1、本科毕业设计（20_届）乳酸菌高密度培养技术研究所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录中文摘要0英文摘要00前言11材料111菌种112培养基1121培养基（MRS液体培养基）1122计数培养基（MRS固体培养基）113主要仪器设备114主要试剂12实验方法221菌种活化222PH值的测定223吸光值的测定224活菌计数225补料分批培养226培养条件的优化2261接种量2262PH值2263溶氧量2264培养时间227培养基成分的优化2271不同碳源对乳酸菌培养的影响2272不同氮源对乳酸菌培养的影响3273不同缓冲盐对乳酸菌培养的影响3274基础培养基中生长
2、因子的添加328正交试验329补料分批培养3291补料因素的选择32911补料碳源对乳酸菌培养的影响32912补料氮源对乳酸菌培养的影响42913补料一定比例的碳源和氮源对乳酸菌培养的影响4292补料量的优化43结果与讨论431培养条件的单因素试验4311接种量4312PH值4313溶氧量5314培养时间532培养基成分的单因素实验6321碳源6322氮源6323缓冲盐6324生长因子733正交试验7331正交分析7332极差趋势图分析82333方差分析834补料分批培养9341补料因素选择93411补料碳源对乳酸菌培养的影响93412补料氮源对乳酸菌培养的影响93413补料一定比例的碳源和氮
3、源对乳酸菌培养的影响9342补料量的优化104结论11中文摘要摘要本研究以MRS培养基为细菌增殖基础培养基，在优化培养条件接种量、起始PH值、溶氧量、培养时间和培养基成分碳源、氮源、缓冲盐及生长因子的基础上，采用补料分批培养法进行乳酸菌的高密度培养。实验得出的最佳培养条件是接种量为3，PH值65左右，培养时间为20H，生长因子为VB5和谷酰胺酸，正交试验得出氮源蛋白胨15，碳源葡萄糖2，缓冲盐磷酸氢二钾1为最优条件。在此基础上，通过补料分批培养方式进行高密度培养，得到的优化补料策略为高密度培养时补料碳氮源比单独补料碳源或者碳源要好，而且分批补料一定比例碳氮源（215）的补料总量的最佳值为75，
4、即初始补料25，4H和8H后各补料25，得到的活菌数最高，比常规培养高了5倍，为进一步制备乳酸菌发酵剂奠定了基础。关键词乳酸菌；高密度；培养条件优化；培养基成分优化；补料分批培养。英文摘要ABSTRACTINTHISSTUDY,BASEDONMRSMEDIUMFORCELLCULTUREMEDIUM,INTHEOPTIMALCULTURECONDITIONSINOCULUMSIZE,PH,DISSOLVEDOXYGEN,CULTURETIME,ETCANDMEDIUMCOMPOSITIONCARBON,NITROGEN,BUFFERSALTSANDGROWTHFACTORS,BASEDONTH
5、EUSEOFFEDBATCHCULTUREMETHODHIGHDENSITYCULTUREOFLACTICACIDBACTERIA,LACTICACIDBACTERIASTARTERFORTHEFURTHERPREPARATIONOFTHEBASISTHEOPTIMUMEXPERIMENTALCULTURECONDITIONSWEREINOCULATIONOF3,PHVALUEOFABOUT65,INCUBATIONTIMEOF20H,ANDUSINGGLUTAMINEACIDANDVB5ASGROWTHFACTORCONCLUDEDBYTHEORTHOGONALEXPERIMENT,THEN
6、ITROGENSOURCEOF15PEPTONE,2GLUCOSECARBONSOURCE,DIPOTASSIUMHYDROGENPHOSPHATEBUFFERSALTOF1WERETHEOPTIMUMCONDITIONSONTHISBASIS,FEDBATCHCULTUREBYWAYOFHIGHDENSITYCULTURE,FEEDINGTHEBESTSTRATEGYISCULTIVATIONOFHIGHDENSITYCARBONANDNITROGENSOURCEWEREBETTERTHANFEEDINGASINGLECARBONORCARBONSOURCESANDACERTAINPERCE
