1、本科毕业设计（20_届）纽虫铁蛋白的原核表达和抗重金属研究所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言12材料与方法221材料222试剂223仪器224FERRITIN基因ORF序列的PCR扩增2241引物设计2242PCR扩增4243对ORF的PCR产物回收纯化4244感受态细胞的制备425PCR产物和质粒载体的双酶切5251酶切产物的回收纯化5252目的片段与质粒载体的连接5253连接产物转化DH5感受态细胞5254质粒的提取6255重组质粒转化ECOLIBL21（DE3）感受态细胞626原核表达6261重组蛋白的诱导表达6262诱导表达产物的SDSPAGE电泳7
2、27重组铁结合蛋白抗重金属活性检测8271实验前期准备8272菌的活化和诱导8273涂板计数83结果931FERRITIN基因ORF序列的PCR扩增932SDSPAGE933重组铁结合蛋白抗重金属活性检测104讨论115小结12致谢错误未定义书签。参考文献13摘要根据已克隆得到的纽虫铁蛋白CDNA序列，设计原核表达引物，PCR扩增ORF片段。将PCR产物和表达载体（PET28A）进行双酶切，连接并转化到ESCHERICHCOLIBL21DE3中。IPTG诱导重组蛋白的表达，并通过电泳检测表达的状况。用含有不同浓度重金属FE2、CR2的LB培养基培养含重组蛋白的菌株，根据细菌的生长状况，分析重组
3、表达的铁蛋白对重金属的抗性。结果表明重组铁蛋白的表达提高了菌株对FE2、CR2重金属的抵抗能力。由此我们认为铁蛋白有助于生物适应周围环境中重金属浓度的变化。本研究为进一步深入研究铁蛋白的功能和增加机体免疫力的作用机理奠定基础。关键词纽虫；铁结合蛋白；原核表达；抗重金属ABSTRACTACCORDINGTOCDNASEQUENCEOFFERRITINFROMNEMERTEANSWHICHHASBEENCLONEDPREVIOUSLY,THEEXPRESSIONPRIMERSWEREDESIGNEDANDTHEORFFRAGMENTWASAMPLIFIEDTHEPCRPRODUCTSANDEXPR
4、ESSIONVECTORPET28AWEREDIGESTEDBYRESTRICTIONENZYMES,THENWERELIGATEDANDTRANSFORMEDINTOESCHERICHCOLIBL21DE3AFTERIPTGINDUCTION,THERECOMBINANTPROTEINWASSEPARATEDBY15SDSPAGEIPTGINDUCEDBACTERIAWERECULTUREDINLBBROTHCONTAININGTHEDIFFERENTCONCENTRATIONSOFHEAVYMETALSFE2,CR2BASEDONTHEGROWTHOFBACTERIA,THERESISTA
5、NCEOFRECOMBINANTPROTEINWITHHEAVYMETALWASANALYZEDTHERESULTSSHOWEDTHATTHEEXPRESSIONOFRECOMBINANTFERRITININCREASEDRESISTANTCAPABILITYONTHEHEAVYMETALOFFE2,CR2THUS,FERRITINWILLHELPBIOLOGYFORADAPTINGTOTHECONCENTRATIONCHANGESOFHEAVYMETALSINTHEENVIRONMENTTHISSTUDYWILLOFFERTHEFOUNDATIONFORTHEFURTHERSTUDIESON
