL1KEYWORDSNANOTIO2TETRAHYMENAPYRIFORMISCYTOTOXICITY引言纳米材料是指
6、几何尺寸达到纳米级水平，并具有特殊性能的材料。1纳米NM是109M。当前对纳米材料的定义是粒径为1100NM的纳米粉、纳米线，厚度为1100NM的纳米薄膜，并且会产生纳米效应的材料1。纳米材料由于其在传导性、反应性和光敏性上表现出与众不同的特性，使得纳米科学与信息科学和生物科学并列，成为21世纪的三大支柱学科，纳米技术的发展也被成为“工业革命”2。纳米TIO2是指特征维度尺寸在纳米数量级的二氧化钛颗粒，它具有比表面积大、磁性强、光吸收性好，热导性好、分散性好等性能，因而备受国内外研究者的关注。纳米TIO2有三种晶体结构，即锐钛矿、金红石及板钛矿，它们组成结构的基本单位是TIO6八面体3。纳米T
7、IO2是纳米材料中应用十分广泛的材料之一，在日用化妆品、涂料、环保等方面有着广阔的应用前景，由于其光物理性质而应用于工业添加剂4,5,6。目前，国内对纳米TIO2的生物效应研究还处于起步阶段，国外研究的历史也只有20年左右。根据已有的研究证实1纳米TIO2具有尺寸效应，其粒径越小，对生物的毒性效应越大，浓度超出一定的范围也会引起生物的效应7。2目前研究纳米TIO2颗粒对生物的影响及生物效应的受试生物主要为小鼠和细胞，对水生生物及细菌的研究较少814。3TIO2的生物效应研究局限于毒性的表征，对其作用机制的研究不够深入，对其分析相对薄弱1521。随着纳米TIO2的广泛使用，越来越多的纳米TIO2
8、无论是以何种形式释放，其最终都会进入到水环境中，使用纳米材料可能导致排放到水环境，并危及水生物与水生生态系统。因此，其对水生生物及水生生态系统是否有影响，就是值得关注的问题。梨形四膜虫是真核单细胞原生动物，分布在全球的淡水水域中，由于其生长迅速，生活周期短，取材容易，培养方法简单、经济、便捷，实验结果又相对准确，而且对许多毒物的响应比其他高等生物更为敏感、直接；使其越来越受到毒理学与生态毒理学家的关注和重视2225，开展以四膜虫为模型的毒理学与生态毒理学研究具有很大的科学价值。本实验希望通过纳米TIO2对四膜虫的生长、生理代谢及相关基因的研究,为该领域的研究提供参考,积累数据,更为深入了解纳米
9、TIO2的毒性及其机制提供基础依据。1材料与方法11实验材料111实验生物四膜虫TETRAHYMENAPYRIFORMIS由中科院武汉水生生物研究所原生动物实验室馈赠。112试剂1121四膜虫培养所使用的培养基基本配方为表1表1四膜虫培养基基本配方材料质量G胰蛋白胨10酵母粉1葡萄糖1无水醋酸钠1取蒸馏水定容至1L，PH值调到70，分装后121灭菌，后保存于4冰箱，待用。1122PBS的配制表2表2PBS的配制材料质量GNACL8KCL02NA2HPO4KH2PO414402取蒸馏水定容至1L，PH值调到74，后121灭菌，后保存于4冰箱，待用。1123匀浆介质的配制表3表3匀浆介质的配制材料
10、质量GTRISHCL121EDTA2NA3723蔗糖NACL34281124其他试剂及材料纳米TIO2购于杭州大洋纳米新材料有限公司；乙酰胆碱酯酶TRUECHOLINEESTERASTCHE测定试剂盒、琥珀酸脱氢酶SUCCINATEDEHYDROGENASESDH测试盒购于南京建成生物科技有限公司；TRIZOLRNA提取试剂盒，PRIMESCRIPTRONESTEPRTPCRKITVER2购于TAKARA公司；RNA酶抑制剂，异丙醇，氯仿，75乙醇，DEPC水等。113仪器与设备光照培养箱、超净工作台、722型分光光度计、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、电子分析天平、超声细胞粉碎机、PCR仪、