7、NTAGEOFFEDBATCHCARBONANDNITROGENSOURCE215OFTHETOTALFEEDINGTHEBESTVALUEOF75,WHICHWASTHEINITIALFEEDING25,4HAND8HAFTERFEEDING25OFALLGETTOLIVETHEHIGHESTBACTERIALCOUNTS,HIGHERTHAN5TIMESTHENORMALCULTURE,FORFURTHERPREPARATIONOFTHISEXPERIMENTLAIDTHEFOUNDATIONFORLACTICACIDBACTERIASTARTERKEYWORDSLACTOBACILLUS
8、HIGHDENSITYCULTURECONDITIONOPTIMIZEOPTIMIZATIONOFMEDIUMCOMPOSITIONFEDBATCHCULTURE0前言乳酸菌是生产发酵乳制品、泡菜、干酪、发酵香肠等传统发酵食品，并赋予其特殊质地、风味和口感的重要微生物菌群，而这些传统食品的专用发酵剂的生产和研制将对实现其工业化生产、缩短产品成熟期、使产品特征标准化和安全化起重要作用，也是传统食品的发展方向1,2。浓缩发酵剂1,2,4具有活力高、体积小、携带使用方便的特点，可直接用于发酵制品生产，省去扩大培养的复杂操作过程，从而简化产品生产工艺，有利于保持产品质量的稳定，防止菌种的退化和污染。乳
9、酸菌浓缩发酵剂制备的关键是要实现其高活性、高密度的培养2,4。高密度培养技术一般指在液体培养中的细胞密度超过常规培养10倍以上的生长状态或培养技术，达到提高菌体发酵密度的目的5。高密度培养不仅可减少培养体积，还可以缩短生产周期、减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高产品市场竞争力4。因此，研究探索乳酸菌的高密度培养技术具有重要意义。在培养过程中，缓冲盐法和化学中和法应用较多，但菌数较低。而透析法由于对设备和技术要求较高，仅在国外资料中有报道6。补料分批培养作为一种高密度培养手段，应用于重组大肠杆菌的培养较为普遍，而应用于乳酸菌高密度培养鲜有报道7。一般来说，脱脂乳和乳清是乳酸菌的最佳培养基
10、，但是使用乳清基质培养基时，乳清蛋白易发生热变性，产生沉淀，同时乳基质和乳清基质培养基因其增殖慢或不易分离菌体而不易采用，常常要配合其他的生长因子方可使用7。本研究以MRS，在优化培养条件接种量、起始PH值、溶氧量、培养时间等和培养基成分碳源、氮源、缓冲盐、生长因子的基础上，采用补料分批培养法进行乳酸菌的高密度培养，为进一步制备乳酸菌发酵剂奠定基础。1材料11菌种戊糖乳杆菌，本实验室分离和保藏12培养基121培养基（MRS液体培养基）胰蛋白胨10G牛肉膏10G酵母膏5G磷酸氢二钾2G柠檬酸二铵2G乙酸钠5G葡萄糖20G吐温801MLMGSO7H2O058GMNSOH2O0189G加水至1000
11、ML灭菌20MIN，T115122计数培养基（MRS固体培养基）在液体培养基里加琼脂14G，溶解再灭菌。13主要仪器设备LDAX40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂DKY恒温调速回转式摇床上海杜科自动化设备有限公司YP202N型电子天平ACCULAB公司PHS25型数显PH计上海精密科学仪器有限公司分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司SPX型智能生化培养箱宁波江南仪器厂DS高速组织捣碎机上海标本模型厂双层落地恒温振荡器太仓光明实验分析仪器厂HWS26型电热恒温水浴锅14主要试剂番茄汁，胡萝卜汁，平菇汁实验室自制蛋白胨生化试剂上海东海制药厂麦芽糖生化试剂上海丽珠东风生物技术有
12、限公司琼脂BR中国医药（集团）上海化学试剂公司吐温80CR中国医药（集团）上海化学试剂公司蛋白胨生化试剂中国医药（集团）上海化学试剂公司牛肉浸膏生化试剂中国医药（集团）上海化学试剂公司磷酸二氢钾天津市博迪化工有限公司葡萄糖天津市博迪化工有限公司蔗糖广东光华化学厂有限公司乳糖上海试剂二厂2实验方法21菌种活化无菌条件下将实验室保藏的菌种少许接入灭菌的MRS培养基中，37条件下培养24H，即菌液浑浊后连续培养3代，再可进行接种。22PH值的测定采用PH计在室温下测定培养基的PH值8。23吸光值的测定借鉴熊涛等8的实验方法，采用UV8500紫外分光光度计在600NM下比色，以蒸馏水为空白,测定菌液吸
