1、本科毕业设计（20_届）三疣梭子蟹LGBP基因的克隆和组织表达所在学院专业班级水产养殖学学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言22材料和方法321实验材料3211实验用蟹3212主要试剂与药品3213菌株3214引物3215主要仪器422实验方法4221菌株培养4222细菌刺激实验4223血细胞的提取4224总RNA的提取4225SMARTCDNA的合成4226保守序列克隆52261PCR扩增52262PCR产物回收52263感受态细胞制备62264PCR产物的连接和转化62265单克隆培养与检测622663RACE622675RACE7227序列分析9228LGBP组织表达分析922
2、81实验准备92282总RNA提取92283CDNA的合成92284ACTIN和LGBP基因的RTPCR检测93实验结果1131总RNA的提取1132全长CDNA的克隆1133三疣梭子蟹LGBP基因序列分析11331LGBP基因及其对应氨基酸序列11332LGBP氨基酸序列同源性比较1334LGBP组织表达分析144讨论15致谢17参考文献181摘要采用金黄色葡萄球菌SAUREUS和溶藻弧菌（VIBRIOALGINOLYTICUS）混合刺激三疣梭子蟹（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）后，提取其血细胞总RNA，再通过同源克隆和SMARTRACE技术获得了LGBP基因并对其进行了生
3、物信息学分析，结果表明，该基因序列全长为1378BP，其中包含1095BP的开放阅读框OPENREADINGFRAME，ORF，在基因的5端含有138BP的非编码区UTR，3端含有144BP的UTR，AATAAA为加尾信号具体数据。RTPCR结果显示LGBP基因在被检测的三疣梭子蟹组织，包括血细胞、肝胰腺、心脏、鳃和肌肉中都有表达；并且在肝胰腺和血细胞中的表达明显高于其他组织。这些结果的得到为我们深入了解三疣梭子蟹LGBP的功能提供了理论依据。关键词三疣梭子蟹；LGBP；基因克隆；组织表达ABSTRACTTHETOTALRNAWASEXTRACTEDFROMVIBRIOALGINOLYTICU
4、SANDSAUREUSCHALLENGEDHAEMOCYTESOFPTRITUBERCULATUSUSEDTHETECENOLOGIESOFSTRATEGYOFHOMOLOGYCLONINGANDSMARTRACE,WEGETTHEGENESEQUENCESOFLGBP,ANDTHEBIOINFORMATICSANALYSISOFLGBPSHOWEDTHATTHESEQUENCELENGTHOF1378BPCONTAININGA1095BPOPENREADINGFRAMEORF,ANDTHE5ENDOFGENECONTAINSA138BPNONCODINGREGIONUTR,ATTHESAME
5、TIME,THE3ENDGETSA144BPNONCODINGREGION,WITHAENDSIGNALOFAATAAATHERTPCRRESULTSSHOWSTHATTHELGBPWASDETECTEDINPORTUNUSTRITUBERCULATUSORGANIZATIONS,INCLUDINGBLOODCELLS,LIVERANDPANCREAS,HEART,GILLANDMUSCLE,ANDEXPRESSIONOFLGBPISHIGHERINBLOODCELLSANDHEPATOPANCREASTHANINOTHERTISSUESTHESERESULTSHAVEPROVIDEDTHOE
