1、本科毕业设计（20_届）纳米ZNO对斑马鱼生理代谢及相关基因表达的影响所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录引言141材料与方法1411材料14111实验材料与试剂14112主要仪器15113实验动物1512实验动物的处理1513实验方法15131酶液的提取15132生理指标的测定原理15133相关基因的测定方法1614数据处理172实验结果1721纳米ZNO对斑马鱼肝脏中生理代谢的影响17211纳米ZNO对斑马鱼肝脏中TP的影响17212纳米ZNO对斑马鱼肝脏中ALP的影响18213纳米ZNO对斑马鱼肝脏中TBIL的影响1822纳米ZNO对斑马鱼肝脏中相关基因表达的
2、影响19221纳米ZNO对斑马鱼不同时间处理后肝脏中总RNA的影响19222纳米ZNO对斑马鱼肝脏中MDR1基因表达的影响20223纳米ZNO对斑马鱼肝脏中NKA基因表达的影响203讨论2131纳米ZNO对斑马鱼肝脏中相关生理代谢影响的机制21311纳米ZNO对斑马鱼肝脏中TP影响的机制21312纳米ZNO对斑马鱼肝脏中ALP影响的机制21313纳米ZNO对斑马鱼肝脏中TBIL影响的机制2232纳米ZNO对斑马鱼肝脏中相关基因表达影响的机制22321纳米ZNO对斑马鱼肝脏中MDR1基因表达影响的机制22322纳米ZNO对斑马鱼肝脏中NKA基因表达影响的机制2233纳米材料对斑马鱼毒性相关机制的
3、探讨224展望23致谢错误未定义书签。参考文献24摘要纳米材料具有特殊的物理和化学性质，使其在各个领域的应用日益广泛。人类及动物与纳米材料的接触已经不可避免，纳米材料的生物安全越来越被人们关注。本文应用浸浴法研究了纳米ZNO对斑马鱼（DANIORERIO）肝、肌肉、肠、鳃中几种生理指标以及利用RTPCR技术检测了纳米ZNO对肝脏中MDR1（MULTIPLEDRUGRESISTANCEGENE）、NKA（NAKATPASE）基因表达的影响，结果显示与对照组相比，01MGL1的纳米ZNO处理6H时，斑马鱼肝脏TP（PROTEINTOTAL）显著增加（P005），处理24H、48H时TP显著下降（P
4、005）；处理6H和72H时肝脏ALP（CALKALINEPHOSPHATASE）显著性增加（P005）；处理72H肝脏中TBIL（BILIRUBINTOTAL）显著性下降（P005）；用BIOSENSGELIMAGINGSYSTEM软件对所得电泳图进行分析，以各基因的绝对含量与相应ACTIN的绝对含量作比，不同时间处理的斑马鱼肝脏中MDR1、NKA与对照组相比存在显著性差异（P005）。关键词纳米材料；斑马鱼；生理指标；MDR1；NKAABSTRACTOWINGTONANOMATERIALSUNIQUEPHYSICALANDCHEMICALPROPERTIES,THEYHAVEBEENUSE
5、DEXTENSIVELYINVARIOUSFIELDSHUMANANDANIMALSEXPOSURETONANOMATERIALSAREINEVITABLETHEBIOSAFETYOFNANOMATERIALSISSTARTINGTOGAINMOREANDMOREATTENTIONTHEEFFECTSOFNANOZNOONSEVERALPHYSIOLOGICALINDICESINLIVER,MUSCLE,GUT,ANDGILLTISSUESOFZEBRAFISHWERESTUDIEDWITHADDICTIVEINDEXMETHODATTHEMOLECULARLEVELOFTOXICITY,RA
6、LATIVEEXPRESSIONOFMRNAFORMDR1MULTIPLEDRUGRESISTANCEGENEANDNKANAKATPASEINZEBRAFISHWEREDETERMINEDBYRTPCRAFTERTREATWITH01MGL1NANOZNOFORUPTO72HCOMPAREDTOTHECONTROL,THELIVERPROTEINTOTALTPOFZEBRAFISHEXPOSEDTO01MGL1NANOZNOFOR6HWEREINCREASEDSIGNIFICANTLYP005NEVERTHELESS,AT24H,48HWEREDECREASEDSIGNIFICANTLYP0