13、光值OD值。24活菌计数取1ML发酵液加入到9ML灭菌的生理盐水中，依次做10倍系列稀释，选取三个适当的稀释倍数，吸取1ML稀释液注入无菌培养皿中，涂布法在计数培养基上涂布均匀，每个稀释度做三个平行培养皿5。培养基倒置放入37恒温培养箱中，培养24H。选取菌落数在30300之间的培养皿计菌落数。25补料分批培养根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的适当阶段间歇地补加碳氮源，培养24H后测定OD值。26培养条件的优化261接种量根据叶明等9的文献，在100ML三角瓶中倒入70MLMRS液体培养基，杀菌冷却后分别按1、2、3、4、5的接种量接入菌种，于37条件下在摇床中培养24H，取样分别用
14、平板涂布法测定菌落数，用分光光度计测定吸光值的方法测定菌密度。262PH值借鉴文献10上的方法，用氢氧化钠和盐酸调节培养基的初始PH值在75、70、65、60四个点上。在100ML三角瓶中分别装入70MLPH调至以上4个值的液体培养基以及作为空白对照的MRS液体培养基，接种后37条件下在摇床中培养24H，取样分别用平板涂布法和测定吸光值的方法测定活菌落数及菌体密度。263溶氧量在100ML三角瓶中分别装入70ML的MRS培养基，灭菌接种后分别在0、40、80、120、160R/MIN的恒温摇床上培养24H，取样测定培养液的菌密度，并由此确定最适振荡频率。264培养时间菌种活化扩培后，按最佳培养
15、方式在适宜条件下培养24H，1H取样测定OD值，以培养时间为横坐标，相应的OD值为纵坐标，绘制乳酸菌OD值变化曲线。27培养基成分的优化271不同碳源对乳酸菌培养的影响在MRS液体培养基条件下，固定除碳源以外的因素，选择乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖四种碳源分别加入培养基中，含量都为211。在100ML三角瓶中分别装入70ML的MRS液体培养基，接种量30，培养温度37，接种后在摇床中培养24H，测定培养液的菌体密度。分别以1、2、3、4、5的含量加入培养基中再次培养，测定菌密度，确定碳源的最佳加入量。272不同氮源对乳酸菌培养的影响在MRS液体培养基条件下，固定除氮源以外的因素，选择蛋白胨、硫酸
16、铵、尿素和硝酸钾四种氮源分别加入培养基中，含量都为111。在100ML三角瓶中分别装入70ML的MRS液体培养基，接种量30，培养温度37，接种后在摇床中培养24H，测定培养液的菌密度。确定最佳氮源后，分别以05、1、15、2、25的含量加入培养基中再次培养，测定菌密度，确定氮源的最佳加入量。273不同缓冲盐对乳酸菌培养的影响在MRS液体培养基条件下，选择磷酸盐、醋酸钠、磷酸盐和醋酸钠（11）、不加磷酸盐或醋酸钠四种方式分别加入培养基中，总量都为0711。在100ML三角瓶中分别装入70ML的MRS培养基，接种量30，培养温度37，接种后在摇床中培养24H，测定培养液的菌密度。确定缓冲盐后，分
17、别以04、07、10、15、2、3的含量加入培养基中再次培养，测定菌密度，确定缓冲盐的加入量。274基础培养基中生长因子的添加（1）平菇浸汁的制备取鲜菇200G，切碎加入适量蒸馏水煮沸5MIN后，移入组织捣碎机捣碎，抽滤过滤，定容到400ML，即为平菇浸汁，分别以5、10、15、20、25的量加入液体培养基中灭菌备用。（2）胡萝卜汁的制备取新鲜胡萝卜200G洗净切碎，加入适量蒸馏水煮沸30MIN后，组织捣碎机捣碎，抽滤过滤，定容到400ML，即为胡萝卜汁，分别以5、10、15、20、25的量加入液体培养基中灭菌备用。（3）西红柿汁的制备将200G西红柿洗净，加入适量蒸馏水放于锅内煮沸，抽滤过滤
18、，定容到400ML，即为西红柿汁，分别以5、10、15、20、25的量加入液体培养基中灭菌备用。（4）其他生长因子除西红柿汁、胡萝卜汁、平菇汁之外，还分别添加了木瓜粗肽、VB2、VB5、VB6、乳清蛋白、谷氨酸、缬氨酸、谷酰胺酸等生长因子。其中谷氨酸、缬氨酸、谷酰胺酸以01、03、05、07、09的添加量加入培养基，VB5、VB6、VB2005、01、015、02。025的添加量加入，木瓜粗肽及乳清蛋白以1、2、3、4、5的添加量加入，灭菌后按常规方法接种、培养、测定菌密度。28正交试验通过上面单因子试验确定影响乳酸菌培养最显著的因素碳源、氮源及作为缓冲盐作用的磷酸氢二钾，采用L934正交试验
