1、本科毕业设计（20_届）诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物对乌鳢免疫活性的影响所在学院专业班级水产养殖学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言12材料与方法121材料1211实验菌种1212实验用鱼1213实验用水2214药品和试剂222试验方法2221溶壁微球菌悬液的制备2222肽聚糖注射液的制备2223注射实验2224血清、血细胞样本的采集2225血细胞脆性（EOB）的测定2226血细胞计数（RBS）2227溶菌酶活力的测定2228血液生化指标的测定223数据分析33结果331诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血液生理指标的影响3311诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血细胞数量的影响3312诺卡氏菌细胞壁
2、肽聚糖对乌鳢血细胞脆性的影响3313诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢溶菌酶活力的影响432诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血液生化指标的影响4321血清总蛋白TP4322血清白蛋白ALB5323碱性磷酸酶ALP5324尿素氮BUN6325乳酸脱氢酶LDH6326乳酸脱氢酶同工酶LDH174讨论741免疫多糖对水产动物血细胞数量和血细胞脆性的影响742免疫多糖对水产动物溶菌酶活力的影响843免疫多糖对水产动物血清总蛋白（TP）和血清白蛋白（ALB）的影响844免疫多糖对水产动物碱性磷酸酶（ALP）的影响845免疫多糖对水产动物尿素氮（BUN）的影响946免疫多糖对水产动物乳酸脱氢酶（LDH）和乳酸脱氢酶同工
3、酶（LDH1）的影响9致谢错误未定义书签。参考文献102摘要采用浓度为167MG/ML的鰤鱼诺卡氏菌细胞壁肽聚糖粗提物对乌鳢进行腹腔注射，于实验24H、48H、72H、96H、120H、144H、168H时取其血液测定血细胞数目、血细胞脆性（EOB）、溶菌酶活力（LSZ）、血清总蛋白（TP）含量、血清白蛋白ALB含量、碱性磷酸酶（ALP）活性、尿素氮（BUN）含量、乳酸脱氢酶（LDH）活性以及乳酸脱氢酶同工酶（LDH1）等与乌鳢免疫力相关的血液生理指标和生化指标，结果表明鰤鱼诺卡氏菌细胞壁肽聚糖使乌鳢血细胞数目和血细胞脆性均有增加，但影响不显著（P005）；溶菌酶活力、血清总蛋白和血清白蛋白在
4、48H时显著上升（P005LYSOZYMEACTIVITY,SERUMTOTALPROTEINANDSERUMALBUMINWASINCREASEDSIGNIFICANTLYINTHE48HP005）。图1肽聚糖对乌鳢血细胞数量的影响FIG1EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTHEREDBLOODCELLCOUNTOFOPHICEPHALUSARGUS312诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血细胞脆性的影响乌鳢注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖后血细胞脆性的测定结果见图2。由图2可知，在实验48H后实验组乌鳢血细胞脆性比对照组均略有增大，但差异不显著（P005）。4图2注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌
5、鳢血细胞脆性的影响FIG2EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTHEBLOODCELLFRAGILITYOFOPHICEPHALUSARGUS313诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢溶菌酶活力的影响注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖后，乌鳢血液溶菌酶活力的变化情况见图3。由图3可知，实验48H时实验组溶菌酶活力与对照组相比有显著增强（P005）。图3注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢溶菌酶活力的影响FIG3EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTHELYSOZYMEACTIVITYOFOPHICEPHALUSARGUS表示实验组与对照组存在显著性差异（P005）。图4注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对
6、乌鳢血清总蛋白TP的影响FIG4EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTHESERUMTOTALPROTEINOFOPHICEPHALUSARGUS表示实验组与对照组存在显著性差异（P005）。图5注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血清白蛋白ALB的影响FIG5EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTHESERUMALBUMINOFOPHICEPHALUSARGUS表示实验组与对照组存在显著性差异（P005）323碱性磷酸酶ALP注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢碱性磷酸酶ALP活性的影响见图6。由图6可知，在实验时间内各实验组碱性磷酸酶ALP活性与对照组相比，均呈现上升趋势。在实