6、THEBIOLOGICALFUNCTIONSANDTHEMECHANISMOFIMMUNITYOFFERRITINKEYWORDSNEMERTEANSFERRITINPROKARYOTICEXPRESSIONRESISTANCETOHEAVYMETAL11引言本实验室在浙江省东部奉化市湖头渡沿岸的虾塘中采到了一种纽虫。根据形态学、组织学和18SRDNA序列分析研究确定该纽虫属于异纽目，纵沟虫科，枝吻纽虫属，且被定名为浙江枝吻纽虫1。纽虫有血管和肛门，在整个动物世界中，它首先出现了完整的消化系统，封闭式循环系统及有成对的肠盲囊和生殖腺的排列，开始有了分节的趋向，因此，在动物演化过程中纽虫是属于关
7、键性的2。纽虫是一类生活在浅海潮间带的无脊椎动物，在世界各地都有分布。纽虫有特殊构造，在消化道背侧有一长管状吻，吻口在体的最前端，吻能长长地伸出体外，伸缩是由后端的牵引肌所控制。本门中较高等种类，在吻内还具有刺针和毒腺，能防卸敌害或捕杀措物，这就是纽虫所特有的捕食器能够翻转的吻。当其捕食时，在被捕食者没有防备的情况下，吻部可突然伸出，迅速缠住猎获物并将它卷人口中。如果我们在潮间带翻开石块，也许就会看到几条扭缠在一起的纽虫。但是，要想带回实验室，固定并保存纽虫，却仍然是个难题，即使用特殊的麻醉剂使之松弛，也很难获得理想的标本。纽虫身体收缩能力极强，如果人们将捕虾蟹用的网放置在海中，纽虫闻到里面食
8、物的味道就会收缩身体，顺着比身体细得多的网眼挤进去，吃掉食物后再挤出来，然后再恢复成原来的身体形状，对其身体毫无损害。纽虫还有一个非常被人熟知的特征就是它的再生能力3，纽虫很敏感，一受到外界的刺激，它的身体就会自行断成几个部分，但过了一段时间又可再次长成完整的个体，这点与蚯蚓的强再生能力一样。纽虫的生命力很强，即使在寒冷的冬天也能够僵而不死。它有特厚的肌肉层，而且体表能分泌酸性很强的粘液，在它的肠道和体壁之间充满着许多组织细胞，可以贮存食物。因此，它的耐饿力很强。由于纽虫具有这些独特的生理特点，使其成为一类绝佳的生物研究模型。但是目前国内外对纽虫的研究较少，尽管有关纽虫外部形态4、吻的结构、消
9、化系统、循环系统和神经系统5、纽虫含有的18种氨基酸6、毒素的性质、胚胎发育以及再生现象等已有部分报道，但是大多数的研究主要在形态解剖学或生理生化上，很少在分子水平上对它的这些生理现象进行深入地分析。例如孙世春等对纽虫的研究主要包括对其分类地位的研究7，SUNDBERG等利用18SRDNA序列和线粒体基因组序列使纽虫的分类和进化地位分析更加准确。生理生化研究方面，ZHAO等分析了外界环境对纽虫各种生命活动的影响，如纽虫对环境中的盐度、温度和PH值的耐受性；BIN等研究了体重、切断手术对纽虫氨和尿素排泄的影响等。而对于纽虫对抗外界刺激起很大作用的铁结合蛋白的研究仍然是个空白。铁结合蛋白是1937
10、年LAUFBERGE8首先分离出来的一种分子量较大的含铁蛋白质,它主要分布于肝、脾、骨髓组织中，可以储藏结合4500个可溶、非毒性、可利用的铁原子。铁蛋白由球形蛋白质外壳和铁核心两部分构成。铁蛋白的蛋白外壳外径1213NM，内径78NM，分子量大约500KDA是一个中空的结构，其中储藏的4500个铁原子不影响蛋白表面和与其它分子的相互作用。脱铁铁蛋白无铁的铁蛋白壳的外表凹凸不平，内面形成嵴状突起，伸延迂迴，形成四组形态十分相似的囊状结构。每个脱铁铁蛋白由24条多肽链组成，多肽链有重亚基H亚基和轻亚基L亚基二种9。不同组织铁蛋白壳中H亚基和L亚基的比例有很大差别。在贮藏铁的器官中含L亚基的铁蛋白