19、法确定培养基。其装液量70ML100ML三角瓶，接种量30，培养温度37，接种后在摇床中培养24H，测定培养液的OD值及菌落数。正交试验因子及水平如下表1L934正交试验因素水平TABLE1L934FACTORSANDLEVELSOFORTHOGONALTEST水平A碳源B氮源C磷酸氢二钾1105022210533150829补料分批培养在优化培养基及培养条件的基础上，采用补料分批培养方法进行乳酸菌的高密度培养。补料策略安排如下291补料因素的选择2911补料碳源对乳酸菌培养的影响在前面确定的最佳培养条件下，分别进行以下5个方案A、B、C、D、E的碳源补料方案培养11,12（首先通过一次补料比
20、较量，再分别比较分次补料）25、5、75的一次性投料；初始25，4H后补料25；初始25，4H和8H后各补料25。测定各培养液的菌密度。2912补料氮源对乳酸菌培养的影响在前面确定的最佳培养条件下，分别进行以下5个方案A、B、C、D、E的氮源补料方案培养（首先通过一次补料比较量，再分别比较分次补料）25、5、75的一次性投料；初始25，4H后补料25；初始25，4H和8H后各补料2511,12。测定各培养液的菌密度。2913补料一定比例的碳源和氮源对乳酸菌培养的影响在优化的最佳培养条件下，根据前面正交试验的结果确定的碳氮源的最佳比例，碳氮源以215的比例进行混合，然后分别进行以下5个方案A、B
21、、C、D、E的补料培养（首先通过一次补料比较量，再分别比较分次补料）25、5、75的一次性投料；初始25，4H后补料25；初始25，4H和8H后各补料2511,12。测定各培养液的菌密度。292补料量的优化在优化的培养条件的基础上，根据前面正交试验的结果确定的碳氮源的最佳比例，碳氮源以215的比例进行混合，然后分别进行以下5个方案A、B、C、D、E的补料培养,补料总量分别为15、45、75、105、15，每一个量的因素在补料总量不变的情况下分别进行一次、两次、三次补料。以补料总量15为例，有A、B、C三个方案，即15一次性补料；初始075，4H后补料075；初始05，4H和8H后各补料05。依
22、次类推。测定各培养液的菌密度。3结果与讨论通过对乳酸菌高密度培养的条件接种量、PH值、培养时间、氮源、碳源、缓冲盐、生长因子等单因素的试验，确定正交试验的因素及水平，再采用L934正交试验和方差分析筛选各因素水平的最佳组合，在此条件下用补料分批法进行乳酸菌高密度培养。31培养条件的单因素试验311接种量将乳酸菌接种量作为一个因素，研究其对乳酸菌高密度培养的影响。结果如下图1821841861881919219412345接种量OD值图31不同接种量对乳酸菌OD值的影响FIG31EFFECTOFDIFFERENTINOCULABILITYQUANTITYONOD由图31可知，在一定范围内，OD值
23、随着接种量的增加而增大，接种量为3时乳酸菌的OD值达到最大，之后又有所下降。由以上结果可知，不同接种量对最终菌密度有一定影响，接种量大，菌体增殖速度快，发酵周期短，从而减少污染杂菌的机会，但是由于菌体增殖快，产酸量大，使生长过早进入衰亡期造成菌体自溶；接种量小，延滞期长，菌体增殖速度慢，发酵周期延长。从多方面考虑，确定3为较合适的接种量。312PH值乳酸菌在生长过程中，细胞对氢离子有一个自我调节机制，能把代谢中产生的氢离子不断排出胞外，以保证胞内一个相对优良的生长环境，这也是为什么乳酸菌相对更耐酸的部分原因。但当胞外氢离子浓度达到一定程度后，胞内氢离子往外排放也会受阻，积累过多就会对细胞造成损
24、伤13。所以在制作酸奶发酵剂的过程中，有必要通过控制胞外氢离子浓度，缓解乳酸菌细胞内部调节PH的压力，达到增殖菌体数量和减少活性损失的目的。每种微生物都有自己的PH值适宜范围。而微生物细胞对PH值的改变是很敏感的，环境中的氢离子浓度如果超过了微生物的适应范围，就会降低或抑制这些微生物的生命活动。在乳酸菌生长的最适PH值范围内，细菌不仅生长繁殖快，而且活力强。为了确定最佳初始浓度，在配制发酵培养基时分别把初始PH值调至75、70、65、60，接入相同条件的菌种，24H后测定各样品的菌密度，结果如图005115225空白665775PH值OD值图32不同PH对OD值的影响FIG32EFFECTOF
