1、本科毕业设计（20_届）牛骨胶原蛋白提取条件的优化所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言22材料与方法321材料与试剂322仪器及设备323实验方法4231测定方法4232实验流程5233牛骨液酶法提取胶原蛋白的单因素实验6234酶提取的最佳工艺条件正交实验63结果与分析631牛骨中胶原蛋白含量632酶的活力733单因素实验结果7331加酶量对水解度的影响7332PH值对提取率的影响8333反应温度对提取率的影响8334反应时间对提取率的影响9335胃蛋白酶酶解工艺条件的优化94结论10致谢错误未定义书签。参考文献10附录错误未定义书签。摘要牛骨是肉牛加工
2、的副产品，近年来随着肉牛养殖业的发展，相关企业迫切需要解决牛骨的开发利用问题。本文采用酶解法提取牛骨中的胶原蛋白。首先测得了牛骨中的羟脯氨酸和胶原蛋白的含量分别为075和75。同时采用胃蛋白酶对牛骨液进行酶解。以胶原蛋白的提取率为指标，通过单因素试验和正交试验确定了牛骨胶原蛋白提取的优化条件。试验结果表明经预处理后得到的牛骨液在温度37，PH20，酶用量10860U/G的条件下酶解5H，其胶原蛋白的提取率达到6410。关键词牛骨；酶解；胶原蛋白ABSTRACTBOVINEBONEISABYPRODUCTOFBEEFPROCESSING,INRECENTYEARSWITHTHEDEVELOPME
3、NTOFCATTLEBREEDINGINDUSTRY,URGENTNEEDTOADDRESSDEVELOPMENTANDUTILIZATIONOFBONEPROBLEMSINTHISPAPER,ENZYMATICEXTRACTIONOFCOLLAGENINBONEFIRSTOFALL,BONEHYDROXYPROLINEANDTHECOLLAGENWHICHHADBEENTESTEDWERE075AND75ATTHESAMETIME,WEHYDROLYSISBOVINELIQUIDBYPEPSININTHESTANDARDOFEXTRACTIONRATEOFCOLLAGEN,WECANCHEC
4、KOUTTHEBESTOPTIMUMCONDITIONSBYSINGLEFACTOREXPERIMENTSANDORTHOGONALTESTTHERESULTSSHOWEDAFTERPRETREATMENTBYCATTLEBONEFLUIDINCONDITIONSOFTEMPERATURE37,PH20,ENZYMEAMOUNT10860U/G,HYDROLYSIS5H,THEEXTRACTIONRATEOFCOLLAGENWAS6410KEYWORDSBOVINEBONEENZYMECOLLAGEN21引言我国每年在畜禽屠宰中产生大量骨骼,如猪骨、牛骨。其中牛骨开发利用率较低,主要制成骨粉,
5、用做饲料添加剂。成年牛骨的含量比较恒定,按照不同的牛的种类一般占总体重的520不等。牛骨骼主要由蛋白质和钙质组成网状结构,形成管状,管内充满骨髓,富含人体所需的营养物质。新鲜骨骼中蛋白质含量占11L5,脂肪含量占1015,水份含量占5056,同时还含有粘多糖、钙、磷、维生素等多种营养素。蛋白质中以胶原蛋白为主,约占总蛋白质量的7080。胶原蛋白中含有人体所需的多种氨基酸,因此用高新技术开发和利用骨骼中的蛋白质,提取水解动物蛋白是目前国内外十分关注的项目。胶原蛋白是一大类生物物质,其生物合成过程已经基本清楚。胶原蛋白是很多脊椎动物和无脊椎动物体内含量最丰富的蛋白质,约占体内蛋白质重量的2530,