11、较多，而在含铁量少的器官中则是含H亚基的铁蛋白占优势。在蛋白亚基中含由亚铁氧化的接触反应位点和与溶剂进行交换的亲水小孔，因此，铁蛋白的外壳具有亲水性。正是由于这一特性，故铁蛋白可溶于水并可溶于胞浆或血浆中，在细胞内、外液中存在也均较稳定。铁核心中的铁是以三价铁的氢氧化铁磷酸化合物的形式存在,其核心中的铁原子含量不等，一般是25003000个，上诉中的4500个是其最多可达到的数量。脱铁铁蛋白的囊状结构内含有许多空隙，由外向2内通向铁核心，这就是铁原子和其它小分子物质进出的通道。铁蛋白的分子量因含铁量不同而异，大约为460000,体内铁蛋白含铁总量占机体含铁总量的153010。由于铁结合蛋白可以
12、储藏结合4500个可溶、非毒性、可利用的铁原子，因此在生物体内铁的代谢方面起着关键作用11。铁蛋白在释放和储存上对铁代谢起着非常重要的作用12。首先，当体内铁含量过高时，能够将生物体内多余的铁离子储存起来，避免铁离子给机体造成伤害。其次，在出血或其他需要铁的情况下，铁结合蛋白可以提供铁离子给所需要的细胞，参与造血或其他含铁化合物的合成13。研究证实FERRITIN不仅仅是一种铁调节蛋白，在体内免疫中也起着一定的作用。当生物体受到外界环境的胁迫时，FERRITIN的表达量会有一定程度上的增加，表明此时FERRITIN可减少这些胁迫所造成的伤害，一定程度上帮助机体抵抗了外界的伤害。另外，铁结合蛋白
13、还能够减少生物体内活性氧分子的产生，从而使其免受氧化损伤。本课题的研究内容为纽虫铁结合蛋白的原核表达和重组铁蛋白的抗重金属能力，有助于深入研究铁蛋白的功能和其对于增加机体免疫力的作用机理奠定基础，并为进一步开发利用铁蛋白奠定基础。2材料与方法21材料纽虫于2009年5月采自浙江省东部奉化市湖头渡沿岸的虾塘中，带回实验室保存。22试剂TAQDNAPOLYMERASE，TAKARA；表达宿主菌ECOLIBL21（DE3）由本实验室保存；表达质粒PET28A由本实验室保存；重金属（FE2、CR2）由本实验室保存；其它常规试剂购于上海生工。23仪器主要仪器有电泳槽、BIOSPIN的凝胶回收试剂盒、TI
14、ANPREPMINIPLASMIDKIT的质粒小提试剂盒、摇床和紫外分光光度计，其它为实验室常规仪器。24FERRITIN基因ORF序列的PCR扩增241引物设计根据已得到的纽虫FERRITIN基因的CDNA序列（图1），通过PRIMERPREMIER50软件设计上下游特异性引物（表1）。3图1浙江枝吻纽虫铁结合蛋白基因的CDNA序列FIG1SCHEMATICDIAGRAMOFTHECDNAENCODINGFERRITINOFDENDRORHYNCHUSZHEJIANGENSIS注空心方框内的ATG代表起始密码；星号处的TAA代表终止密码；实心方框处的氨基酸残基组成亚铁氧化酶活性中心（FERR
15、OXIDASEDIIRONCENTER）；倒三角处的氨基酸残基组成水铁核心区（FERRIHYDRITENUCLEATIONCENTER）；菱形处的氨基酸残基组成铁离子通道（IRONIONCHANNEL）。表1FERRITIN克隆引物TABLE1THEPRIMERSOFFERRITIN引物名称引物序列FBD5（5端）5CGGGATCCATGTCACTCTGTCGT3FBD3（3端）5CCCAAGCTTTTAAGAAGAGTTCCTT3保护碱基BAMHI酶切位点保护碱基SAL酶切位点4242PCR扩增PCR反应体系如下文库质粒10L10PCRBUFFER25LMGCL2（25MM）20LDNTP（