7、05THELIVERCALKALINEPHOSPHATASEALPOFZEBRAFISHEXPOSEDFOR6H,72HWEREINCREASEDSIGNIFICANTLYP005NEVERTHELESS,THECONTENTOFLIVERSBILIRUBINTOTALTBILFOR72HTREATEDWEREDECREASEDSIGNIFICANTLYP005THEBIOSENSGELIMAGINGSYSTEMSOFTWAREWASUSEDTODEALWITHTHEAGAROSEGELELECTROPHORESISIMAGESTOGETTHECORRESPONDINGRATIOSGENE/A
8、CTINTHERALATIVEEXPRESSIONOFMRNAFORMDR1ANDNKAINZEBRAFISHSLIVERATDIFFERENTCONDITIONSUPTO72HWERESIGNIFICANTLYHIGHERTHANTHOSEINTHECONTROLGROUPP005KEYWORDSNANOMATERIALSZEBRAFISHPHYSIOLOGICALINDICESMDR1NKA14引言根据ASTM标准的定义，纳米材料是指至少在一个维度上其尺寸在1100NM范围内的材料1。纳米材料因其特殊的颗粒尺寸而表现出许多特有的物理化学性质2。纳米材料因其具有广阔应用前景和重要理论价值，被
9、认为是当前很有潜力的新型功能材料。纳米技术自20世纪70年代问世以来，已广泛应用于材料、机械、化工、计算机、半导体、光学、纺织、石油、汽车、家电、化妆品、环境保护、医药卫生等领域3,4，并正在给人类社会带来巨大的变化。因此，纳米技术被认为是下一次的工业革命5,6,7，并迅速成为全世界关注的热点前沿科技领域。纳米氧化锌，别名纳米锌白（ZINCWHITENANOMETER），一种多功能性的新型无机材料，呈白色或微黄色，是颗粒尺寸范围在1100NM之间的超微细粉。纳米ZNO具有普通ZNO无法比拟的特殊理化性质。正是由于纳米ZNO的优越性，使得越来越多的科研人员关注于研究纳米ZNO的毒效应机制及应用前
10、景。有关探讨纳米技术的安全性和人工纳米材料（MANUFACTUREDNANOMATERIALS，MNMS）的生物效应以及对健康、环境的不利影响的研究，在2000年11月以来，陆续在SCIENCE和NATURE杂志中多次发表8,9,10。随着纳米生物安全性问题的提出，研究表明，纳米材料侵入生物体的途径有呼吸系统暴露，通过皮肤接触介入和通过消化道进入。纳米材料具有独特的“纳米效应”，根据其对生物体潜在的作用效果不同，可将生物学效应分为营养效应、毒性效应和生态安全性。根据纳米材料作用部位和作用方式不同又可将其分为生物体的吸收转移效应、组织伤害效应、细胞毒害效应。但由于纳米科技发展时间短，许多研究尚处
11、于实验研究阶段，缺乏在对生物体健康效应的研究和对生态环境效应影响的研究。OBERDRSTER的研究结果首次报道了当大嘴黑鲈（LARGEMOUTHBASS,MICROPTERUSSALMOIDES）暴露于05MGL1的富勒烯水悬浮液（NC60/THF，采用THF作助溶剂）48H后，其幼鱼脑组织能够产生严重的脂质过氧化11。因此，越来越多的科研团队关注于纳米材料的危害性，此后纳米材料对水生生态系统的安全性研究陆续开展。当前纳米材料的生态毒理学研究较少，特别是金属纳米材料（或金属氧化物纳米材料）。目前有关纳米ZNO颗粒对生物的影响及生物效应的受试生物主要为小鼠、微生物和低等水生植物，对水生动物的效应
12、研究较少，更未见有研究纳米ZNO对鱼肝损伤及相关基因表达的报道。斑马鱼ZEBRAFISH（DANIORERIO）是一种硬骨鱼，属于辐鳍亚纲（ACTINOPTERYGII），鲤科（CYPRINIDAE），短担尼鱼属（DANIO）。斑马鱼除了具有经济、观赏价值外，由于个体小，周期产卵，且产卵周期短、产卵量高、卵大、体外受精、体外发育等一系列特点被广泛应用于胚胎学、发育生物学、毒理学、分子生物学等研究，被喻为理想的分子生物学和免疫学研究的脊椎动物模型，具有很高的科研价值和广泛的应用前景，是四大模式生物之一。本实验希望通过纳米ZNO对斑马鱼的生理代谢及相关基因的研究，为该领域的研究提供参考，积累数据，