6、RTICALBASISTOHELPUSHAVEABETTERUNDERSTANDOFLGBPINPORTUNUSTRITUBERCULATUSKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUSLGBPCLONETISSUEEXPRESSION21引言1997年MEDZHITOV等提出了病原相关分子模式PATHOGENASSOCIATEDMOLECULARPATTERNS，PAMPS和模式识别受体PATTERNRECOGNITIONRECEPTORS，PRRS的概念1，阐述了模式识别受体识别“自己”“非己”的能力，初步揭示了先天免疫在机体抗病免疫中的作用。三疣梭子蟹为无脊椎动物，其没
7、有特异性免疫2,3，因此其先天免疫的“非己”识别更为重要，这种“非己”识别是因为其体内存在某些特异性的模式识别受体PATTERNRECOGNITIONRECEPTORS，PRRS，也称为模式识别蛋白PATTERNRECOGNITIONPROTEINS，PRPS，如C型凝集素、肽聚糖识别蛋白、1,3葡聚糖结合蛋白、脂多糖1,3葡聚糖结合蛋白、脂多糖结合蛋白等，它们能够识别并结合微生物表面保守的、而在宿主中又不存在的病原相关分子模式PAMPS（脂多糖（LPS）、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖、病毒DSRNA、细菌DNA等）。由于这些大分子对微生物的存活是必需的，因此微生物不能通过改变PAMPS来避免被
8、先天免疫系统识别。目前，对先天免疫识别的研究主要集中在哺乳动物4,5、昆虫6,7、线虫5等，而水产动物模式识别受体的研究相对较少，主要针对淡水螯虾、凡纳对虾（LVANNAMEI）、南美白对虾、中国明对虾等虾类1,8,9和栉孔扇贝8,10、中华绒螯蟹（ERIOCHEIRSINENSIS）等。据报道，LGBP（LIPOPOLYSACCHARIDEANDBETA1，3GLUCANBLINDINGPROTEIN），即脂多糖1，3葡聚糖结合蛋白，它作为一种模式识别受体在甲壳动物的先天免疫中占有重要地位，它能够识别G细菌和真菌的细胞壁多糖成分脂多糖和1，3葡聚糖，在异物侵入机体时，可以促进血淋巴细胞的吞噬
9、、黑化、包囊、凝集及激活蛋白酶级联反应，引起抗菌肽的合成11。三疣梭子蟹（PORTUNUSTRIUBERBUCULATUS）属于甲壳纲（CRUSTACEA）、十足目（DECAPODA）、梭子蟹科（PORTUNUIDAE）、梭子蟹属（PORTUNUS），地方名有梭子蟹、枪蟹、海螃蟹、水蟹等12,13。三疣梭子蟹是我国大型海养蟹类，具有十分重要的经济价值和营养价值，也是我国沿海水产养殖重要的经济种。随着水产养殖业的全面发展，三疣梭子蟹的养殖也在沿海蓬勃兴起，养殖规模日趋增大，其病害也随之增多1417，目前三疣梭子蟹的病害对其养殖产量造成了不可忽视的损失，因此，对于三疣梭子蟹的病害防控研究十分必要。
10、但是，目前在养殖生产中对三疣梭子蟹病害的防治仍是以药物防治为主，这不仅易造成环境污染，同时也危害着人类的健康。而免疫防治是从机体的免疫机制入手，利用机体自身的免疫系统来提高其抗病、抗逆和生存能力，不再继续依靠药物来防治病害，使水产动物更加健康环保，因此，水产动物的免疫防治是今后水产病害防治发展的方向。本文以三疣梭子蟹为研究对象，采用同源克隆和SMARTRACE技术，对三疣梭子蟹的LGBP进行了基因克隆，并通过RTPCR方法检测了LGBP基因在三疣梭子蟹组织中的分布，研究结果不仅为三疣梭子蟹LGBP功能研究和其他后续研究打下了深厚的基础，同时也对探讨三疣梭子蟹的免疫防御机理以及促进三疣梭子蟹养殖
11、业的健康发展具有重要的意义。32材料和方法21实验材料211实验用蟹实验所用三疣梭子蟹购自宁波市场，蟹体健康、活泼，肢体完好，体重13030G，购回后暂养于实验室水簇箱中。212主要试剂与药品EXTAQ，LATAQ，SMARTTMRACECDNAAMPLIFICATIONKIT，PRIMESCRIPTTM1STSTRANDCDNASYNTHSEISKIT，PMD18T，UNIZOL试剂，UNLQ10柱式DNA胶回收试剂盒，MARKER2000，电泳琼脂糖，DEPC水，HEPES，无水乙醇、氯仿、异丙醇、EDTANA2、NACL、KCL、CACL2等。213菌株金黄色葡萄球菌SAUREUS、溶藻