6、相当于体重的6。自然界从低等无脊椎动物到高等的哺乳动物,总共大约有5OO亿T以上的胶原蛋1。目前的研究表明利用畜骨蛋白质酶水解得到的水解产物胶原多肽具有很多活性功能,例如抗高血压、预防与治疗骨关节炎和骨质疏松、治疗胃溃疡等疾病、抗衰老和抗氧化等2。二十世纪七十年代标志着食用蛋白质的酶解研究作为一门相对独立的研究领域的建立,酶法水解胶原蛋白已经成为其中研究的一个分支3。国内外越来越多的研究者对此方面进行了逐步深入研究和探索。国外酶解蛋白的报道很多,例如,ADLERNISSEN19824对蛋白质酶解工艺和水解物的应用进行了研究。还有人做了酶解鱼蛋白等方面的研究,它们都可以为酶解胶原蛋白提供方法和参
7、考。具体到酶解胶原蛋白方面的研究也有很多如CHAMBERS和RASMUSSEN19885对骨骼中提取的的胶原蛋白进行了酶解研究；SUROWKA和FIC19926采用中性蛋白酶进行了酶解鸡头骨胶原蛋白的研究,确定了最佳酶解条件,并测定了酶解物氨基酸成分含量；BENJAKUL19977研究了牙鳕皮胶原的酶解利用,分别用中性和碱性蛋白酶水解,选择了最优酶和最佳水解条件；日本协和发酵公司利用含有菠萝蛋白酶的菠萝汁经过发酵得到的胶原多肽不仅风味得到提高,而且其生理功能也增强了,得到的多肽分子量主要集中于40005000左右8；MMTAYLAR20059等对制革过程中产生的含铬的胶原蛋白废弃物经过除铬后用
8、多种酶处理水解得到胶原多肽,大大提高了制革厂的利润。近几年国内也开始了关于酶解胶原工艺的研究。例如,赵胜年199810研究了以新鲜猪皮为原料,用国产胰酶进行酶水解反应,提取水解胶原蛋白的工艺技术。李岩等200311研究了在没有外加碱的PH渐变条件下,用枯草杆菌碱性蛋白酶和黑曲霉酸性蛋白酶双酶协同水解从猪皮胶原蛋白制备寡肽水解物的可行性。考察了单酶单因素水解条件、双酶加入方式对猪皮降解率和蛋白质水解度的影响,并在此基础上通过正交试验进一步优化出双酶一次性投料方案水解猪皮的最佳条件。胡胜等200312以工业化的蛋白酶为原料,采用一步酶解法、不抑活两步法酶解、抑活两步法酶解3种不同的工艺,对生物酶提
9、取猪皮胶原进行了研究。班玉凤等200413研究了ALCALASE酶水解猪皮制备胶原蛋白寡肽时影响水解效果的各种因素。确定了ALCALASE水解猪皮的最佳水解条件,并在最佳水解条件下,猪皮的降解率可达到973,水解度可达到131。张根牛等200514以提取的火鸡骨胶原蛋白液为原料,探讨了影响火鸡骨胶原蛋白水解度的主要影响因素,优化了酶解工艺条件。曾名勇等200515研究草酶和复合酶水解红非鲫鱼皮胶原蛋白制备具有抑制血管紧张素转换酶ACE生物活性的寡聚肽的工艺条件。由于胶原蛋白具有保护,支持人体组织及骨骼张力强度及粘稠性等特征,所以作为医疗材料的用途极为广泛。目前,国内正尝试将原胶蛋白覆盖在烧,烫
10、伤病患者的伤口上,促进其表皮细胞的移入与生长能力,由此可大大缩短伤者伤口的愈合的时间。由于胶原蛋白的静电纺纳米纤维可以再现自然骨形态,因此3被认为是很有发展前景的组织工程运用的原料16。除此之外胶原蛋白还能有效改善关节病及骨质酥松症,具有抑制血压上升,通过胃粘膜抗溃疡作用,起免疫功能调节等作用17。在另一方面有由于胶原蛋白又具有亲和性,营养性和保湿性,所以在化妆品方面又可以有大的应用18。胶原蛋白还可以用作高效的动物性蛋白营养添加剂。研究也表明,用其替代或部分替代进口鱼粉用于混,配合饲料生产,其饲料效果和经济效益均超过进口鱼粉19。胶原蛋白产品在其他诸如食材,黏结剂,食品包装等等方面也有大的应
11、用,应用前途十分广泛20。胶原蛋白产品的前景十分广阔,应用合理的新技术就能达到最大的提取成果,将使胶原蛋白的产品的品质和产量大大提高。从这些研究结果看出,酶解牛骨提取胶原蛋白的得率等相差较大,影响提取得率高低因素主要有原料种类、提取工艺技术包括温度、时间、酶及其用量、PH等。研究者大多都从这几个方面来研究蛋白的酶解工艺。本实验以牛骨为原料,采用单因素法和正交试验法。以牛骨胶原蛋白提取率为指标选择胃蛋白酶,从加酶量、PH、反应温度以及反应时间几个因素上找到最佳组合,得到牛骨中蛋白质酶解最适条件,为提高牛骨的胶原蛋白的提取率提供相关的工艺数据。2材料与方法21材料与试剂牛骨宁波莱盛农业科技实业有限