11、电泳仪其他常用仪器移液器枪、玻璃试管、锥形瓶、量筒、容量瓶、烧杯、玻璃棒、搅拌器等12实验方法121四膜虫的培养四膜虫先于26，静止培养3天，培养到其对数生长期待用。接种前将分装好培养基的锥形瓶灭菌，实验使用250ML的锥形瓶，采用上述培养基进行培养。锥形瓶每瓶接入89ML四膜虫虫液。纳米TIO2浓度设置实验共设置5个质量浓度梯度，分别是0对照、1、10、100、500MG/L，每个浓度组设置三个重复。122四膜虫酶液的提取及测定1221四膜虫酶液的提取1以5000R/MIN离心20分钟沉淀虫体，将收集到的细胞用预冷的PBS洗涤三次，每次洗涤的过程同样5000R/MIN离心；2去上清，加入50
12、0UL匀浆介质，在冰浴中低速匀浆3分钟；3将细胞裂解液4000R/MIN离心10分钟，取上清；4根据试剂盒提供的方法，在紫外分光光度计上测定TCHE和SDH的活力。1222酶活力计算方法1组织匀浆中TCHE活力（测定管OD值对照管OD值）/（标准管OD值空白管OD值）标准管浓度1MOLML1匀浆蛋白含量（MGPROTML1）2组织匀浆中SDH活力（OD1值OD2值）/001反应时间取样量中蛋白含量（MGPROTML1）123四膜虫RNA的提取和基因检测本实验使用TRIZOLRNA提取试剂盒提取四膜虫总RNA1231四膜虫RNA的提取1四膜虫离心收集5000R/MIN离心20分钟，去上清后转移至
13、15MLEP管中，再次离心，尽量去除残留的培养液；2振荡将收集好的虫体，加入1MLTRIZOL，悬浮收集的细胞团，漩涡振荡及匀浆；3分离将匀浆样品在室温下孵育15MIN，按至少51的比例加入氯仿，盖紧管盖，充分振荡混匀并将其在冰上孵育15MIN，然后于4，12000R/MIN，离心15MIN。离心后混合物分为三层，RNA存在于上清层中。4RNA的沉淀将上清层转移至干净的EP管中，加入等体积冰浴的异丙醇，缓慢颠倒混匀，将样品在20下孵育20MIN以上，4，12000R/MIN，离心10MIN，RNA通常呈片状沉淀附着于管壁或管底；5RNA的洗涤弃去上清，用冰浴的75乙醇洗涤RNA沉淀12次，按1
14、MLTRIZOL至少加入1ML75乙醇的比例加入，颠倒洗涤管壁，并漩涡振荡样品，尽可能让沉淀悬浮，4，12000R/MIN，离心5MIN，弃去上清，晾干沉淀；6RNA的溶解及保存适度晾干沉淀避免过分干燥，会降低其可溶性，用适量无RNA酶水来溶解RNA，抽提好的RNA保存于70，必要时应加入适量抗RNA水解酶。1232基因的检测1ONESTEPRTPCR扩增反应体系如下表4表4ONESTEPRTPCR扩增反应体系2ONESTEPBUFFER125LF05LR05LRNA5LPRIMESCRIPTRONESTEPENZYMEMIX1LRNASEFREEH2O55LTOTAL25L反应程序设置如下表
15、5表5ONESTEPRTPCR扩增反应程序循环次数温度时间11509430MIN2MIN209430S5530S7230S7210MIN4保存2ACTIN、MDR1及HSP70基因的检测表6ACTIN、MDR1及HSP70基因的检测退火温度及循环数基因退火温度循环数ACTIN5620MDR15528HSP70552613数据处理实验数据运用EXCEL软件处理，T检验。2结果21不同浓度纳米TIO2对四膜虫乙酰胆碱酯酶TCHE活力的影响采用不同浓度纳米TIO2处理四膜虫后对四膜虫乙酰胆碱酯酶TCHE活力的影响图1。结果表明与对照组0MGL1相比，低浓度组1MGL1、10MGL1乙酰胆碱酯酶活力分
