1、本科毕业论文（20_届）拟除虫菊酯类农药降解菌的生理特性研究所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1【摘要】拟除虫菊酯类农药是在天然除虫菊酯农药的化学结构基础上研究发展起来的一类高效、低毒仿生农药，其使用量逐年增加，因此，拟除虫菊酯类农药的残留问题已成为一个备受关注的问题。本论文首先建立了菌液中氯氰菊酯、溴氰菊酯的提取方法，氯氰菊酯在001MG/L浓度条件下回收率达到971；溴氰菊酯在001MG/L浓度下达到966，表明建立了菌液中氯氰菊酯、溴氰菊酯的高效分离纯化方法；在此基础上，通过对拟除虫菊酯类农药降解菌的生理特性的研究，如降解时间、温度、PH等，结果表明，在20、2
2、8、353种不同温度条件下，微生物生长量差距很大，其中28条件下微生物生长最为适宜，且在28条件下，在不同的PH条件下，氯氰菊酯在PH为6的条件下降解效率最高，溴氰菊酯在PH为7的条件下降解效率最大。【关键词】拟除虫菊酯；降解菌；生物修复；筛选分离RESEARCHOFPHYSIOLOGICALCHARACTERISTICSOFTHEPYRETHROIDSDEGRADINGSTRAIN【ABSTRACT】THEPYRETHROIDSISTHENEWKINDOFBIONICPESTICIDEWITHHIGHEFFECTIVEANDLOWTOXICITYDUETOTHEABUSEOFPYRETHRO
3、IDS,THERESIDUALPROBLEMRECEIVETHEWIDELYATTENTIONINTHISSTUDY,AMETHODWASDEVELOPEDFORHIGHLYEFFECTIVEISOLATINGCYPERMETHRINANDFENVALERATEINBACTERIASOLUTIONSSIGNIFICANTRECOVERIES971AND966WEREOBTAINEDFORCYPERMETHRINANDFENVALERATEBYGCECDDETERMINATION,RESPECTIVELYFURTHER,THEOPTIMUMTEMPERTUREANDPHFORTHEDEGRADA
4、TIONBACTERIAOFPYRETHROIDSWERE28CANDPH67THERESULTSSHOWEDTHATTHESTRAINHADOBVIOUSEFFECTONTHEREMOVALOFPYRETHROIDSRESIDUAL【KEYWORDS】PYRETHROIDSDEGRADATIONBACTERIUMBIOREMEDIATIONSCREENSEPARATION2目录中英文摘要1前言12实验部分321材料与仪器322试验方法3222气象色谱测定323环境条件对METHYLOPHAGAMARINASTRAIN101216降解菌生长状况和降解率的影响33结果与讨论331氯氰菊酯、溴氰菊
5、酯的回收率332微生物生长情况433不同温度下氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效率433120温度下氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效果433235温度下氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效果433328温度下氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效果534不同PH氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效率5341不同PH条件下氯氰菊酯的降解率5342不同PH条件下溴氰菊酯降解率54小结6致谢错误未定义书签。参考文献711前言拟除虫菊酯类农药是继有机氯、有机磷和氨基甲酸酯类农药后兴起的在天然除虫菊酯农药的化学结构基础上研究发展起来的仿生农药。由于其具有低毒、高效、低残留、易于降解等特点而被广泛应用于农业生产1。LAFORLGE在1947年合成了第
6、一种拟除虫菊酯类农药丙烯菊酯，随后开发拟除虫菊酯的热潮在世界范围内掀起2。至今拟除虫菊酯农药种类繁多，主要有联苯菊酯、苯醚菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯等。随着生物科学研究的不断前进，曾今被认为安全，低毒的拟除虫菊酯类农药，在近年来科学研究发现，此类农药有蓄积毒性3，长期接触导致慢性疾病的危害4，5对鱼类、蜜蜂和家蚕的毒性较高6，7。这类农药作为除虫剂在水产养殖产业中有着广泛的应用，然而对于水产养殖中鱼类也有着潜在的危害，鱼体内的农药残留物能够通过食物链的传递间接的危害到人类的健康。汝少国等8运用VTG免疫印记实验法，检测出甲氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯四种菊酯类农药能