12、弧菌VALGINOLYTICUS、大肠杆菌DH5均取自于本校生命科学与生物工程学院水产动植物病害研究室。214引物本实验采用PRIMERPREMIER50软件设计LGBP基因克隆所需引物，以及根据其他生物ACTIN的保守区序列设计ACTIN的RTPCR引物，针对已获得的三疣梭子蟹LGBP基因CDNA序列设计特异性引物，具体引物及其序列如表1。表1LGBP基因克隆所用引物及序列TAB1PRIMERSUSEDINTHECLONINGOFLGBPGENE引物PRIMER序列SEQUENCELGF1LGR1GSP31GSP32GSP51GSP52ADAPTORAPM1347M13RVACTINFACT
13、INR5CCCGTGCATGATCTTCGA35ACTTCTGGTCGAAGGGCG35CCACCTTGTTCATAAAGCCGC35TACCTGGCGTGTAGACTGGACC35CGGTCGCATCCATAGTTCTGGTTGG35CGTGGCATCTTGGCCCGAACCTC35GGCCACGCGTCGACTAGTACT1735GGCCACGCGTCGACTAGTAC35CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC35GAGCGGATAACAATTTCACACAGG35CCTGACTGCCTACCTCACCAA35ATGCCGACAGATTCCATACCC34LRT1LRT25TTC
14、GGAGACCCAGTCAACATC35TTTCAGCGATGCCGTCAGG3215主要仪器PCR仪，电泳仪，水平电泳槽，凝胶图像处理系统，超微量核酸蛋白测定仪，超高速分散机，高速冷冻离心机，微型离心机，三孔电热恒温水槽，电热恒温培养箱，全自动立式电热压力蒸汽灭菌锅，电子天平等。22实验方法221菌株培养取溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5菌株接种于LB培养基，37恒温培养24H备用。222细菌刺激实验选取健康三疣梭子蟹成蟹10只进行细菌刺激实验，实验用LB培养基活化的溶藻弧菌和金黄色葡萄球菌混合菌悬液，浓度均为107CELLSML1，注射量为20L，刺激6H后抽取蟹的血淋巴。223血
15、细胞提取细菌刺激6H后，用无菌注射器（5ML）在梭子蟹的第三步足基关节处抽取蟹的血淋巴，将抽取到的血淋巴液与抗凝剂（EDTANA210MM，NACL450MM，KCL10MM，HEPES10MM）按11的比例混合均匀，并使用离心机，在4000R/MIN，4的条件下离心10MIN，得到血细胞的沉淀，保存在70冰箱中，用于总RNA的提取。224总RNA提取总RNA的提取采用上海博星公司的UNIZOL试剂盒，具体步骤按照说明书如下（1）每50100MG血细胞中加入1MLUNIZOL，用分散机彻底匀浆。（2）将匀浆液转移至10ML离心管中，12000RPM4C离心10MIN，以除去不溶性物质。（3）转
16、移上清至另一离心管中，1530C放置5MIN以充分裂解核蛋白复合体。（4）每1MLUNIZOL中加入02ML氯仿，剧烈振荡15S后，在1530C放置3MIN，然后12000RPM4C离心15MIN。（5）转移上层水相至另一离心管中，每1MLUNIZOL加入05ML异丙醇，充分缓慢混匀溶液后，1530C放置10MIN沉淀RNA，12000RPM4C离心10MIN。（6）弃尽上清液，每1MLUNIZOL加入1ML75乙醇，洗涤RNA沉淀。用涡旋振荡器短暂涡旋数秒后，7500RPM4C离心5MIN。（7）干燥RNA沉淀注意不要完全干燥，加入适量DEPC水溶解，于5560C水浴中孵育10MIN，并在7
17、0C保存备用。225SMARTCDNA的合成本实验用PRIMESCRIPTTM1STSTRANDCDNASYNTHSEISKIT试剂盒进行逆转录，具体步骤如下（1）在微管中配制一下混合液DNTPMIXTURE10MMEACH1LOLIGODT50M1LTOTALRNA15G5RNASEFREEDH2O加至10L（2）在PCR仪上进行下列条件的变性及退火反应65C5MIN冰上急速冷却。（3）继续在上述微管中配制下列反转录溶液上述原反应液10LPRIMESCRIPTTMRTASE200U/L4LRNASEINHIBITOR40U/L05L5PRIMESCRIPTTMBUFFER1LRNASEFRE