16、10MM）10L正向引物FBD5（10M）10L反向引物FBD3（10M）10LTAQDNAPOLYMERASE（5U/L）025L超纯水1625L总体积250LPCR反应条件94C变性5MIN94C变性30S58C退火30S72C延伸70S72C延伸10MIN243对ORF的PCR产物回收纯化产物的纯化通过BIOSPIN的凝胶回收试剂盒进行，具体操作步骤如下1、将琼脂糖凝胶中含有目的DNA片段的部分切下，将其放入15ML离心管中；2、按融胶液体积微升数凝胶质量毫克数为31的比例加入提取缓冲液，放置于50恒温水浴中，直到凝胶融化；3、将全部混合物都转移到收集管内，在8000RPM下离心1MIN
17、，然后去掉接液管内液体；4、向管内加入500L提取缓冲液，在11300RPM下离心1MIN，然后去掉接液管内液体；5、向管内加入750L洗涤缓冲液，在11300RPM下离心1MIN，然后再去掉接液管内液体；6、再次在12000RPM下离心1MIN，然后将收集管中的物体转移到无菌的15ML离心管中；7、向收集管内加50L提取缓冲液、水或溶解液，并于室温静置1MIN；8、在11300RPM下离心1MIN，此时，微量离心管中的内溶液就含有纯化的目的DNA片段，将其保存于20。244感受态细胞的制备1、取ECOLIBL21和ECOLIDH5菌株在LB固体培养基中划线，于37恒温培养过夜；2、将长出的菌
18、挑取单菌落到5MLLB液体培养基中于37200RPM恒温培养过夜；3、按1100取2ML培养菌液转入200MLLB液体培养基中，于3750RPM恒温培养至OD6000203；35个循环54、于4000RPM离心10MIN，去上清，加入20ML01M硫酸镁（4预冷），悬浮沉淀，冰浴15MIN；5、于4000RPM离心10MIN，去上清，加入10ML01M氯化钙（4预冷）及15甘油悬浮沉淀；6、以每管100L分装，80保存备用；25PCR产物和质粒载体的双酶切在15MLEP管中加入下列成分后将其充分混匀，置于37反应1H，分别将PCR产物和PET28A（图2）进行双酶切。双酶切PCR产物PCR产物
19、30L10TBUFFER6LBAMHI2LSAL2L双酶切PET28APET28A质粒30L10TBUFFER6LBAMHI2LSAL2L251酶切产物的回收纯化双酶切产物通过2琼脂糖凝胶电泳后，用BIOSPIN的凝胶回收试剂盒进行切胶和纯化，操作步骤同243。252目的片段与质粒载体的连接酶切后的目的片段7L酶切后的PET28A质粒载体1L10LIGATIONBUFFER1LT4DNALIGASE1L16连接过夜。253连接产物转化DH5感受态细胞1、融化的100L感受态细胞DH5中加5L连接产物，混匀，冰上放置30MIN；2、将感受态细胞和连接产物的混合物放置于42C的水浴中热激90S，这
20、个时间要非常准确，然后将其迅速移至冰上35MIN；3、向混合物中加入LB液体培养基，数量为1ML，在37C，180RPM条件下摇振1H；64、在4C，5000RPM条件下离心5MIN，然后吸去900L的上清液；5、混匀剩余的菌液，然后取50L菌液涂布于含30G/MLKAN的平板上，待平板上的菌液被完全吸收后，把平板倒置放在37C温箱中培养过夜；6、1016H之后，检查平板并用PCR法确认阳性克隆子，并测序确认序列的正确。254质粒的提取于含30G/MLKANLB琼脂板上挑取37过夜培养的阳性单菌落，接种于5ML含30G/MLKANLB液体培养基中，37振荡培养812H。按照TIANPREPMI