7、够诱导雄性鱼类分泌VTG，具有潜在的环境雌激素活性，并且抑制了精巢GTP和LDH生物活性，其中氯氰菊酯和溴氰菊酯明显降低了雄鱼GSI，对于鱼类有着一定的生殖毒性。GAREY9通过实验检测出氰戊菊酯会导致人子宫内膜癌ISHIKAWAVARI和乳腺癌T47D细胞系异常增殖。农药降解菌是一类利用天然存在或特殊培养的微生物，在可调控环境条件下，通过微生物的降解或生物转化，把有害污染物转变或降解为无毒无害的物质10。主要运用生物修复技术从被农药污染的土壤中分离、筛选降解菌，然后用于农药的生物降解、修复。国内外对于农药降解菌的研究很多，艾涛等11采用富集培养和平板稀释法，从农药污染的土壤中分离得到一株降解
8、能力较强的降解有机磷农药的真菌菌株L3，经鉴定为ASPERGILLUSNOMIUS，这种菌对乐果和辛硫磷降解率很大。马爱芝等12从受六六六HCH污染的土壤中分离得到对六六六高度选择性降解的菌株BHCA，经鉴定为鞘氨醇单胞菌属SPHINGOMONAS，对、HCH4种异构体的降解率很大。郑永良等13利用加入甲胺磷（MAP）无机盐的培养基进行富集筛选，通过对比各菌种对于MAP的降解程度成功筛选出能够在特定培养基生长的甲胺磷降解菌。得出结论该菌能以MAP作为唯一的碳源和氮源生长。庞金钊等14在加入带菌土壤的培养基内不断提高有机氯的浓度，不断富集筛选出有机氯农药降解菌。拟除虫菊酯类农药降解菌主要有产碱菌
9、属（ALCALIGENES）。虞云龙教授从蚕沙坑淤泥中分离到能以部分拟除虫菊酯和一硫代磷酸酯类农药为唯一能源生长的降解菌YF0515后又从农药厂废污水淤泥中分离能降解部分拟除虫菊酯和一硫代磷酸酯类农药的YF1116菌株被鉴定为产碱菌属的一个未知种。该分离菌株可降解三氟氯氰菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯氯菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、对硫磷、甲基对硫磷等农药。王兆守后又奖阴沟肠杆菌经诱变筛选出了对拟除虫菊酯农药降解作用的降解菌17。31微生物降解农药机理微生物降解农药的机理归纳为两大类一，直接作用于农药，通过酶促反应降解农药；二，通过微生物的活动改变化学和物理环境从而间接作用于农药。常见的作用包括矿化、共
10、代谢、生物浓缩或累积和微生物对农药的间接作用等，而通过酶促反应降解农药的方式则主要涉及氧化、脱氢、还原、水解、合成等几种反应类型。降解菌具有降解活性主要因为它体内存在的各种酶。其中的关键性酶酯酶是一类很重要的酶，只负责水解与酯有关的物质，使酯键断裂，催生多种含酯类农药。拟除虫菊酯类农药就是其中一种还酯类农药。虞云龙采用GCMS测定杀灭菊酯降解产物来推断拟除虫菊酯类农药的降解途径，结果发现YF11降解杀灭菊酯类属于矿化作用。拟除虫菊酯类农药在酶促降解过程中，首先，降解菌产生的酶特异性的切断羧酸酯键，是原农药分子生成个较小的羧酸和醇，而后再进一步氧化、脱氢18，19，20，21，生成毒性更小或者无
11、毒的化合物22。有关于农药降解菌应用研究这方面的报道相对较少，李顺鹏23从活性污泥中分离到兼厌气性降解菌产碱菌属的一个种（ALCALIGENESSP。）应用于盆栽试验、小区试验、和田间试验取得对甲基对硫磷很好降解效果。方玲24将分离到的微生物制成混合降解菌应用于盆栽和田间试验，降解效果显著。程国锋25也用试验验证降解菌对于农药残留的问题的可行性。目前，对于拟除虫菊酯类降解微生物的应用主要分为三类一类是直接降解菌液运用于土壤等环境中，2考虑其成本与效益，此类研究难以保持长远发展。第二类是通过生物工程技术，直接合成作用于农药的相关降解酶，此类技术尚还在开发中，应用还未得到广泛推行。第三类是酶的应用
12、研究，尤其是酶固定化研究尤为重要。但是国内外研究仍然甚少。降解菌能够有效的降解农药，具有高效、安全、费用低等优点，随着农药残留问题的日益严重，如何采取高效率的遏制这种现象的发生，控制环境污染的加剧程度成为现在可持续发展的一个重要环节，合理的运用降解菌及其技术，相信能够对于环境污染的控制能够达到比较理想的程度。但是，微生物降解的技术在国内外研究还不是很多，这就需要我们在农药降解科研这一领域不断突破，相信今后农药降解技术会有一个较好的发展前景。32实验部分21错误未找到引用源。211实验材料菌株METHYLOPHAGAMARINASTRAIN101216。溴氰菊酯、氯氰菊酯购自上海安谱仪器科学仪器