25、DIFFERENTPHONOD从试验结果看，初始PH值为65和自然PH642时，菌密度达到最高。初始PH值过低或过高，都不利于乳酸菌生长。由于MRS培养基的自然PH值为642，因此在配制培养基的时候可以不调PH值，在自然PH值的条件下接种培养乳酸菌。313溶氧量在培养过程当中，溶氧浓度的高低对菌体生长、产物的合成以及产物的性质都会产生不同的影响。一般认为乳酸菌为微好氧菌和专性厌氧菌，对其培养也多采用厌氧培养箱进行厌氧培养，但是，现在也有人通过实验证实了静止培养和摇瓶培养也可以获得较高的细菌数14。史媛英和肖冬光在他们的研究中指出15，在乳酸菌进行摇瓶培养的过程当中，活菌的个数会随溶氧量的增加而
26、增加，但是当溶氧量过高时，活菌的个数反而会有所下降。这说明乳酸菌的生长对氧含量有一定范围的要求。一般来说，溶氧量对乳酸菌的浓缩培养的影响不像其他好氧菌培养的影响那样大。在本实验中，测定结果显示，不同的摇床转速下OD值大小差距不大，即溶氧量对乳酸菌的生长繁殖影响不大。314培养时间在前面优化的培养条件的基础上，为了进一步了解菌体在此培养基中的生长过程，更准确的掌握其生长情况，绘制了菌体OD值变化曲线，从而掌握乳酸菌的最佳培养时间，具体变化情况如下图005115225123456789101112131415161718192021222324图33乳酸菌OD值变化曲线FIG33OD600VARI
27、ETYDURINGTHEGROWTHPROCESS由图33可以看出，乳酸菌经过24H左右的迟滞期后OD值开始激增，15H后达到高峰，进入平稳期，此后菌密度基本不再增加。本实验培养观测了24小时，若继续培养下去菌密度应该会下降，那是因为菌体开始自溶。综上所述，乳酸菌的最适收获期为15H，此时细胞积累量最大。32培养基成分的单因素实验321碳源通过在培养基中加入不同的碳源蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖四种碳源，研究了其对乳酸菌生长的影响，对基础培养基进行优化，并在确定最佳碳源的基础上进一步优化加入量。实验结果如下图002040608112蔗糖乳糖葡萄糖麦芽糖碳源OD值11214161822212345
28、碳源量OD值图34不同碳源对OD值的影响图35不同碳源量对OD值的影响FIG34EFFECTOFDIFFERENTCARBONFIG35EFFECTOFDIFFERENTCARBONSOURCEONODSOURCEAMOUNTONOD由图34可知，葡萄糖是乳酸菌生长繁殖的最佳碳源，由图35进一步可知，葡萄糖的适宜加入量是2。322氮源通过在培养基中加入不同的氮源蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾和尿素四种氮源，研究了其对乳酸菌生长的影响，对基础培养基进行优化，并在确定最佳氮源的基础上进一步优化加入量。根据实验结果绘制如下图表002040608112蛋白胨硝酸钾尿素硫酸铵氮源OD值1751818519195
29、212345氮源量OD值图36不同氮源对OD值的影响图37不同氮源量对OD值的影响FIG36EFFECTOFDIFFERENTNITROGENFIG37EFFECTOFDIFFERENTNITROGENSOURCEONODSOURCEAMOUNTONOD从图中显而易见，蛋白胨是乳酸菌生长繁殖的最佳氮源，适宜的加入量是1。此外，尿素尤其不适合作为乳酸菌培养基的氮源。323缓冲盐当PH值降低至40以下时，菌体的生长繁殖受到抑制作用15，因此要选择一种符合要求的缓冲物质，在培养阶段调整生长培养基的PH值，提高菌密度及活菌数。由于乳酸菌在代谢过程中能分解糖类产生大量有机酸类，其中主要是乳酸，随着发酵进
30、程的继续，乳酸含量逐渐增加，致使培养基的酸度升高，乳酸菌的繁殖便被抑制甚至死亡。为了促进乳酸菌的生长繁殖，可预先在发酵培养液中加入对乳酸菌生长无影响或有促进作用的缓冲溶液，以调节和控制发酵液PH的相对稳定，保证乳酸菌生长繁殖必需的条件。根据一些报道16,17本实验选取K2HPO4和NAAC两种缓冲盐，分别加一种或两种或都不加，进行单因素试验，并在确定适宜缓冲盐的基础上进行量的优化，结果见图3839。00204060811214磷酸氢二钾/乙酸钠25都不加磷酸氢二钾磷酸氢二钾/乙酸钠11乙酸钠缓冲盐OD值181851919522052121507011015023缓冲盐的添加量OD值系列2图38