7、验24H时，实验组碱性磷酸酶活性最大，6实验24H、48H、96H、144H、168H时实验组与对照组差异显著（P005）。7图8注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢乳酸脱氢酶LDH的影响FIG8EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTHELACTATEDEHYDROGENASEOFOPHICEPHALUSARGUS表示实验组与对照组存在显著性差异（P005）。图9注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢乳酸脱氢酶同工酶LDH1的影响FIG9EFFECTSOFPEPTIDOGLYCANONTHELACTATEDEHYDROGENASEISOENZYMEOFOPHICEPHALUSARGUS表示实验组
8、与对照组存在显著性差异（P005），表明诺卡氏菌细胞壁肽聚糖对乌鳢血细胞脆性的影响不显著。42免疫多糖对水产动物溶菌酶活力的影响溶菌酶是吞噬细胞杀菌的物质基础,是一种碱性蛋白,可通过水解革兰氏阳性细菌细胞壁中的乙酰氨基多糖,破坏和消除侵入体内的异物,从而担负起机体防御的功能16。鱼类的特异性免疫系统并不完善,非特异性免疫在鱼类免疫防御中具有重要作用,因此,溶菌酶是鱼类极为重要的非特异性免疫指标之一。郭玉娟等人的研究结果表明A_3肽聚糖显著提高了受免彭泽鲫血清及体表溶菌活力18；张春晓等人19发现在饲料中添加肽聚糖后，实验组大黄鱼血液白细胞吞噬活力和血清溶菌酶活力显著高于对照组；张璐等人的研究结
9、果也证明了鲈鱼血清溶菌酶活力会随着饲料中肽聚糖添加量的升高而升高20。本实验通过对乌鳢注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖后的溶菌酶活力测定结果显示，实验组的溶菌酶活力在48H明显高于对照组，并存在显著性差异（P005），表明诺卡氏菌细胞壁肽聚糖能显著提高乌鳢血清溶菌酶活性，增强乌鳢的非特异性免疫力，但效果具有明显时效性，这与宋晓玲17等关于双歧杆菌细胞壁肽聚糖对牙鲆免疫活性影响的研究结果及许国焕21，22，23，24等关于酵母多糖、2葡聚糖、黄芪多糖的研究结果十分相似。43免疫多糖对水产动物血清总蛋白（TP）和血清白蛋白（ALB）的影响血清蛋白含量是衡量免疫力的一个重要指标。研究表明，血清总蛋白水平与血
10、清溶菌酶水平密切相关，溶菌酶活性升高时，其血清蛋白含量也随之升高，机体对病原菌的抵抗力显著增强25,26,27。本实验的研究结果表明，乌鳢在注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖后血清总蛋白（TP）的含量迅速增加，并均在第48H达到最大值，存在显著性差异（P005），但具有明显时效性，72H后便降至原来水平。这与赵红霞等人的研究结果相似28，其研究表明在饲料中长期添加1,3葡聚糖使凡纳滨对虾体内血清总蛋白含量显著升高。另外，王红权等人也报道了草鱼在口服05的免疫增强剂壳聚糖40D后其体内血清总蛋白含量得到显著增加（P005）。鱼体血清白蛋白在各种生理活动中有重要作用，对维持鱼体足够血量及胶体渗透压有重要意义
11、，是鱼体重要的免疫蛋白，与鱼体的抗病及环境适应能力有密切的关系，可以用来诊断鱼类健康、营养和疾病等状况，血清白蛋白含量的高低直接体现了鱼类免疫力的高低29。本实验的结果表明，诺卡氏菌细胞壁肽聚糖同样对乌鳢血清白蛋白含量的增加有促进效果，且与血清总蛋白的变化趋势大致相同。肖明松等人对中华鳖的研究所描述的结果大致相同，即果寡糖和糖萜素可以显著提高血清白蛋白的含量（P005）30。44免疫多糖对水产动物碱性磷酸酶（ALP）的影响9碱性磷酸酶为磷酸单酯酶,广泛存在于各种动物体内,其作为一种重要的水解酶，不仅能催化磷酸单酯水解,还直接参与磷酸基团的转移,是动物体内重要的解毒体系,并且在动物机体的骨化过程
12、中及在磷化物和其他一些营养物质的消化、吸收和转运过程中起着重要作用同时碱性磷酸酶作为动物溶酶体酶的重要组成部分,在免疫反应中发挥作用31。碱性磷酸酶活性的提高，可以加速鱼类相应组织的物质代谢，为ADP磷酸化形成ATP提供所需的无机磷，积累更多的能量，从而促进生长，也间接增强了其非特异性免疫能力32。本实验的研究结果表明，诺卡氏菌细胞壁肽聚糖能够显著提高乌鳢碱性磷酸酶活性（P005）。这与宋晓玲等人17在研究双歧杆菌细胞壁肽聚糖对日本对虾免疫活性影响时得出的结论相似经研究表明，肽聚糖可影响日本对虾血清的ALP活性和ACP活性,且两种作用趋势相近，96H内呈逐渐平缓上升的趋势，提高了日本对虾的非特
13、异性免疫水平。另外，陈国福等33和王秀华等34分别给凡纳滨对虾和南美白对虾投喂肽聚糖后碱性磷酸酶活性均得到了提高。45免疫多糖对水产动物尿素氮（BUN）的影响血浆尿素氮可以较准确反映动物体内蛋白质的代谢情况和日粮氨基酸的平衡情况。蛋白质代谢良好时，血浆尿素浓度降低35。有报道认为血清尿素氮水平是衡量动物氨基酸需要的一个很灵敏的参考指标，它是反映机体的营养状况及蛋白质代谢水平的指标，直接反映动物机体内蛋白质分解代谢水平36。因此，血清中尿素氮含量越低，说明机体蛋白质代谢越好。本研究结果显示，乌鳢经注射诺卡氏菌细胞壁肽聚糖，其体内尿素氮含量得到显著性降低（P005），说明乌鳢的代谢旺盛，暗示了其非