13、更为深入了解纳米ZNO的毒性及其机制提供基础依据。1材料与方法11材料111实验材料与试剂氧化纳米材料购于杭州大洋纳米新材料有限公司，ZNO（平均粒径25NM）。碱性磷酸酶（CALKALINEPHOSPHATASE,ALP）、总蛋白（PROTEINTOTAL,TP）、总胆红素（BILIRUBINTOTAL,TBIL）15试剂盒购于美康生物科技有限公司。匀浆介质的制备准确称取121GTRIS及3723MGEDTA2NA加入500ML水中，再用200MMOLL1HCL滴定至PH74，然后加入342G蔗糖，8G氯化钠，再用蒸馏水补充至1000ML，放入盐水瓶中，以9磅压力进行消毒或者微波炉消毒35M
14、IN后放4冰箱备用。RNAISOPLUS提取试剂盒（购于上海生工），PRIMESCRIPTRONESTEPRTPCRKITVER2（购于TAKARA公司）；RNA酶抑制剂，异丙醇，氯仿，75乙醇，DEPC水、KMNO4、去氯试剂等。112主要仪器THERMONANODROP1000超微分光光度计；PCR仪EPPENDOLFAG22331；日立7020全自动生化分析仪上海曼普生物科技有限公司；台式高速冷冻离心机NEOFUGE15R；新型电热恒温鼓风干燥箱DHG9240A，宁波江南仪器厂；自动蒸汽高压灭菌器MLS3750，宁波江南仪器厂制冰机；电子分析天平AB104N，METTLERTOLEDO；
15、海尔冰箱BCD208A/C；海尔立式冷藏柜SC316，青岛海尔特种电冰柜有限公司冰箱；10L、50L水族箱。113实验动物斑马鱼购于天胜花鸟市场，实验前驯养一周，并于实验前1D停止投饵。实验用水为去氯充分曝氧的自来水，水温2428，PH值6872，实验期间用氧气泵不间断充氧。实验时随机选取健康活泼的斑马鱼用于实验。12实验动物的处理准确称取纳米ZNO颗粒，放于烧杯中。先用少量去氯离子水溶解，置于超声波振荡仪中振荡约30MIN后将溶液倒入鱼缸中，使水族箱中纳米ZNO的终浓度为01MGL1，另设一个对照组（CK）。每组放养斑马鱼30尾，在水族箱中暴露饲养。分别在第6H、12H、24H、48H、72
16、H随机取出5尾实验鱼用于样品制备。13实验方法131酶液的提取待暴露实验进行到0H、6H、12H、24H、48H、72H时每组分别取5尾实验鱼，迅速解剖分别取出其肝、肌肉、鳃、肠组织00101G，用4的086生理盐水清洗，滤纸吸干表面水分，电子天平准确称量，然后按19加入预先冷冻的02MOLL1蔗糖TRISHCL缓冲液（PH74），用手动匀浆器在冰浴条件下匀浆910分钟，以3000RMIN1离心15分钟，取上清液，稀释成1组织匀浆，依照试剂盒测定各组生理指标。132生理指标的测定原理ALP含量的测定原理4NPP2A2M1P4硝酸酚2A2M1P硝酸盐4NPPH2O4硝酸酚硝酸盐ALPALP在40
17、5NM处测定4硝酸酚的生成速度，计算出ALP的活力。计算公式ALP活力（UL1）（A测定/MINA空白/MIN）FF反应总体积ML1000/样品体积ML毫摩尔消光系数1016说明10，比色杯的厚度；毫摩尔消光系数，405NM是为185；F405NM为2757TP含量的测定原理按照美国临床化学学会（AACC）推荐的候选参考方法配制，其原理为蛋白质中的肽键（CONH）在碱性溶液中能与二价铜离子形成蓝紫色络合物，其色泽与蛋白质含量成正比，其最大吸收波长为540NM。TP浓度（GL1）TP标准浓度A样品/A标准TBIL含量的测定原理样品中的总胆红素在表面活性剂及强酸存在的条件下，与重氮盐反应，形成偶氮