12、公司提供胃蛋白酶上海源聚生物科技有限公司生化试剂13000无水NA2CO3浙江省兰溪市凯旋路83号AR氯胺T国药集团化学试剂有限公司ARNAOH浙江中星化工试剂有限公司AR乙酸国药化学集团试剂有限公司ARL_酪氨酸中国医药上海化学试剂有限公司AR前脯氨酸SIGMA公司AR4（二甲氨基）苯甲醛国药集团化学试剂有限公司AR异丙醇国药集团化学试剂有限公司AR正丙醇国药集团化学试剂有限公司AR三氯乙酸国药集团化学试剂有限公司AR浓硫酸浙江省兰溪六洞山化学试剂厂AR浓盐酸浙江省兰溪六洞山化学试剂厂AR乳酸宜州市化学试剂工厂AR乳酸钠中国医药上海化学试剂公司AR22仪器及设备可见分光光度计T6新悦型,北京
13、普析通用仪器有限责任公司；数显PH计PHS25型,上海机密科学有限公司；TCE纯水机TCEPO015型,杭州天创净水设备有限公司；4电热恒温水浴锅DKS22型,上海精宏实验设备有限公司；低速大容量离心机TDL5型,江苏金坛市医疗仪器厂；新型电热恒温鼓风干燥箱；DHG914AD型,宁波市江南仪器厂；自动电热压力蒸汽灭菌器LDZX40BI型,上海申安医疗器械厂；电子天平BP211D型,德国SARTORIUS公司；23实验方法231测定方法2311牛骨中羟脯氨酸含量的测定A羟脯氨酸标准曲线的绘制21按国家标准GB/T9695232008肉与肉制品羟脯氨酸含量的测定A标准储备液称取50MG羟脯氨酸于1
14、00ML容量瓶中,用水溶解,加一滴3MOL/L的硫酸,用水定容。保存该溶液与4的冰箱里。B标准工作液移取500ML上述标准储备液至500ML容量瓶中,用水定容。分别吸取该溶液1000ML,2000ML,3000ML,4000ML于100ML容量瓶中,用水定容,所得标准工作液浓度为05G,10G,15G,20G。C羟脯氨酸标准曲线的测定取上述标准工作液各1ML,各加入04MOL/L的碳酸钠5ML,再加入已稀释的福林试剂1ML。摇匀至于水浴锅中,外加一组空白组加蒸馏水实验。40保温发色20MIN后在分光光度计下测定OD,平行测定三次,取平均值。将实验组数据减去空白对照组的数据,即为净OD数。B牛骨
15、中羟脯氨酸含量的测定21按国家标准GB/T9695232008肉与肉制品羟脯氨酸含量测定A进行三组平行试验,分别取G牛骨,加入9的碳酸钠溶液100ML,进行5小时的脱脂,脱脂后然后每组分别加入30ML的硫酸溶液（3MOL/L,然后放置于105的烘箱内进行强酸水解16H。B水解完毕后,趁热过滤,用10ML硫酸（3MOL/L进行润洗三次,过滤至250ML容量瓶里纯水定容,然后用移液管在每组中的容量瓶中提取8ML于另外空置的250ML容量瓶中用纯水定容。静置20MIN。C每组中提取出4ML溶液与显色管中,加入事先配置好的氯胺T溶液2ML,静置20MIN,然后加入显色剂2ML,置于60水温中进行水浴发
16、色20MIN,时间到后在流动的水中冷却3MIN后,然后在水中冷却30MIN。D进行一组空白实验实验,溶液用纯水代替。E测定三组实验组的净OD值,然后代入公式625C/MV式中试样中羟脯氨酸的含量,由标准曲线得到的试样溶液中羟脯氨酸的浓度,单位为G/为试样质量,单位为第一次从250容量瓶中移取的体积,单位为52312胶原蛋白提取率的计算根据公式提取率（）溶液中羟脯氨酸的浓度体积稀释倍数/牛骨中羟脯氨酸的含量1002313酶活的测定A酶活力的测定22按行业标准SB/T103171999蛋白酶活力测定法测定B配置各种不同浓度的酪氨酸溶液分别0G,20G,40G,60G,80,100G。C取6支事先编