13、有限公司，丙酮、正己烷、异辛烷、氯化钠分析纯，购自国药集团药业股份有限公司。陪养基蛋白胨5G；磷酸高铁001G；酵母膏1G；过滤海水1000ML；PH7678。212实验仪器电热恒温水浴锅；电子天平；离心机；氮气吹干仪；岛津GC2010；冰箱；无菌操作台；振荡器等。22试验方法221菌液中氯氰菊酯、溴氰菊酯的提取方法准确量取菌样各取1ML，加入04G氯化钠、40ML正己烷/丙酮（11，V/V）混合液，涡旋混匀1MIN后，3000RPM离心10MIN，收集上清液；然后加入20ML正己烷/丙酮（11，V/V）混合液重新提取1次；将获得的上清液加入04G的无水硫酸钠，涡旋混匀，3000RPM离心5M
14、IN，取30ML的上清液，40C氮气吹干后，加入10ML异辛烷/丙酮（91，V/V）溶解，022M滤膜过滤后分析进柱检测，将获得的数据进行分析总结，绘制图表，筛选出具有降解效率的菌样进行菌种确定及理化性能测定，并记录菌落形态。222气相色谱测定样品用GCECD进行分析，实验用GC2010型气相色谱仪（日本岛津，日本），SPB5石英弹性毛细管柱（30M025MM025M）；氮气作为载气和尾吹气，流速皆为为10ML/MIN；标准溶液，样品提取液进样体积均为1L；在进样口温度为240C；在柱温为240维持3MIN，以5/MIN升至290，维持这样的条件达到5MIN；设置检测温度为320。23环境条件
15、对METHYLOPHAGAMARINASTRAIN101216降解菌生长状况和降解率的影响231温度影响把拟除虫聚酯类降解菌接种于含氯氰菊酯和溴氰菊酯混合液的海水细菌培养基中,浓度各为100MG/L，并设置三个平行实验，设置空白对照，分别于20C、28C、35C摇床培养，每天进行菌液浓度测定及降解率测定，连续测定一周，记录数据，绘制图像，确定降解菌的最适降解温度和最适降解时间。232PH影响把降解菌接种于PH分别为4、5、6、7、8的海水细菌培养基中，培养基中氯氰菊酯和溴氰菊酯混合液浓度均为100MG/L，并设置三个平行实验，设置一个空白对照实验组，把他们放置于28C摇床培养7天，并进行降解率
16、测定。3结果与讨论31氯氰菊酯、溴氰菊酯的回收率表1菌液中不同浓度氯氰菊酯、溴氰菊酯的回收率N3试剂添加浓度001MGL1005MGL101MGL1回收率RSD回收率RSD回收率RSD氯氰菊酯971469593694432溴氰菊酯965319664093837表1为不同浓度下氯氰菊酯、溴氰菊酯的回收率，从表中可以看出，在001MG/L浓度下，氯氰菊酯的回收率为971，溴氰菊酯的回收率为965，RSD分别为46、31；在005MG/L浓度下，氯氰菊酯的回收率为95，溴氰菊酯的回收率为966，RSD分别为36、40；在01MG/L的浓度下，氯氰菊酯的回收率为94，溴氰菊酯的回收率为938，RSD分
17、别为32、37。由此说明，仪器的精确性和回收率对于实验的方法是正确的，我们建立的从菌液中提取氯氰菊酯和溴氰菊酯的方法是准确的。432微生物生长情况把微生物放置于不同的温度下，20、28、35下培养数天观察结果，如图1所示，在开始的2天之内微生物都呈指数上升，速度趋势相同，两天之后再进行观察，3种温度下的微生物生长情况基本维持稳定。随着时间的变化，5天之后继续观察，由于营养物质消耗殆尽，温度过高对于微生物代谢的影响，35培养基中微生物开始下降，而20和28基本维持稳定状态。可以得出在28摄氏度的情况下微生物的生长情况最为合适。0004081216201234567时间（天）OD值20C28C35
18、C图1不同温度下微生物的生长量33不同温度下氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效率33120温度下氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效果020406080100012345678时间（天）降解率（）C20D20图220温度下氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效果图2所示为20下氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效果，由图所知，在开始阶段，两种物质的降解率在0，在7天的观察之内，氯氰菊酯和溴氰菊酯的降解率整体呈上升趋势。由此可得在20的条件下溴氰菊酯降解菌比氯氰菊酯降解菌的降解能力大。33235温度下氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效果020406080100012345678时间（天）降解率（）C35D35图335温度下氯氰菊酯、溴氰菊酯的