16、别下降了1096、1177，但是均无显著差异差异不显著，P005；高浓度组100MGL1、500MGL1乙酰胆碱酯酶活力分别下降了6488、7222差异显著，P005，500MGL1浓度的纳米TIO2对其活力影响有显著差异差异显著，P005。由此可见，四个浓度组的纳米TIO2对四膜虫琥珀酸脱氢酶活力均有抑制作用，且随着纳米TIO2颗粒浓度的增加，其抑制作用逐渐增强。其中500MGL1浓度的纳米TIO2抑制作用最强。000501015020250303504045050110100500纳米二氧化钛浓度MG/LSDH活力U/MGPROT图2不同浓度纳米TIO2处理后对四膜虫琥珀酸脱氢酶SDH活力
17、的影响23不同浓度纳米TIO2对四膜虫MDR1及HSP70基因表达的影响（1）采用不同浓度纳米TIO2处理后四膜虫ACTIN基因的表的结果图3。结果表明，同一处理时间，不同处理浓度下四膜虫ACTIN基因表达量是较为一样的。ACTIN基因是管家基因，它在各组织和细胞中的表达相对稳定，在检测蛋白的表达水平变化时常用来作为参照。此处ACTIN的表达量较为一致，说明，前期的工作满足后续的实验要求。图3同一处理时间，不同处理浓度下四膜虫ACTIN基因RTPCR结果（2）采用不同浓度纳米TIO2处理后四膜虫多药耐受基因MULTIDRUGRESISTANCEGENE；MDR1的表达结果图4，用BIOSENS
18、GELIMAGINGSYSTEM软件进行处理分析后得出MDR1相对含量（图5）结果表明，同一处理时间，不同处理浓度下四膜虫多药耐受基因（MDR1）表达量明显高于对照组，且随着纳米TIO2浓度的升高，MDR1的表达量减少。当用不同浓度的纳米TIO2处理四膜虫后，从1MGL1ACTIN的纳米TIO2浓度起，MDR1的表达量明显增多，且在100MGL1和500MGL1为显著性增加，说明随着纳米TIO2浓度的升高四膜虫开始作出反应，因此，随着纳米TIO2浓度的升高MDR1的表达量逐渐增加。图4同一处理时间，不同处理浓度下四膜虫MDR1基因RTPCR结果图5MDR1相对含量（3）采用不同浓度纳米TIO2
19、处理后四膜虫热休克蛋白基因（HEATSHOCKPROTEINHSP70）的表达的结果图6，用BIOSENSGELIMAGINGSYSTEM软件进行处理分析后得出HSP70相对含量（图7）结果表明，纳米TIO2处理后HSP70的表达量在1MGL1和10MGL1时较对照组增加，随着处理浓度的升高HSP70表达量减少。当用不同浓度的纳米TIO2处理四膜虫后，100MGL1和500MGL1的纳米TIO2使HSP70的表达量减少，且低于对照组的表达量，说明纳米TIO2的浓度在四膜虫的可承受范围MDR1内，随着纳米TIO2浓度的升高四膜虫开始适应并缓解纳米TIO2对其的影响，因此，随着纳米TIO2浓度的升
20、高HSP70的表达量有降低的趋势。图6同一处理时间，不同处理浓度下四膜虫HSP70基因RTPCR结果图7HSP70相对含量HSP703讨论纳米技术是当今高科技发展中最快的领域之一，大约超过200种的纳米材料被用于个人、商业、医药和军事等领域。目前，全球有超过140家的厂家在从事纳米颗粒的生产26。纳米技术是把双刃剑，高科技纳米材料生产使用可能给人们带来潜在的健康危害负面影响随着规模化生产和纳米产品的普及，纳米材料将进入我们的土壤、空气和水环境，进而不可避免地进入生物体内27。环境中的生物降解纳米粒子可能会导致细胞内细胞器积聚纳米颗粒，如破坏完整或细胞内基因改变的变化28。乙酰胆碱酯酶TCHE是