18、胆红素，在分光光度计570NM下测定。其值与样品中的总胆红素的含量成正比。计算公式胆红素（MOLL1）A样品管/A校准管标准液浓度133相关基因的测定方法按照RNAISOPLUSTAKARA公司提取斑马鱼肝脏组织中总RNA。（1）斑马鱼肝脏组织通过液氮处理研磨成细粉，加1MLRNAISOPLUS混合。组织匀浆样品体积一般低于RNAISOPLUS体积的10。（2）分离在室温下，对匀浆样品孵育15MIN，直到样品呈透明且无颗粒为止。以体积比为51（RNAISOPLUS氯仿）的量加入氯仿。通过盖紧管盖振荡混匀后，于冰上孵育15MIN，12,000G离心（4，15MIN）。保留上清层（RNA）。（3）
19、沉淀RNA转移上清层至一干净离心管，加体积比为11的冰浴异丙醇，混匀，孵育20MIN以上（20），12,000G离心（4，10MIN）。（4）洗涤RNA弃上清，将RNA沉淀用75乙醇（冰浴）洗涤一次，以RNAISOPLUS75乙醇（V/V11）。洗涤离心管管壁，使沉淀悬浮，12,000G离心（4，5MIN），去上清，晾干。（5）溶解RNA适度干燥RNA沉淀，加入50100L无RNA酶水（或TAE溶液），溶解RNA，于70保存。将提取的RNA按以下方法进行相关基因的检测。（1）ONESTEPRTPCR扩增反应体系如下表1ONESTEPRTPCR反应体系RNASEFREEH2O55LFPRIME0
20、5LRPRIME05L2ONESTEPBUFFER125LRNA5LPRIMESCRIPTRONESTEPENZYMEMIX1LTOTAL25L反应程序设置如下表2ONESTEPRTPCR反应条件17循环次数温度时间11509430MIN2MIN349430S5530S7245S7210MIN16保存（2）ACTIN、NKA、MTF1基因的检测表3引物的退火温度及循环数基因退火温度循环数ACTIN5426NKA5826MDR1603814数据处理实验数据均采用SPSS软件分析，通过ONEWAYANOVA（以TUKEYSTEST作为POSTHOCANALYSIS）分析法及多重分析法（LEASTS
21、IGNIFICANTDIFFERENCE,LSD）在对照组和受试组间进行统计学分析。P005时认为存在显著性差异，P001时认为存在极显著差异，P005时无显著性差异。2实验结果21纳米ZNO对斑马鱼肝脏中生理代谢的影响211纳米ZNO对斑马鱼肝脏中TP的影响用SPSS软件（ONEWAYANOVA）分析实验数据显示不同时间段肝脏中TP的变化如图1所示，纳米ZNO对斑马鱼不同时间处理后，对TP含量存在极显著性差异（P001）（表4）。多重分析（LSD）结果显示与对照组相比，处理6H时，斑马鱼肝脏中TP含量显著增加（P005）；而处理24H、48H时，TP含量显著减少（P005）。图101MGL1
22、纳米ZNO对斑马鱼不同时间处理后肝脏中TP的变化00051015202530354045500H6H12H24H48H72H处理时间TP值图101MGL1纳米ZNO对斑马鱼不同时间处理后肝脏中TP的影响18212纳米ZNO对斑马鱼肝脏中ALP的影响不同时间段肝脏中ALP含量的变化如图2所示，用ONEWAYANOVA分析表明与对照组相比，用01MGL1纳米ZNO不同时间处理后，对斑马鱼ALP值存在极显著性差异（P001）（表4）；多重分析（LSD）结果显示实验组中，当处理时间为6H和72H时，斑马鱼肝脏中ALP含量显著增加（P005）。01MGL1纳米ZNO对斑马鱼不同时间处理后肝脏中ALP的变
23、化0050010001500200025000H6H12H24H48H72H处理时间ALP值图201MGL1纳米ZNO对斑马鱼不同时间处理后肝脏中ALP的影响213纳米ZNO对斑马鱼肝脏中TBIL的影响用ONEWAYANOVA分析实验数据发现不同时间段肝脏中TBIL的变化如图3所示，纳米ZNO对斑马鱼不同时间处理后，对TBIL值存在较显著差异（P005）（表4）。多重分析（LSD）结果显示与对照组相比，处理72H处理时，肝脏中TBIL含量显著减小（P005）；01MGL1纳米ZNO对斑马鱼不同时间处理后肝脏中TBIL的变化000102030405060708090H6H12H24H48H72H