21、NIPLASMIDKIT质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒PETFER，操作如下1、柱平衡步骤加入500L的平衡液BL到吸附柱CB3中，12,000RPM离心1MIN，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（使用当天处理过的柱子）；2、向离心管中加入5ML过夜培养的菌液，使用常规台式离心机，12,000RPM离心10MIN，尽量吸除上清；3、加入250L溶液P1（含RNASEA）到留有菌体沉淀的离心管中，使用移液器彻底悬浮细菌沉淀；4、加入250L溶液P2到离心管中，为使菌体充分裂解须温和地上下翻转68次；5、加入350L溶液P3到离心管中，立即温和地上下翻转68次，充分混匀，这时将会出现
22、白色絮状沉淀。在12,000RPM下离心10MIN，此时在离心管底部会有沉淀形成；6、用移液器将前一步收集的上清液转移到吸附柱CB3中，这步骤中尽量不要吸出沉淀。在12,000RPM下离心1MIN，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中；7、加入700L漂洗液PW于吸附柱CB3中，在12,000RPM下离心1MIN，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放回收集管中；8、向入500L漂洗液PW于吸附柱CB3中，在12,000RPM下离心1MIN，倒掉收集管中的废液；9、将吸附柱CB3放回收集管中，在12,000RPM下离心2MIN，目的是将吸附柱中残留的漂洗液去除；10、将吸附柱CB3放于
23、一个干净的离心管中，滴加30L洗脱液EB于吸附膜的中间部位，室温放置2MIN，12,000RPM离心2MIN将质粒溶液收集到离心管中。255重组质粒转化ECOLIBL21（DE3）感受态细胞分别加05L重组质粒PETFER和05LPET28A质粒于100L感受态细胞ECOLIBL21中进行转化，方法同253。26原核表达261重组蛋白的诱导表达挑取重组后的PETFER阳性单菌落，接种于2MLKANLB液体培养基中，于37振摇恒温培养过夜。取1ML该菌液接种于50MLKANLB液体培养基中，37180R/MIN振荡培养至OD6000406，7加IPTG（500MMOL/L）至终浓度1MMOL/L
24、，37180R/MIN振荡培养，每隔1H取出1ML菌液于15MLEP管中，共诱导6H。410,000R/MIN，5MIN收集菌体。将插入PET28A空载体的ECOLIBL21作为对照组。262诱导表达产物的SDSPAGE电泳1、分离胶的制备12分离胶（总量75ML）H2O245ML30ACRYLAMIDE3ML15MTRISHCL（PH88）19ML10SDS75L10APS75LTEMED3L先将垂直板SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳装置按照使用说明书安装好，混匀上述溶液，将分离胶灌入两层玻璃板间，这个过程要迅速，其上留出2CM用来灌浓缩胶的空隙。最后加入水在胶面上，并覆盖其界面，在分离胶聚合完全之
25、后，将分离胶上面的液体去掉，且凝胶顶端的残存液体也尽量用吸水纸吸干。2、浓缩胶的制备5浓缩胶（总量3ML）H2O21ML30ACRYLAMIDE05ML10MTRISHCL（PH68）038ML10SDS30L10APS30LTEMED3L在分离胶上面灌入浓缩胶，插入梳子，于室温下放置30MIN，待浓缩胶聚合完全后，在上、下槽之间分别加入电泳缓冲液，并使上槽缓冲液浸没胶面，拔出梳子。3、原核表达样品制备PBS重悬不同时间诱导表达菌体（0H，1H，2H，3H，4H，5H，6H）及其对照菌体后再离心收集菌体，分别加入40LPBS和10L5SDS加样缓冲液，充分振荡1MIN后，放置于100沸水浴5M