31、不同缓冲盐对OD值的影响图39缓冲盐的添加量对OD值的影响FIG38EFFECTOFDIFFERENTBUFFERONODFIG39EFFECTOFBUFFERAMOUNTONOD根据图38和39很明显可以看出，乳酸菌生长繁殖的最适缓冲盐是磷酸氢二钾，优化量是15。324生长因子大多数乳酸菌是生长因子异养型微生物，它们需要从外界提供维生素等多种生长因子，虽然生长因子的需求量很少，但它对乳酸菌的正常代谢必不可少，在促进其生长方面起着重要的作用18,19。为了测定各生长因子对乳酸菌生长的影响，除了选择目前报道较多的番茄汁、平菇浸汁和胡萝卜汁三种物质作为生长因子外，还选择了木瓜粗肽、VB2、VB5、
32、VB6、乳清蛋白、谷氨酸、缬氨酸、谷酰氨酸等进行单因素试验，但是其中大多数因子对乳酸菌的生长繁殖没有显著影响，甚至VB6还有抑制作用，只有VB5和谷酰胺酸的影响较显著。结果如图410411。1919522052121522005010015020025维生素B5OD值220220420620821212214216218010030050070090谷酰胺酸OD值图310维生素B5的添加量对OD值的影响图311谷酰氨酸的添加量对OD值的影响FIG310EFFECTOFVB5AMOUNTONODFIG311EFFECTOFGLUTAMYLAMOUNTONOD根据上图310可知，维生素B5的最佳添
33、加量是015，图311可知，谷酰氨酸的最佳添加量是05。33正交试验331正交分析从单因素的分析中，可以判断得出碳源，氮源，缓冲盐这三个因素对于乳酸菌生长繁殖的影响最大，因此将这三个因素作为正交试验的三个水平，进一步优化确定乳酸菌高密度培养最佳的条件20、21。表2正交试验结果及分析TABLE2RESULTSANDANALYSISOFORTHOGONALTEST试验号ABC空列OD值111111789212221784313331809421231811522311874623121961731321794832131873933211918K15382539456235581K2564655
34、3155135539K35585568854775493K11794179818741860K21882184418381846K31862189618261831极差R0088009800480029由上表可确定优化方案为BAC,即氮源为最主要因素，其次为碳源，本试验中缓冲盐影响最小，分析原因可能是因为所选的三个水平的缓冲盐都是比较适宜的22。根据OD值的极差分析可知，优化方案是B3A2C1，即氮源15，碳源2，缓冲盐1。332极差趋势图分析17417617818182184186188190501150123020050080氮源碳源缓冲盐OD值图312不同因素对OD值的影响FIG312E
35、FFECTOFDIFFERENTFACTORSONOD通过极差趋势图可看出，主要影响因素B氮源含量在15时，对应的OD值最大，因此选择15作为氮源的最佳添加量；碳源添加量在2时，OD值最大，因此，2是理想的碳源添加量；缓冲盐的添加量在1时，OD值达到最大，因此，1是理想的缓冲盐添加量。故也可以得到最佳培养方案B3A2C1。333方差分析表3正交试验方差分析TABLE3ANALYSISOFVARIANCEOFORTHOGONALTEST变异来源OD值F01（2,2）DFSSMSFA200125000625125900B20014200071142C2000360001836误差E20001000
36、005总和800313001565通过方差分析（表3），可以看出，在显著性水平01上，碳源、氮源对试验结果有显著影响，而缓冲盐无显著影响。34补料分批培养341补料因素选择3411补料碳源对乳酸菌培养的影响培养基初始PH值65左右，接种量3、培养温度37、培养时间24H。根据测得的菌密度实验结果绘制如下图表2052121522225ABCDE补料碳源方案OD值图313补料碳源对OD值的影响FIG313EFFECTSOFFEEDINGBATCHCARBONSOURCEONOD从图313中显而易见，一次性投料的A、B、C三个方案中，方案C的菌密度最高。另外，D、E二种分批补料培养方案都比一次性投料