24、处理时间TBIL值图301MGL1纳米ZNO对斑马鱼不同时间处理后肝脏中TBIL的影响19表401MGL1纳米ZNO对斑马鱼不同时间处理后肝脏中各生理指标显著性差异分析生理指标平方和DF均方F显著性TP6749513502612700062012052ALP395951115791902222175000428533312357111TBIL3335067352903422712019注F（）；F（）；表示H与对照相比存在显著性差异（N）表示H与对照相比存在高度显著性差异（N）22纳米ZNO对斑马鱼肝脏中相关基因表达的影响221纳米ZNO对斑马鱼不同时间处理后肝脏中总RNA的影响ACTIN即“
25、肌动蛋白”，是细胞的一种重要骨架蛋白，在绝大多数生物的各个组织和细胞中均有表达，表达相对恒定，常作为PCR的内参，编码ACTIN的基因称为管家基因（HOUSEKEEPINGGENE）。用01MGL1的ZNO不同时间处理后斑马鱼ACTIN基因表达的结果（图4）。总RNA分离纯化技术是分子生物学研究技术的基础，RNA的纯化通常是决定实验结果的关键。判断这个指标可以用紫外分光光度计检测，RNA纯品的OD260/OD280值为20，其值在1820之间，可以认为RNA纯度较高，大于22，则表明蛋白质杂质污染较大（表5所示）。在琼脂糖凝胶电泳检测中可以看到28S和18S两条带，并在亮度上大致呈2倍关系（图
26、5）。350BP122000BP1000BP750BP500BP200BP100BP356342000BP1000BP750BP500BP200BP100BP350BP图4ACTIN基因的表达水平注1对照组，2处理6H肝，3处理12H肝，4处理24H肝，5处理48H肝，6处理72H肝2000BP1000BP750BP500BP200BP100BP212345658S18S28S图5肝脏RNA凝胶电泳图注1对照组，2处理6H肝，3处理12H肝，4处理24H肝，5处理48H肝，6处理72H肝M20表5总RNA含量与纯度组号含量（NG/L纯度（260/280）对照46862016H668220712
27、H286220124H285319848H710719772H5912208222纳米ZNO对斑马鱼肝脏中MDR1基因表达的影响图6为01MGL1纳米ZNO处理斑马鱼后MDR1的表达结果。ACTIN作为内参在实验中表达程度并不完全相同，说明原处于不同时间段的RNA本身不相等，因此无法判断ZNO处理后引起的基因表达差异，采用BIOSENSGELIMAGINGSYSTEM软件对所得电泳图进行分析，并以各基因的绝对含量与相应ACTIN的绝对含量之间的作比，求出各基因的相对含量。实验数据用SPSS软件用ONEWAYANOVA分析表明，经纳米ZNO不同时间处理的斑马鱼肝脏中MDR1基因与对照组相比24H
28、、48H、72H表达显著性增加（P005）。450BP2000BP1000BP750BP500BP200BP100BP123456图6MDR1基因的表达水平注1对照组，2处理6H肝，3处理12H肝，4处理24H肝，5处理48H肝，6处理72H肝223纳米ZNO对斑马鱼肝脏中NKA基因表达的影响斑马鱼在01MGL1纳米ZNO处理后，其NKA的表达如图7所示，用BIOSENSGELIMAGINGSYSTEM软件对所得电泳图进行分析，72H内MDR1、NKA的相对表达变化如图8所示，与对照组相比，处理6H、24H、48H、72H时NKA基因表达显著性减少（P005）。320BP2000BP1000B
29、P750BP500BP200BP100BP123456图7NKA基因的表达水平注1对照组，2处理6H肝，3处理12H肝，4处理24H肝，5处理48H肝，6处理72H肝MM210H6H12H24H48H72H处理时间01MGL1纳米ZNO悬浮液处理斑马鱼72H内MDR1、NKA的相对表达的变化00010203040506123456处理时间相对表达量MDRNKA图801MGL1纳米ZNO处理斑马鱼72H内MDR1、NKA基因相对表达的影响3讨论31纳米ZNO对斑马鱼肝脏中相关生理代谢影响的机制311纳米ZNO对斑马鱼肝脏中TP影响的机制肝脏是生物体最大的腺体，参与着体内的消化、代谢、排泄、解毒以