26、IN，结束后立即冰浴，然后再45,000R/MIN，1MIN离心，最后各取10L用于聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。4、电泳电泳条件为恒压方式70V，接通电源开始电泳，当样品进入分离胶区域后，把电压升高至120V。电泳结束的标准为溴酚蓝抵达分离胶底部。85、固定、染色和脱色在电泳结束后把凝胶取下来，然后将凝胶浸泡考马斯亮蓝R250染色液，将其水平摇床上并与室温条件下缓慢摇动1H以上。将用好的染色液回收。之后用脱色液浸泡凝胶，缓慢摇动48H，在期间须数次更换脱色液直至凝胶背景清晰为止。27重组铁结合蛋白抗重金属活性检测271实验前期准备在实验开始前须进行一系列前期准备，具体内容包扩如下1洗净多个10ML
27、细胞培养瓶、500ML椎形瓶、多个LB平板和其它必备实验材料等，将其晾干灭菌后置于烘箱内烘干以备使用。2配置浓度为05MOL/L的重金属（FE2、CR2）溶液，分别灭菌保存。3配置抗生素KAN005GKAN粉1ML水,诱导剂IPTG。4配置LB固体培养基（每300ML中，胰蛋白胨酵母浸膏NACL琼脂比例为3G15G3G45G）和LB液体培养基（每300ML中，胰蛋白胨酵母浸膏NACL比例为3G15G3G），灭菌备用。5取已灭菌烘干的20个平板、LB固体培养基、重金属溶液和KAN。倒平板，最终将培养基配置为四组，五个一组，两组分别含有重金属FE2浓度依次为0MMOL/L、05MMOL/L、1MM
28、OL/L、2MMOL/L、5MMOL/L的培养基，另两组则是分别含有重金属CR2浓度依次为0MMOL/L、05MMOL/L、1MMOL/L、2MMOL/L、5MMOL/L的培养基（上诉步骤均须在无菌操作台进行）。密封储藏于4冰箱中备用。272菌的活化和诱导取200L原核表达菌接种于10MLKANLB液体培养基，37恒温振摇培养23H至OD6000406。加入10LIPTG，于37诱导振摇培养45H。同样取200L对照用的菌PET28AECOLIBL21接种于10MLKANLB液体培养基，37振摇培养23H至OD6000406。加入10LIPTG，于37诱导振摇培养45H。273涂板计数诱导结束
29、后，将含有FERRITIN的原核表达菌浓度稀释到106。分别取出已准备好的一组含FE2的平板和一组含CR2的平板，各取20L菌液依次涂于不同浓度的平板上，对照菌株PET28AECOLIBL21的涂板方法同上。待菌液被培养基吸收完全后，将平板放在37C温箱中倒置培养过夜。观察培养过夜后不同平板上菌的生长情况，将生长的菌落进行计数,从而了解铁蛋白对各种重金属的抗性。93结果31FERRITIN基因ORF序列的PCR扩增以纽虫CDNA文库质粒为模板，FBD5和FBD3为引物，PCR扩增得到510BP的FERRITIN基因ORF片段（图2）。图2浙江枝吻纽虫FERRITINORF的PCR扩增产物电泳图
30、FIG2SEPARATIONOFORFOFNEMERTEANSFERRITINPCRAMPLIFIEDFRAGMENT32SDSPAGE经过SDSPAGE电泳分析，未经诱导的菌株与空载体对照菌未出现条带，而重组菌的相对分子质量在201KD与290KD之间则可见明显的条带。当IPTG终浓度为1MMOL/L时，诱导后1H，2H，3H，4H，5H，6H中，随着诱导时间的增加目的蛋白表达量也逐渐增多，之后重组蛋白表达量维持在恒定水平，不随时间的延长而增加。实验表明诱导4H时目的蛋白可以完全表达，见图3。10图3PET28A/DZFERRITIN重组蛋白的表达FIG3EXPRESSIONOFPET28/