17、号,去1中不同浓度中的酪氨酸各1ML,加入04MOL/L的碳酸钠5ML,再各加入已稀释的福林试剂1ML。摇匀置于水浴锅中。40保温发色20MIN然后用分光光度计在660NM下进行测定三次,去平均值。将16号管所测得的光明密度减去1号管得出净OD值。D以净OD值绘制标准曲线。E制备5000倍的胃蛋白酶稀释液。F样品测定取试管三支,编号1,2,3,每管内加入样品稀释液1ML,置于40水域中预热2MIN,再各加入同样预热的酪蛋白1ML,精确保温10MIN,时间到后,立即加入04MOL三氯乙酸2ML,以终止反终止反应,继续置于水浴中保温20MIN,使残余蛋白质沉淀后离心或过滤,然后另取试管三支,编号1
18、,2,3,每管内加入滤液1ML,再加入04MOL碳酸钠5ML,已稀释的福林试剂1ML,摇匀,40保温发色20MIN后进行光密度测定。G空白试验也去试管3支,编号（1）,（2）,（3）,测定方法同上,唯在加酪蛋白之前先加04MOL三氯乙酸2ML,使酶失活,再加入酪蛋白。H计算样品平均光密度（OD）空白的平均光密度（OD净OD值根据公式蛋白酶活力单位样品蛋白酶活力单位4N（A/10）1/（1W）A由样品测得的OD值,查标准曲线的相当的酪氨酸微克数。44毫升反应液去除1ML,测定N酶液稀释的倍数10反应10MINW样品水分百分含量。232实验流程胃蛋白酶酶活力的测定牛骨预处理酶解胶原蛋白提取率的测定
19、对水解温度,时间,酶底比,PH值的测定做单因素,正交实验牛骨宁波莱盛农业科技实业有限公司提供的牛骨预处理将新鲜牛骨打碎成35CM块状、去掉骨髓,清水冲洗干净,冷冻用。取冷冻备用的骨KG放入高压锅中,加水KG,在15KGCM2压力下蒸煮2H后,蒸煮液用双层纱布过滤,滤出骨渣,滤液冷却、除去脂肪,待用。6233牛骨液酶法提取胶原蛋白的单因素实验2331加酶量的确定在PH20、反应温度37、反应时间5H,665G牛骨滤液（约为4G牛骨）的条件下,分别采用7600U/G,8444U/G,9500U/G,10860U/G,12667U/G的酶用量进行单因素平行实验。2332PH值的确定在酶用量为9500
20、U/G、反应温度37、反应时间5H,665G牛骨滤液（约为4G牛骨）的条件下,分别采用PH17、PH20、PH23、PH26、PH29的条件进行单因素平行实验。2333反应温度的确定在酶用量为9500U/G、PH20、反应时间5H,665G牛骨滤液（约为4G牛骨）的条件下,分别采用PH17、PH20、PH23、PH26、PH29的条件进行单因素平行实验。2334反应时间的确定在酶用量为9500U/G、PH20、PH20,665G牛骨滤液（约为4G牛骨）的条件下,分别采用2H,3H,4H,5H,6H,7H的条件进行单因素平行实验。234酶提取的最佳工艺条件正交实验在单因素试验的基础上,以胶原蛋白
21、的提取率为指标采用正交试验对提取工艺进行优化,其因素与水平见表1。表1正交试验因素水平表TABLE1THEFACTORANDLEVELSOFORTHOGONALTEST水平因素加酶量（U/G）PH温度（）时间（H）18444203442950023375310860264063结果与分析31牛骨中胶原蛋白含量羟脯氨酸标准曲线图1羟脯氨酸标准曲线7FIG1HYDROXYPROLINESTANDARDCURVE以羟脯氨酸浓度为横坐标,OD值为纵坐标在波长为550NM下绘制标准曲线,标准曲线方程为Y02014X0001（R209999）,由图可知OD值和羟脯氨酸的的浓度相关性相当好。牛骨中羟脯氨酸含
22、量075牛骨胶原蛋白含量本实验胶原蛋白和羟脯氨酸的比例系数为10,可得胶原蛋白含量为75,符合正常的含量范围。32酶的活力酪氨酸标准曲线如图2图2酪氨酸标准曲线FIG2TYROSINESTANDARDCURVE酪氨酸浓度为横坐标,OD值为纵坐标在波长为660NM下绘制图表,标准曲线方程为0560X0036,R209983根据酪氨酸标准曲线的测定可以代入样品测得的净OD值可得到对应的酪氨酸质量；代入公式样品蛋白酶活力单位4N（A/10）1/（1W）,可测得胃蛋白酶的活力为3800U/MG。33单因素实验结果331加酶量对水解度的影响在PH20、反应温度37、反应时间5H,665G牛骨滤液（约为4