18、EDH2O45LTOTAL20L（4）在PCR仪上按下列条件进行反转录反应42，60MIN70，15MIN。（5）反转录得到的溶液保存于20。226保守序列的克隆2261PCR扩增根据GENEBANK中相近物种LGBP核酸序列的保守区合成同源引物LGF1（5CCCGTGCATGATCTTCGA3）和LGR1（5ACTTCTGGTCGAAGGGCG3）。并以三疣梭子蟹的血细胞SMARTCDNA为模板，进行PCR扩增超纯水158LSMARTCDNA10L10PCRBUFFER25LMGCL225MMOL/L15LDNTP25MMOL/L20LLGF110MOL/L10LLGR110MOL/L10L
19、EXTAQ5U/L02L总体积25LPCR扩增条件为94C变性40S94C变性4MIN，54C退火60S35个循环，72延伸10MIN72C延伸60S2262PCR产物回收（1）用干净的刀片在紫外线下割下含需要回收DNA的琼脂糖块，称重，并放入15ML离心管中。（2）以1MG1L换算凝胶的体积，加入4个胶体积的BINDINGBUFFER。（3）将上述离心管置于5060C水浴中10MIN，使胶彻底融化。加热溶胶时每2MIN混匀一次。（4）将融化的胶溶液转移套放在2ML收集管内的UNIQ10柱中，室温放置2MIN。12000RPM室温离心1MIN。6（5）取下UNIQ10柱，倒掉收集管中的废液，将
20、UNIQ10柱放入同一个收集管中，加入500LWASHSOLUTION，12000RPM室温离心1MIN，重复此步骤一次。（6）取下UNIQ10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ10柱放入同一个收集管中12000RPM室温离心2MIN。离心后的UNIQ10柱再放入恒温箱中50C干燥5MIN，有助于酒精的挥发，提高DNA的洗脱率。（7）将UNIQ10柱放入一根新的15ML离心管中，在柱子膜中央加40LELUTIONBUFFER，并于60C温浴5MIN。（8）12000RPM室温离心1MIN，离心管中的液体即为回收的DNA片段，20C保存备用。2263感受态细胞的制备（1）将大肠杆菌DH5菌株接种
21、到5ML的LB液体培养基中，37C培养过夜。（2）取1ML培养液至100MLLB液体培养基中，37C振荡培养225H，至OD60003504。（3）将培养液分装至15MLEPPENDORF管中，冰浴20MIN。（4）将上述15MLEPPENDORF管置于4C8000RPM离心1MIN，弃上清。（5）用200L01MOL/LCACL2悬浮沉淀，冰浴30MIN。（6）4C5000RPM离心5MIN，弃上清。（7）沉淀用100L01MOL/LCACL2悬浮，70C保存备用。2264PCR产物的连接和转化（1）在微量离心管中配制下列DNA溶液PMD18T03L回收的PCR产物22LSOLUTIONI2
22、5L总体积50L在16下反应3H，全部50L转化为感受态细胞。（2）全量（5L）加入至100LDH5感受态细胞中，冰中放置30MIN。（3）42加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。（4）将以上液体加入895LLB液体培养基，37C振荡培养1H。（5）4C5000RPM离心1MIN，弃900L上清，将剩余菌液涂于含AMP终浓度为100G/ML的LB琼脂板上，37C过夜培养。2265单克隆培养和检测用接种环刮取单菌落，在已有10L超纯水的PCR管中连续震荡之后，吸取9L至5ML含AMP的LB液体培养基中，37C振荡培养。剩余1L用通用引物M1347和M13RV进行PCR扩增，PCR产物用琼脂糖凝胶