19、降解效果图3所示为35条件下，氯氰菊酯、溴氰菊酯降解菌的降解效果图，随着降解时间的不断提升，氯氰菊酯和溴氰菊酯的降解率基本相同，在12天内降解率持续上升，23天降解率开始下降，36天内降解率持续上升，6天以后降解率开始趋于稳定。533328温度下氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效果020406080100012345678时间（天）降解率（）C28D28图428温度下氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效果图4所示为28下氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效果，由图所知，在培养的第一天，降解率为0，1天以后降解率开始上升，24天时间降解率趋于稳定，4天以后降解率又开始大幅度上升，此时氯氰菊酯降解率开始高于溴氰菊酯的降解率，
20、到6天以后两种菊酯类降解菌的降解效率趋于相同。说明在28的条件下，随着降解时间的不断提升，氯氰菊酯和溴氰菊酯的降解菌降解率不同。由此得出，在28的环境条件下，氯氰菊酯和溴氰菊酯降解菌的降解率达到最大，具有最好的降解效果。34不同PH氯氰菊酯、溴氰菊酯的降解效率341不同PH条件下氯氰菊酯的降解率02040608010045678降解率图5不同PH条件下氯氰菊酯的降解率图5为不同PH条件下氯氰菊酯的降解率，由图可知，在PH为46阶段，氯氰菊酯的降解率从60上升到90，在PH为68降解效率缓慢下降，最终趋于平稳。由图可知，在PH6的条件下，氯氰菊酯降解菌的降解效率达到最高。342不同PH条件下溴氰
21、菊酯降解率02040608010045678降解率图6不同PH下溴氰菊酯的降解率图6为不同PH条件下溴氰菊酯的降解率，由图可知，在PH45阶段，溴氰菊酯的降解率上升，PH为56降解率下降，PH为67降解率又上升，PH为78降解率又开始下降。随着PH的变化，溴氰菊酯降解6菌的降解率也随之不同。在PH7的时候，溴氰菊酯的降解菌的降解效率达到最大。由上述实验结果得出，菊酯类农药降解菌降解过程都是在适宜的PH值条件下进行的，酸、碱既能影响降解菌的稳定性，也能直接影响降解菌产生的酶的催化活性。同时，还应考虑氯氰菊酯在碱性条件下易分解这一特点。试验时在基础培养基中加入氯氰菊酯乳液，研究中发现，在PH值为5
22、8的范围内，株菌所受到的影响程度不同。降解菌对氯氰菊酯的降解率受PH影响比较大，降解率开始时随PH值的增加而显著增加，在PH值为7时最大，而后随PH值的增加降解率略有减少。产生这种现象的原因可能是氯氰菊酯在碱性条件下稳定性逐渐下降相关。4小结通过在不同菌液浓度下对于氯氰菊酯和溴氰菊酯的分析，得知在不同浓度下溴氰菊酯和氯氰菊酯具有较好的回收率，其中氯氰菊酯在001MG/L浓度条件下回收率为971；溴氰菊酯在005MG/L浓度下回收率为966，表明建立了菌液中氯氰菊酯、溴氰菊酯的高效分离、纯化方法。温度对于菌液中微生物的生长有着很大的间接影响，通过实验分析得知，在20、28、35的3种不同条件下的
23、培养坏境中，微生物生长量差距很大，其中28的条件下微生物生长最为适宜。在不同PH的条件下，氯氰菊酯的降解率在呈缓慢上升的，其中在PH6的条件下降解效率达到最高，溴氰菊酯的降解率在PH7条件下降解效率达到最大。参考文献1李玲玉,刘艳,颜冬云,等拟除虫菊酯类农药的降解与代谢研究进展J环境科学与技术,2010,3433342王兆守,刘丽花,陈小兰,等拟除虫菊酯类农药降解菌及降解酶的研究现状J微生物学通报,2008,3558258293SAHAS,KAVIRAJAEFFECTOFAMBIENTTEMPERATUREANDDAYLIGHTONTHESURVIVALOFFRESHWATERCATFISHH
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