37、方案要好，而且方案E的菌密度比D方案高。不过各个方案菌密度大小差距都不是很大。3412补料氮源对乳酸菌培养的影响培养基初始PH值65左右，接种量3、培养温度37、培养时间24H。测得菌密度的结果如图2182222222422622823ABCDE补料氮源方案OD值图314补料氮源对OD值的影响FIG314EFFECTSOFFEEDINGBATCHNITROGENSOURCEONOD根据上图可知，一次性投料的A、B、C三个方案中，方案B的菌密度最高。另外，D、E二种分批补料培养方案要比A、C两种一次性投料方案要好，但是E方案比B和D方案菌密度要小，可能是氮源补料过多反而抑制了乳酸菌的生长。另外，
38、D、E方案分别比B、C方案要好，说明在补料总量不变的情况下，分批补料比一次性投料要好。不过各个方案菌密度大小差距也不是很大。3413补料一定比例的碳源和氮源对乳酸菌培养的影响224283236ABCDE补料一定比例碳氮源方案OD值图315补料一定比例碳氮源对OD值的影响FIG315EFFECTSOFFEEDINGBATCHINSPECIFICCNRATIOONOD培养基初始PH值65左右，接种量3、培养温度37、培养时间24H。由上图可知，一次性投料的A、B、C三个方案中，其中方案C的菌密度最高，但是和方案A、C的结果相差不大。另外，D、E二种补料培养方案都比一次性投料方案要好，而且方案E测得
39、菌密度比D高很多，同时E方案也比单独补料碳源或氮源中的E方案要好很多，因此，采用一定比例的碳氮源作为补料因素进行分批补料最好。342补料量的优化在确定补料因素，即一定比例碳氮源的基础23上，根据C/N比例215进行补料。在最佳培养条件下，培养基初始PH值65左右，接种量3、培养温度37、培养时间24H。补料总量15、45、75、105、15分别分三次补料，即方案A、B、C、D、E，补料时间间隔为初始补料、4H和8H后分别补料，结果如下222242628ABCDE一定比例碳氮源的分批补料总量OD值图316分批补料一定比例碳氮源的总量对OD值的影响FIG316EFFECTSOFTHETOTALAM
40、OUNTOFFEEDINGBATCHINSPECIFICCNRATIOONOD由图316可知，方案B的菌密度最高，即一定比例碳氮源的补料总量为75（每次补料25）时菌密度最高，此方案最好。因此，分批补料一定比例碳氮源的补料总量的最佳值为75，即初始补料25，4H和8H后各补料25。在此基础上，进一步测定方案B的活菌数，并与普通MRS培养基中的活菌数进行比较。将方案B中的菌液和在同样条件下培养的普通MRS培养基中的菌液用平板涂布法测定菌落数。培养48H小时后，通过平板计数法24数出菌落数，进一步推算可知，普通MRS培养基中的菌液的活菌数为48108，通过高密度培养的菌液的活菌数为236109，大
41、大高于普通培养。补料分批发酵在微生物高密度培养中应用较多，特别是应用在重组大肠杆菌的高密度培养中技术已相当成熟。在补料分批培养过程中，高密度发酵成功的关键是补料策略的选择。它是根据菌株生长和初始培养基的特点，在分批培养的某些阶段以某种方式间歇地或连续地补加新鲜培养基，使菌体及其代谢产物的生产时间延长的培养方式。因此，补料分批培养（又称流加培养）比其它培养方法具有更多的优越性。贺稚非等21综合运用缓冲盐法及补料培养法，使培养液中乳酸菌的活菌数达到724109CFU/ML。目前，我国超浓缩酸奶发酵剂的制备技术还不完善，商业化超浓缩酸奶发酵剂国内还没有厂家生产，作为发酵剂制备的核心技术，乳酸菌高密度
42、培养的研究及应用势在必行。随着市场需求的日益扩大，乳酸菌高密度培养技术必将广泛地应用于乳酸菌发酵剂的生产中。如此，不仅能改进乳酸菌发酵的工艺，提升其现代化发酵进程，而且对增加单位体积培养液中的菌体数量，提高生产效率，加速乳酸菌发酵剂的商品化进程，更好地满足市场需求，均具有重要而深远的意义23,24。可以预见，乳酸菌高密度培养技术的市场前景十分广阔。4结论41通过优化单因素培养条件得出37下培养乳酸菌，其高密度培养的最佳接种量为3，最佳PH值为自然PH即PH65左右，溶氧量对乳酸菌菌种戊糖乳杆菌的生长影响不大。另外，由生长曲线可知，04H为迟滞期，415H为对数生长期，1524H为稳定期，菌密度