31、DZFERRITINRECOMBINANTPROTEININECOLIBL21注1蛋白质分子量标准；2PET28A不诱导；3PET28A诱导4小时；4PET28A/DZFERRITIN不诱导；510PET28A/DZFERRITIN诱导1H6HNOTELANE1,LOWMOLECULAR,LANE2,TOTALPROTEINOFNONINDUCEDPET28A,LANE3,TOTALPROTEINOFPET28AINDUCEDFOR5H,LANE4,TOTALPOTEINOFNONINDUCEDPET28A/DZFERRITIN,LANE5,510TOTALPROTEINOFPET28A/DZ
32、FERRITININDUCEDFOR1H,2H,3H,4H,5H,6H33重组铁结合蛋白抗重金属活性检测将对照菌和原核表达菌分别在含有重金属的LB培养基中培养，且两种重金属（FE2、CR2）均设有5个相同的浓度梯度。通过过夜培养后对菌落计数发现随着重金属（FE2、CR2）浓度的升高，菌落数量依次减少，相比较之下含有FERRITIN的原核表达菌在相同的重金属浓度下比对照菌长的好。由此可见，重组铁结合蛋白具有抗重金属的活性。具体数据见表2，表3。表2两种菌在重金属GR2影响下的生长情况TABLE2THEGROWTHOFBACTERIAUNDERTHEINFLUENCEOFHEAVYMETALGR2
33、GR2（MMOL/L）PET28ABL21菌的个数FERRITIN（菌的个数）029747205348443127439022413375184301表3两种菌在重金属FE2影响下的生长情况TABLE3THEGROWTHOFBACTERIAUNDERTHEINFLUENCEOFHEAVYMETALFE2FE2（MMOL/L）PET28ABL21菌的个数FERRITIN（菌的个数）048553905433456136740822833215201268114讨论在动物进化史中处于重要地位的纽虫动物门中的纽虫，是一种无脊椎动物。它们具有独特的脂肪代谢功能，非常强的分节再生能力及其各种各样极具特色的
34、生命活动现象。到目前为止，国内外对纽虫的研究主要分布在以下几个方面首先是关于形态分类学的研究，原先对纽虫的分类是通过对其外部形态的分析而对其归类的，而现在随着生化和分子生物学的发展，各种分子生物学研究逐渐应用到分类学中，目前18SRDNA序列和线粒体基因组序列也被广泛地应用，由此使纽虫的分类和进化地位分析更加准确14；其次是关于组织解剖学的研究，目前主要集中在纽虫各部分和各系统的研究；再次是关于生理生化上的研究，这方面主要研究外界环境对纽虫各种生命活动的影响，如环境中的温度、PH、盐碱度和污染物如重金属对纽虫的影响，还有环境中的各种刺激源对纽虫造成刺激后，纽虫的再生能力等。正因为纽虫有如此多的
35、特性，因此研究纽虫中的大量功能基因并对其开发，具有重大的意义和价值。铁结合蛋白是细胞用于储存铁离子的最重要的蛋白质。它已被确定广泛存在于从原核生物到真核生物的有机体中15，并且铁结合蛋白在生物体内发挥着许多功能首先，铁蛋白广泛分布于铁储存蛋白质中，其被认为可通过铁对生物分子的有害氧化催化反应起非常重要的保护作用16。其次，铁蛋白能够储藏多余的铁离子，如当过量的“游离铁”入侵时，可口革囊星虫能启动防御机制，避免机体受损17；当机体出现贫血等状况时，铁蛋白也可释放铁离子用以合成相关的蛋白质和酶。目前对于国内外对于铁蛋白的研究相当广泛，丁聃18等通过构建细粒棘球蚴铁蛋白基因的重组表达质粒表达、纯化出