14、特异性免疫水平的提高。类似结果也出现在肖明松等30用果寡糖与糖萜素投喂中华鳖的试验中，该研究表明，果寡糖和糖萜素作为免疫增强剂可以显著降低中华鳖血清中尿素氮的含量。46免疫多糖对水产动物乳酸脱氢酶（LDH）和乳酸脱氢酶同工酶（LDH1）的影响乳酸脱氢酶及其同工酶是与能量代谢过程密切相关的酶。在无氧条件下，LDH催化丙酮酸还原成乳酸,从而完成葡萄糖的无氧酵解过程；同时释放少量ATP分子，为缺氧状态下的机体生命活力提供一定的能量。本研究的结果显示，乳酸脱氢酶和乳酸脱氢酶同工酶1的活性在注射试验后未出现明显变化，但72H后均出现显著的升高（P005），但随后又降至正常水平。有关免疫增强剂对鱼类血清中
15、乳酸脱氢酶及其同工酶的研究笔者尚未见相关报道。笔者认为，诺卡氏菌细胞壁肽聚糖本身作为一种抗原，能刺激机体产生相应的抗体，并激活机体免疫调节作用，显著提高血液内各种酶的活性，增强代谢并消除抗原，进而增强了乌鳢的免疫水平。综上所述，诺卡氏菌细胞壁肽聚糖能够显著提高乌鳢血清溶菌酶、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶及其同工酶1的活性，增加血清总蛋白和白蛋白的含量，增强乌鳢的非特异性和特异性免疫应答水平，因此，肽聚糖作为一种新型的免疫增强剂，用来提高水产养殖动物免疫活性和抗细菌、病毒病感染，具有十分良好的应用前景。10参考文献1杜佳根鱼类诺卡氏菌病危害状况与研究进展J辽宁省大连市大连水产学院,2007527312
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17、OTERIUNTHERMOPHYLUMJVETMEDICALSCI,1994,564337ITAMIT,KONDOM,UOZUMETALENHANCEMENTOFDISEASERESISTANCEAGAINSTENTEROCOCCUSSERIOLICIDAINFECTIONINYELLOWTAILSERIOLAQUINQUERADIATATEMMINCKANDSCHLEGELBYORALADMINISTRATIONOFPEPTIDOGLYCANDERIVEDFROMBIFIDOBACTERIUMTHERMOPHILUMJJFISHDIS1996191851878SITDHIB,MALIBEFF
18、ECTSOFPEPTIDOGLYCANPGONGROWTH,SURVIVAL,IMMUNERESPONSEANDTOLERANCETOSTRESSINBLACKTIGERSHRIMP,PENAEUSMONODONJDISEASESINASIANAQUACULTUREII1995,4694779ITAMIT,MASAYAAENHANCEMENTOFDISEASERESISTANCEOFKURUMASHRIMP,PENAEUSJAPONICUSAFTERORALADMINISTRATIONOFPEPTIDOGLICANDERIVEDFROMBIFIDOBACTERIUMTHERMOPHILUMJA
19、QUACUTURE,1998,16427728810简纪常,吴灶和中草药对建鲤非特异性免疫功能的影响J大连水产学院学报,2002,17211411911周永灿,邢玉娜,冯全英鱼类血细胞研究进展J海南大学学报自然科学版,2003,21217117612王秀华,黄倢,宋晓玲免疫增强剂肽聚糖在对虾养殖中的应用J海洋水产研究,2003,241697413汪小锋,樊廷俊,丛日山,等几种免疫促进剂对中国对虾血细胞数量、形态结构以及酚氧化酶产量和活性的影响J水产学报,2005,291667314火村英,周国勤,杜宣酵母多糖的提取及其对鱼类非特异性免疫功能的影响J生物技术,2004,143454715金珊,王
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22、SEASONALTRENDSINSERUMLYSONZYMEACTIVITYANDTOTALPROTEINCONCENTRATIONINDABLIMANDALIMANDALSAMPLEDFROMLYMEBAY，UKJFISHANDSHELLFISHIMMUNOLOGY,1996,647348226RUNGRUANGSAKTORRISSENK,WERGELANDHI,GLETTEJDISEASERESISTANCEANDIMMUNEPARAMETERSINATLANTICSALMONSALMOSALARLWITHGENETICALLYDIFFERENTTRYPSINISOZYMESJFISHAN
23、DSHELLFISHIMMUNOLOGY,1999,95575681127MISRACK,DASBK,MUKHERJEESCEFFECTOFLONGTERMADMINISTRATIONOFDIETARYGLUCANONIMMUNITY,GROWTHANDSURVIVALOFLABEOROHITAFINGERLINGSJAQUACULTURE,2006,255829428赵红霞,曹俊明,王安利,等饲料中添加1,3葡聚糖对凡纳滨对虾生长性能、体成分和生化指标的影响J动物营养学报,2010,2251464147029刘颖,乔伟亮,魏东,等黑鲷血清生化指标研究J现代农业科技,2010,16307308
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