43、基本不再增加，因此最佳培养时间为20H。42通过优化培养基成分得出37下培养乳酸菌，其高密度培养的最佳碳源为葡萄糖，适宜量为2，最佳氮源为蛋白胨，适宜量为1，最佳缓冲盐为磷酸氢二钾，适宜量为15，生长因子中，015的VB5和05的谷酰胺酸的影响较为显著，其余因素相对不显著。43通过对三个最显著的单因素（碳源、氮源、缓冲盐）进行正交试验L934得出氮源15，碳源2，缓冲盐1是乳酸菌生长繁殖的最适宜条件。44通过补料分批培养方法得出的最佳补料策略是补料碳氮源比单独补料碳源或者碳源要好，而且分批补料一定比例碳氮源（215）的补料总量的最佳值为75，即初始补料25，4H和8H后各补料25。通过补料分批
44、培养法进行高密度培养的最终活菌数为236109，远高于普通培养48108。参考文献1EGONBECHHANSENCOMMERCIALBACTERIALSTARTERCULTURESFORFERMENTEDFOODSOFTHEFUTUREJINTJFOODMICROBIO,2002,781191312刘振民,骆承庠乳酸菌发酵剂生产工程技术J食品与发酵工业,2000,26468723山丽杰,田洪涛,贾英民等浓缩型乳酸菌发酵剂制备中几个技术关键问题的探讨J中国乳品工业,2002,30566694RIESENBERGD,GUTHKERHIGHCELLDENSITYCULTIVATIONOFMICROO
45、RGANISMSAPPLMICRBIOLBIOTECHOL1999,514224305熊晓辉,熊强,陆利霞乳酸菌发酵剂高密度培养的研究J中国调味品,2004517216OGBONNAJC,MARKLHNUTRIENTSPLITFEEDINGSYRATEGYFORDIALYSISCULTIVATIONOFECOILBIOTIECHNOLBLOENG,1993,41109210997靳志强,郝林,李平兰等德氏乳杆菌保加利亚亚种高密度培养的研究初探J现代食品科技,2006,222488陆利霞,熊强,熊晓辉乳酸杆菌半连续式高密度培养的研究J研究与探索,20051247499叶明,李太元,李艳茹等蝌蚪元
46、乳酸菌的人工高密度培养条件的优化J动物生产,2009,455505210谷长维,李太元,常巧呈等犬源乳酸菌高密度培养条件的优化J中国微生态学杂志,2007,19325125511熊涛,徐立荣,范镭等蔬菜发酵专用乳酸菌的菌体高密度培养J食品科学,2007134534912李平兰补料分批法高密度培养德氏乳杆菌保加利亚亚种S1J中国乳品工业,2007,3514913李莹,周剑忠,董明盛乳酸菌高密度培养技术研究进展J乳品加工,20083444614吕嘉沥,丁博浓缩乳酸菌发酵剂的浓缩培养的研究进展J食品科技,200765815吴祖芳,翁佩芳楼佳瑜乳酸菌的高密度培养及发酵剂保藏技术的初步研究J食品与发酵工
47、业,2009,35105916吕为群,骆承庠乳酸菌在冷冻干燥过程中存活率的影响因素探讨J中国乳品工业,1993,21521722017吕兵,张国农,杨瑞欢嗜酸乳杆菌生物学特性及其发酵乳的研究J中国乳品工业,2002,305373918柏建玲,莫树平,郑婉玲等乳酸菌增菌培养基的营养因子优化J食品与发酵工业,2007,332798119刘云鹤,何煜波肉品发酵剂增殖培养基及培养条件的研究湖南农业大学学报自然科学版,2002,28323423620史嫒英,肖冬光酸奶发酵剂高浓度培养的研究J天津轻工业学院学报,19991202521贺稚非,向瑞玺,李洪军等泡菜活性直投式乳酸菌发酵剂的研究J食品科学,20
48、06,27819119722ULRICHKULOZIKANDJURGENWILDERAPIDLACTICACIDPRODUCTIONATHIGHCELLCONCENTRATIONSINWHEYULTRAFILTRATEBYLACTOBACILLUSHELVETICUSBIOTECHOL1999,2136540323AOLMOSDICHARA,FAMPE,JLURIBELARREA,APAREILLEUXANDGGOMAGROWTHANDLACTICACIDPRODUCTIONBYLACTOBACILLUSCASEISSPRHAMNOSUSINBATCHANDMEMBRANEBIOREACTORINUENCEOFYEASTEXTRACTANDTRYPTONEENRICHMENTBIOTIECHNOLBLOENG,1999,361057106524黄良昌,吕晓玲,姚秀玲保加利亚乳杆菌浓缩培养的研究J中国乳品工业,2002,3011215