36、重组蛋白，发现细粒棘球蚴重组铁蛋白具有较好的抗原性及免疫原性，具有成为包虫疫苗候选分子的潜能。哈卓19等通过RTPCR法从从泌乳3D后母猪乳腺组织中扩增了猪乳铁蛋白N端1077BP的PLFN基因片段，经过密码子优化并以扩增的PLFN基因片段为参考模板，全基因合成了编码猪乳铁蛋白N端的基因PLFNS，将其连接到表达载体中，得到了重组菌PETPLFNS/BL21，重组菌经IPTG诱导后正确表达。之后用琼脂孔穴扩散抑菌法检测表明重组猪乳铁蛋白具有明显的抑菌作用。董毅20等通过对血清铁蛋白SERUMFERRITIN,SF在贫血性疾病的临床价值的研究，发现SF不仅可作为贫血性疾病的诊断及鉴别诊断指标,其
37、浓度的检测亦有助于判断疗效和指导治疗。此外，经研究发现乳铁蛋白具有抗肿瘤的特性，乳铁蛋白可通过增强宿主防御、抑制增殖、诱导凋亡,阻断细胞周期、抗血管生成，调控致癌物代谢酶以及清除铁等机制发挥抗肿瘤作用。在当前肿瘤多发的社会中，安全无毒性的乳铁蛋白为人类肿瘤的治疗提供了一条新的选择21。本实验对于原核表达这部分内容所采用的载体是PET28A。因为含有FERRITIN的目的基因和表达载体PET28A均含有多克隆位点BAMHI、SALI，因此实验中将目的基因片段插入表达载体PET28A多克隆位点中的BAMHI、SALI之间，使得目的基因处在带有LAC操纵基因的T7启动子控制下，加入诱导剂IPTG后，
38、目的基因开始转录和表达。对于质粒的选择方面，由于PET28A带有抗卡那霉素抗性基因，因此含重组质粒的大肠杆菌可在含有卡那霉素的琼脂培养皿上生长菌落，故选择PET28A为原核表达载体。但是一些未酶切完全的载体和某些自身已经环化的载体也可以转入到大肠杆菌中形成假阳性的菌落，所以要进行PCR作用来进行粗略的检测，并且最后还要进行序列检测来得到准确的阳性克隆菌。本实验中采用的诱导剂是终浓度为10MMOL/L的IPTG，每隔一个小时离心收集菌体，经过6小时候进行SDSPAGE电泳，电泳结果经分析表明在诱导后的16H内均有重组蛋白的表达，并且在这段时间段内，随着诱导时间加长，目的蛋白的表达量增多，诱导到4
39、H时目的蛋白开始可以完全表达，之后时间内其表达量12均维持在一个恒定的水平。本实验对于纽虫铁蛋白抗重金属活性的研究中，在重金属（FE2、CR2）的影响下，含有FERRITIN的原核表达菌株的生长情况明显好于只含空载体PET28A菌株的生长情况，这一结论可通过表2和表3中每个重金属离子浓度下菌落生长个数而得。而观察两张表发现受FE2影响的两种菌其菌落的个数多于受CR2影响菌的菌落个数，这一情况表明重金属CR2对生物的影响多于FE2对生物的影响，与实验前的预期结果一致。上诉情况均可说明FERRITIN有吸收重金属这一特性，而含有FERRITIN的生物能够抵抗周围环境中的重金属污染。符合实验前的预期
40、结果。5小结本研究将扩增得到的FERRITIN目的片段和PET28A载体经BAMHI和SAL双酶切后进行连接，转化到ECOLIBL21感受态细胞并诱导表达。通过SDSPAGE电泳分析表明，未经诱导菌株和空载体对照菌未出现条带，而重组菌在相对分子质量为201KD与290KD之间可见明显的条带。当IPTG终浓度为1MMOL/L时，诱导后1H，2H，3H，4H，5H，6H时目的蛋白表达逐渐增多，之后蛋白表达量居于恒定水平，不随时间的延长而增加，表明诱导4H时目的蛋白可以完全表达。本实验通过进一步研究表明了铁蛋白对重金属的抵抗能力，为进一步开发利用铁蛋白提高生物抵抗重金属的能力奠定基础。13参考文献1
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