30、及免疫等多种功能。肝脏也是最大的代谢器官，来自胃肠吸收的物质，几乎全部进入肝脏，在肝内进行合成、分解、转化、贮存。肝损害的各种病因作用于肝脏组织后，可引起不同程度的细胞损害及其功能障碍。因此，肝脏受外界攻击的主动调节能力往往较强，代偿阶段持续时间相应较长。机体氧化应激时，肝脏为负担抗氧化作用，相关应激酶活性升高，防止机体进一步的氧化损伤作用。但这种主动调节和代偿能力具有一定限度，超过某一限度酶活性就会受到抑制。本实验中，与对照组相比，当斑马鱼受到纳米ZNO胁迫时，其肝脏中TP含量表现为先显著增加（P005，6H时），后显著下降（P005，24H，48H），在72H时又表现为回升（图1），推测在
31、胁迫初期肝中TP含量的变化可能与大量表达相关抗氧化防御系统的酶（CAT,GPX）有关，而在胁迫的后期与大量消耗抗氧化酶及机体大量损耗自身蛋白有关。这与曹建萍研究用05、10、50和100MGL1硝基苯对幼龄鲫鱼肝脏的氧化胁迫作用研究结果相一致，即随着染毒时间的增加，几种酶活性变化的总体趋势是，SOD先被抑制后被诱导，CAT、GST先被诱导后有一定抑制，几种酶活性处于一种连续动态变化中且活性出现异常12。类似结果在赵于丁研究仲丁威对斑马鱼肝脏EROD（P450酶系7乙氧基3异吩唑酮脱乙基酶）中也有报道13。312纳米ZNO对斑马鱼肝脏中ALP影响的机制碱性磷酸酶是广泛分布于生物体各脏器器官中，为
32、一种专一性广泛的磷酸酯水解酶，可以催化所有的磷酸酯的水解反应和磷酸集团的转移反应，当肝组织受发生炎症时，ALP酶含量会增加，廖金花等研究表明ZN2对鲍鱼中碱性磷酸酶活力具有抑制作用14,15。而在本实验中，与对照组相比，处理6H、72H的肝脏中ALP显著升高（P005，图2），推测可能与胁迫警觉期超量表达应激蛋白有关，胁迫后期又大量消耗有关。这与蓝伟光等研究ZN对人工孵化养殖10月的真鲷生理生化作用研究结果是一致16，即ALP的升高可能与处理时间及斑马鱼在不同生长时期对金属离子的作用水平不同有关。22313纳米ZNO对斑马鱼肝脏中TBIL影响的机制胆红素（BILIRUBIN,BR）是动物体内血
33、红蛋白等化合物分解代谢的中间物或产物，胆红素不仅是一种内源性毒素，而且也是一种内源性抗氧化剂。氧化反应的发生可诱导血红素氧化酶（HEMEOXYGENASE,HO）的活性，此酶是促进胆红素形成的限速酶。处理72H的斑马鱼肝脏中TBIL显著下降（P005，图3），初步推断与斑马鱼体内大量的抗氧化物参与清除体内纳米材料有关。李晓峰等人用臭苜蓿根提取物对巨噬细胞血红素氧合酶1影响的结果与本实验结果是一致的17。如果进一步处理，TBIL可能会进一步下降。32纳米ZNO对斑马鱼肝脏中相关基因表达影响的机制321纳米ZNO对斑马鱼肝脏中MDR1基因表达影响的机制多药耐药性是指某种疾病细胞对许多结构上无关的和
34、作用机制不同的其它药物或化学品产生抗药作用，通常将编码这类蛋白的基因称为多药耐药性基因（MULTIPLEDRUGRESISTANCEGENE,MDR1）。多药耐药性是膜结合蛋白的过度表达，尤其是PGP（糖蛋白）与多药耐药结合蛋白1（MRP1），具有药物泵的功能。韩瑜等将平均粒径30NM的纳米FE3O4经腹腔注射到小鼠体内的结果显示，较高剂量（1/20LD50）的纳米FE3O4，小鼠耐受度增高18。这与本实验研究结果是一致的，与对照组相比，纳米ZNO处理48H、72H时肝脏中MDR1表达显著增加（P005，图6）。说明MDR1的表达可能具有时间依赖作用，随着暴露时间的增加，斑马鱼为维持机体的稳态
35、，在一定条件下MDR1基因被激活而编码相关蛋白以维持正常的生理功能。322纳米ZNO对斑马鱼肝脏中NKA基因表达影响的机制NAKATP酶是镶嵌在膜上的一种蛋白酶，参与生物体内的重要代谢过程，是主动运输过程中膜离子泵的重要组成部分。其主要生物学功能是维持细胞渗透压平衡，对金属离子很敏感。SFPERRY1等用REALTIMEPCR测定酸中毒虹鳟鳃中HATPASE的B亚基MRNA的相对含量，较对照（用生理盐水或140MMOLL1HCL）处理组在3H、6H、12H时HATPASE的B亚基MRNA表达显著增加（P005）19。本实验得到相反的结果，与对照组相比，纳米ZNO处理24H、48H、72H的斑马