21、胆碱能神经递质乙酰胆碱的水解酶，具有羧肽酶和氨肽酶的活性，乙酰胆碱酯酶参与细胞的发育和成熟，能促进神经元发育和神经再生。直接参与植物神经功能调节、肌肉运动、大脑思维、记忆等重要功能。胆碱酯酶活力改变时，以上各组织器官功能也会改变。本实验中，纳米TIO2颗粒对四膜虫乙酰胆碱酯酶TCHE活力的影响随着颗粒浓度的提高，其抑制作用越强；四个浓度组的纳米TIO21MGL1、10MGL1、100MGL1、500MGL1对四膜虫乙酰胆碱酯酶TCHE活力均有抑制作用，且随着纳米TIO2颗粒浓度的增加，其抑制作用逐渐增强。说明通过纳米TIO2的处理，四膜虫乙酰胆碱酯酶活力降低，随着纳米TIO2浓度的增加，其活力
22、下降得越多。琥珀酸脱氢酶SDH是线粒体的一种标志酶，是连接氧化磷酸化与电子传递的枢纽之一。SDH可为真核细胞线粒体和多种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子，其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程度的指标。琥珀酸脱氢酶存在于所有有氧呼吸细胞，和线粒体膜牢固结合，是三羧酸循环中唯一与内膜结合的酶。本实验中，纳米TIO2颗粒对四膜虫琥珀酸脱氢酶SDH活力的影响随着颗粒浓度的提高，其抑制作用越强；四个浓度组的纳米TIO21MGL1、10MGL1、100MGL1、500MGL1对四膜虫琥珀酸脱氢酶SDH活力均有抑制作用，且随着纳米TIO2颗粒浓度的增加，其抑制作用逐渐增强。说明纳米TIO2的处理对四膜虫琥
23、珀酸脱氢酶活性有影响，且随着其浓度的增加，酶活力逐渐下降。多药耐受基因MDR1是一种重要的抗药物质，是在研究中发现的一种能使肿瘤多种自然生物类抗肿瘤发生交叉耐受的基因。本实验中，随着纳米TIO2颗粒浓度的增加，MDR1基因的表达逐渐增多，且各个处理组1MGL1、10MGL1、100MGL1、500MGL1的表达量均高于对照组0MGL1，说明四膜虫在纳米TIO2的胁迫下，为了维持机体功能的有序性，对外界环境作出反应，增强MDR1基因的表达，提高了自身的耐药性。热休克蛋白HSP70是指在生物体内普遍存在、进化上高度保守、具有重要生理功能的蛋白质家族，是生物在应激条件下产生的一种非特异性、能增强机体
24、对创伤、高低温、以及细菌和病毒感染等适应能力的防御性产物。此外，各种应激因素，如细菌和病毒的感染、温度的高低、缺氧和缺血等都可诱导细胞产生HSP70。HSP70能促进与维持新生多肽链的正确折叠，调节细胞的生长、分裂、分化、死亡。本实验中，HSP70的表达量在开始时呈上升趋势，后下降。分析其原因，表达量增加是四膜虫的应激反应，以增强其对外界环境的适应能力。但随着纳米TIO2浓度的增大，可能对四膜虫机体造成了伤害，HSP70表达量下降，进而影响到新生多肽链生成，引起蛋白质损伤、变性。在氧化纳米颗粒胁迫下，四膜虫机体可能会发生反应生物体暂时所处状态的两种应激改变诱导或抑制，但这些改变并不是最终的毒理
25、效应。抑制效应反映了生物体对环境压力十分敏感并可能受到进一步的损伤；而诱导效应则是生物体克服不良环境和防止中毒的一种适应性改变29。本研究初步证实氧化纳米颗粒TIO2对四膜虫机体的影响均表现出浓度依赖性。而对其具体的影响机理，还需更进一步的研究。参考文献1白春礼纳米科技及其发展前景J科学通报,2001,46289922李卫华,市原学,李洁斐,等纳米材料的毒理学和安全性J环境与职业医学,2006,2354304343黄振峰浅谈纳米二氧化钛J科技创新导报,2010,1831361374NELA,XIAT,MADLERL,ETALTOXICPOTENTIALOFMATERIALSATTHENANOL
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