23、G牛骨）的条件下,研究不同加酶量对牛骨胶原蛋白量提取率的影响,结果见图3。8图3加酶量对水解度的影响FIG3THEINFLUENCEOFENZYMEAMOUNTONDH由图3可知,在胃蛋白酶水解牛骨蛋白时,酶的用量对其水解程度有显著的影响。当酶用量小于9500U/G时,随着酶量的增加,水解出来的胶原蛋白不断升高。当酶用量大于9500U/G后,胶原蛋白的水解出来的产量开始减少。由图可得出当酶用量在9500U/G时,就可达到较好的水解效果。332PH值对提取率的影响在加酶量9500U/G、反应温度37、反应时间5H,665G牛骨滤液（约为4G牛骨）的条件下,研究不同PH对牛骨胶原蛋白提取率的影响,
24、结果见图4。图4PH值对提取率的影响FIG4THEINFLUENCEOFPHVALUEONDH由图4可见,PH值对胶原蛋白的提取率有显著的影响。当PH从17上升到23时,胶原蛋白提取率呈上升趋势,但随PH在23到29范围时,胶原蛋白的产量又迅速下降。表明胃蛋白酶在PH23的酸性条件下对牛骨蛋白的水解达到了一个较好的效果,在中性或偏碱的环境下,胃蛋白酶的活性会受到不同程度的抑制,此外,不适宜的PH环境还会影响酶与其底物的结合,也会影响水解效果。333反应温度对提取率的影响在加酶量9500U/G、PH20、反应时间5H,665G牛骨滤液（约为4G牛骨）的条件下,研究不同反应温度对牛骨胶原蛋白提取率
25、的影响,结果见图5。图5温度对提取率的影响9FIG5THEINFLUENCEOFTEMPERATUREONDH由图5可见,反应温度对牛骨蛋白水解度有重要影响。温度会影响酶的活性、反应速率,进而影响水解度。当反应温度从31上升到3时,水解度快速上升,但随着温度继续升高,从37上升到43时,水解度又迅速降低,因此,确定较适合的温度37。334反应时间对提取率的影响在加酶量9500U/G、PH20、反应温度37,665G牛骨滤液（约为4G牛骨条件下）,研究不同反应时间对牛骨胶原蛋白提取率的影响,结果见图4。图6时间对提取率的影响FIG6THEINFLUENCEOFTIMEONDH一般地,随着作用时间
26、的增加,水解度不断增加；但当达到一定时间后,随底物浓度的下降、水解产物的积累,水解度增加的程度会趋于平缓,竟而抑制酶的反应或者反应掉胶原蛋白。为提高经济效益,此时为酶解最少的作用时间。由图6表明,当酶作用时间在5H以下时,随时间的延长,水解度增高；当5H以后,水解度基本保持平缓趋势直到不变为止。因此,在用胃蛋白酶水解牛骨蛋白时,可选用5H为酶解的作用时间。335胃蛋白酶酶解工艺条件的优化在单因素试验的基础上采用正交试验对胃蛋白酶酶解工艺进行优化,其因素与水平见表1,按L9（34）正交表进行正交试验。其正交试验的结果见表2。表2酶水解正交实验结果TABLE2THEORTHOGONALTESTRE
27、SULTOFENZYMEHYDROLYZING因素ABCD胶原蛋白的水解率DH（）试验号温度（）PH时间（H）加酶量（U/G）13420410860551023423595005820334266844453204372058444635053723610860607010637264950051407402069500472084023484444650940265108604820K155500552675100054667K258533551335663352267K347300509335370054400R11233433456332400QA2B1C2D1经分析,牛骨蛋白的酶促水解