36、鱼肝脏中NKA表达显著下降（P005，图7），可能是由于NKA基因对金属具有敏感性，在一定浓度范围内的纳米材料可能促进NKA基因的表达，超过某一范围可能会抑制NKA基因表达而影响机体渗透压。33纳米材料对斑马鱼毒性相关机制的探讨纳米材料暴露于水环境中，将会影响生物体的健康生长发育，改变生理生化、血液指标，引起病理反应等。许多研究表明，水生生物长期暴露于污染物中，生物体在不同水平将会受到影响（图9），这些影响可能危及某些细胞中酶的活性，相关受体及离子通道蛋白的表达，还可能使组织超微结构受到损伤，个体生长发育减缓，生殖能力受到影响，最终影响种群丰度和恢复率，进而改变群落结构和生物的多样性。亚细胞分
37、子细胞个体种群群落危害等级结果酶活性、受体离子通道、DNA、RNA代谢紊乱，个体死亡神经元功能、溶酶体稳定性、遗传毒变个体死亡代谢抑制免疫个体死亡代谢、生殖、行为死亡、基因池、疾病、丰度、恢复率结构、功能生殖种群数量改变多样性图9纳米材料毒性影响梯度机体内环境的稳定是生命活动的基础。机体在受到内外环境及其他各种因素刺激时，会出现全身性非23特异性适应反应，即应激反应（STRESSRESPONSE）。而往往此时，生物体会除具有防御代偿外，还会表现出分解代谢增加，合成代谢减少，代谢率明显升高，相关急性应激蛋白大量表达（ACUTEPHASERESPONSEPROTEIN），一旦抵御机制被耗竭，机体内
38、环境严重失调，相继出现一个或多个器官衰竭，最终生物体归于死亡。因此生物体通过一定机制来维持内环境的稳态将是非常重要的。神经系统、内分泌系统、免疫系统在维持机体的内环境稳定中发挥着重要的作用。三大系统是以一定的物质基础作为支撑，各个系统各司其职又相互协作。几乎所有免疫细胞上都分布着数量不等的神经递质受体和内分泌激素受体；此外神经递质、神经肽和激素等可通过旁分泌和自分泌、内分泌途径调节免疫应答；另外三大系统通过共用一套信息分子神经肽、激素、淋巴因子及相应受体，在各系统信息交流和调节中起着重要作用。根据实验及相关文献报道，纳米材料的毒性机制可能为（1）内分泌系统如纳米材料诱导细胞产生活性氧自由基，破
39、坏细胞脂类、蛋白质和DNA大分子物质，产生脂质过氧化物质，造成DNA损伤，最终导致细胞凋亡；（2）免疫系统如纳米材料引起的氧化胁迫，将会影响致炎基因的转录过程，该过程主要通过NFB作用于细胞核，激活致炎基因的启动子而实现的；（3）神经系统如纳米材料通过嗅觉神经通路（鼻腔与嗅球之间）的突触进入嗅球并迁移至大脑，引起中枢神经系统内巨噬细胞炎性蛋白、胶质纤维等MRNA的表达，影响线粒体数量，内质网核糖体脱落，增加肿瘤坏死因子分泌，自由基增加等20（图10）。O2O2SODH2O2CT或GPXH2OOHDNA链断裂脂质过氧化物酶失活纳米材料氧化胁迫信号通路NFB炎症基因炎症自由基代谢物代谢共价连接DN
40、A共价连接蛋白质氧化还原循环甲状腺胸腺胰腺性腺肾上腺激素细胞因子内分泌激素细胞因子交感、副交感神经交感、副交感神经免疫系统内分泌系统下丘脑腺垂体中枢神经系统图10纳米材料可能的毒性机制4展望随着人类生产技术的不断发展和进步，纳米材料和纳米技术已经越来越广泛的应用于人们的日常生活中，其对环境和健康的影响也越来越大。因此，对纳米材料的研究，来评价纳米材料环境和健康风险，对于保证纳米技术的健康长期和可持续发展具有十分重要的意义。通过实验发现有待进一步研究的方面有21,22（1）目前仍停留在对单个应激原或几个生物学效应结果的研究，缺少对不同纳米材料之间及不同生物效应间作用的研究；（2）而对纳米材料从进