28、影响因素中,温度值的影响最大,其次为时间的影响,PH为第3位,而加酶量的影响最小。由此得出的最佳胃蛋白酶水解条件为加酶量10860（U/G）,PH20,温度37,时间5H。在此实验条件下进行验证试验,最后得到牛骨胶原蛋白的提取率为6410。同样条件下,取100ML酶解液先在4000R/MIN的环境下离心20MIN,然后取上清液,再在其中加入足量的NACL使溶液饱和,然后放入条件下盐析10H,盐析完成后把溶液装在透析袋中放入纯水中进行透析,透析过程中一直用AGNO3溶液滴定,并且不断的更换纯水,直到滴定不再出现沉淀为止,取出透析液再经冷冻干燥后实际测得胶原蛋白提取率为4813。4结论1实验结果表
29、明,牛骨中羟脯氨酸的含量为075,胶原蛋白的含量为75。2在单因素试验的基础上,进行正交试验得到牛骨胶原蛋白的最佳酶解工艺条件为加酶量10860U/G,PH20,温度37,时间5H。3对优化的酶解条件进行验证试验,最后得到牛骨胶原蛋白的提取率为6410。4对牛骨酶解液进行盐析、透析,再经冷冻干燥后实际测得胶原蛋白提取率为4813。参考文献1蒋挺大,张春萍胶原蛋白M北京化学工业出版社,20011192关云山酶法水解明胶的试剂J青海大学报自然科学版,2001,19132343唐传核,彭志英胶原的开发及利用M南京南京出版社,2000341434RANDYMORIN,DAVIDKAPLAN,ANDBE
30、RNARDOPEREZRAMIREZBONEMORPHOGENETICPROTEIN2BINDSASMULTILAYERSTOACOLLAGENDELIVERYMATRIXANEQUILIBRIUMTHERMODYNAMICANALYSISJBIOMACROMOLECULES,2006,71311385班玉凤,朱海峰,ALICALSE水解猪皮胶原蛋白的研究J现代食品科技,2004,21259616张义军,康白,任维栋等胶原蛋白酶的降压作用及生物学特征J2001,2342752777李志强生皮蛋白质化学基础M成都成都科技大学出版社,1988,74818赵苍碧,黄玉东,李艳辉从牛骨中提取胶原蛋白的
31、研究J哈尔滨工业大学报,2004,3645155199安广杰,王璋,许时婴利用ALCALASE蛋白酶生产牛骨水解明胶J食品发酵工业,2004352551110赵胜年酶解鲜猪皮提取水解胶原蛋白的研究J食品工业科技,2007,367434911李岩,朱海峰PH值渐变条件下双酶协同水解猪皮制备胶原蛋白寡肽的研究J食品科学,2003,3256812胡胜,李志强猪皮胶原蛋白的研究J现代食品科技,2004,212596113班玉凤,朱海峰水解猪皮胶原蛋白的研究J中国皮革,2003,24856356514张根生,岳晓霞火鸡骨骼胶原多肽口服液的研究J食品科学,2005,268323315曾名勇,李八方红非鲫鱼
32、皮胶原蛋白酶解条件的研究J中国海洋药物杂志,2005,245242916SERGIOTORRESGINER,JOSEVGIMENOALCANIZ,MARIAJOCIOETALCOMPARATIVEPERFORMANCEOFELECTROSPUNCOLLAGENNANOFIBERSCROSSLINKEDBYMEANSOFDIFFERENTMETHODSJAPPLIEDMATERIALSANDINTERFACES,2009,VOL1121822317马福广,李芳,彭燕豪医用胶原和胶原膜研制及临床应用J中华创伤杂志,1995,11314915018杨玉牛骨胶原蛋白的的应用前景M宁夏生物科技出版社,2002,505219黄左余,李晓光,张建峰等胶原蛋白食品代替鱼饲料研究J中原工学院报,2007,182920刘言宁,朱紫胶原蛋白的研究前景M湖南教育科技出版社,2003,181921中华人民共和国国家标准GB/T9695232008肉与肉制品羟脯氨酸含量测定22中华人民共和国专业标准SB/T103171999蛋白酶活力测定法