41、入机体开始，直到到达靶器官并产生积累，期间将产生怎样的生物效应更需要进一步的研究，即NRAC（NANOMATERIALSRISKASSESSMENTCHAIN）的确立，以及决定纳米材料毒性的关键参数的研究，从生物机体、器官、组织、细胞、分子不同水平来解释纳米材料与生物体24之间的关系。参考文献1ASTME245606TERMINOLOGYFORNANOTECHNOLOGYS20062张立德,牟季美纳米材料和纳米结构M北京科学出版社,20013NATIONALRESEARCHCOUNCIL2002SMALLWONDERS,ENDLESSFRONTIERSAREVIEWOFTHENATIONALN
42、ANOTECHNOLOGYINITIATIVENPP12WASHINGTON,DC,NATIONALACADEMYPRESS4PENTTINENP,TIMONENKL,TIITTANENPETALULTRAFINEPARTICLESINURBANAIRANDRESPIRATORYHEALTHAMONGADULTASTHMATICSJEURRESPJ,2001,1734284355周全法纳米材料的应用和产业化J江苏技术师范学院学报,2002,8483876WHITEHNATIONALNANOTECHNOLOGYINITIATIVELEADINGTOTHENEXTINDUSTRIALREVOLUT
43、IONNTHEWHITEHOUSE,OFFICEOFTHEPRESSSECRETARY,WASHINGTON,DC7LAMCW,JAMESJT,MCCLUSKEYRETALPULMONARYTOXICITYOFSINGLEWALLCARBONNANOTUBESINMICE7AND90DAYSAFTERINTRATRACHEALINSTILLATIONJTOXICOLOGICALSCIENCES,2004,7711261348OBERDRSTEREMANUFACTUREDNANOMATERIALSFULLERENES,C60INDUCEOXIDATIVESTRESSINTHEBRAINOFJUV
44、ENILELARGEMOUTHBASSJENVIRONHEALTHPERSPECT,2004,11210105810629GORMANJTAMINGHIGHTECHPARTICLESNSCIENCENEWS,2002,16120020110GILESJNANOPARTICLESINTHEBRAINNNATURENEWS,JANUARY200411SERVICERFNANOTECHNOLOGYCALLSRISEFORMORERESEARCHONTOXICOLOGYOFNANOMATERIALSJSCIENCE,2005,3105754160912曹建萍硝基苯对鲫鱼肝脏的氧化损伤研究,东北师范大学
45、硕士学位论文D,200713赵于丁5种稻田常用杀虫剂对斑马鱼的毒性及亚致死效应D,福建农林大学硕士学位论文,200714廖金花,陈清西金属离子对鲍鱼碱性磷酸酶活力的影响J厦门大学学报,2004,43121515BOGUSLAWS,KATHLEENMH,EVANRKAREVISEDMECHANISMFORTHEALKALINEPHOSPHATASEREACTIONINVOLVINGTHREEMETALIONSJJMOLBIOL,2000,991303131116蓝伟光,陈霓,杨孙楷重金属对真鲷生理生化作用的研究J海洋学报,1993,151929717李晓峰,董艳玲,郭远瑾等臭苜蓿根提取物对巨噬细
46、胞血红素氧合酶1表达的影响J海南医学院学报,2009,15656957518韩瑜,尹龙萍,龙玲等2种纳米材料在小鼠体内分布及毒性作用J中国公共卫生,2009,7121319PERRYSF,SHAHSAVARANIA,GEORGALISTMETALCHANNELS,PUMPS,ANDEXCHANGERSINTHEGILLANDKIDNEYOFFRESHWATERFISHESTHEIRROLEINIONICANDACIDBASEREGULATIONJJOURNALOFEXPERIMENTALZOOLOGYPARTACOMPARATIVEEXPERIMENTALBIOLOGY,2003,300A15
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