23、电泳检测是否含有相应大小的目的条带，确定为阳性克隆之后，将含有阳性单菌落的菌液培养至对数生长期后，取1ML送至上海英骏生物公司进行测序。22663RACE利用网上基因数据库比对本实验获得的LGBP部分序列与其他物种LGBP的同源性，并根据测得的部分LGBP序列设计正向内引物GSP31和外引物GSP32，分别与反向接头引物AP配对，以3RACEADAPTOR为引物合成的第一链CDNA作为模板，进行巢式PCR反应体系超纯水158LSMARTCDNA10L10PCRBUFFER25L7DNTP25MMOL/L15LMGCL225MMOL/L20LGSP3210MOL/L10LAP10MOL/LLAT
24、AQ5U/L总体积25L反应条件94C变性4MIN94C变性30S60C退火40S35个循环72C延伸60S72C延伸10MIN以得到的产物为模板，进行第二次PCR扩增第二次PCR扩增的反应体系为超纯水158LSMARTCDNA10L10PCRBUFFER25LMGCL225MMOL/L15LDNTP25MMOL/L20LGSP3210MOL/L10LAP10MOL/LLATAQ5U/L总体积25L反应条件为94C变性4MIN94C变性30S58C退火40S35个循环，PCR产物回收同1262。72C延伸60S72C延伸10MIN22675RACE（1）总RNA的提取实验方法同124，利用CL
25、ONTECH的SMARTTMRACECDNAAMPLIFICATIONKIT试剂盒，按照说明书进行5RACE实验。（2）LGBP基因第一链CDNA的合成具体步骤如下1、在微管中加入以下反应体系RNA1G5CDSPRIMERA1GSMARTAOLIGO1L总体积加H2O至5L2、在PCR仪中进行如下反应65，5MIN冰上急速冷却83、在上述微管中配制下列反转录反应液DTT20MM2L5FIRSTSTRANDBUFFER1LDNTPMIX10MM1LMMLVREVERSETRANSCRIPTASE1LTOTALVOLUME10L4、慢慢混匀以上反应液，在PCR仪上42C反应15H。5、用100LT
26、RICINEEDTABUFFER稀释第一链CDNA反应产物。6、在PCR仪上72C反应7MIN后，20C保存备用。（3）PCR扩增利用上述克隆得到的基因片段，设计出两条特异性反向引物GSP51和GSP52，进行PCR扩增，反应体系如下超纯水157LSMARTCDNA10LMGCL225MMOL/L25L10PCRBUFFER15LDNTP25MMOL/L20LGSP5110MOL/L10LUPM10LLATAQ5U/L03L总体积为25LPCR反应条件为94C4MIN94C30S72C2MIN94C30S70C30S5个循环72C2MIN94C30S68C30S25个循环72C2MIN72C1
27、0MIN以回收的产物为模板，稀释50倍，进行第二次PCR扩增，具体反应体系如下超纯水157L5个循环9SMARTCDNA10L10PCRBUFFER25LMGCL225MMOL/L15LDNTP25MMOL/L20LGSP5210MOL/L10LNUP10LLATAQ5U/L03L总体积25L第二次PCR反应条件为94C5MIN94C30S68C30S25个循环72C2MIN72C10MINPCR产物回收方法同1262227序列分析利用DNASTAR软件将克隆得到的序列进行拼接，将所得序列利用HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV网站上的BLASTN工具进行数据库基因序列的相似性及同源性查
28、找；进一步比较同源性利用CLUSTALW2HTTP/WWWEBIACUK/TOOLS/CLUSTALW2/。228LGBP组织表达2281实验准备将健康成蟹分成三组，每组10只，第一组为正常组，即空白对照组，第二组每只注射15L生理盐水，第三组用金黄色葡萄球菌和溶藻弧菌等比组合的混合细菌液注射，每只同样为15L（细菌浓度均为107CELLSML1）。2282总RNA的提取分别提取混合细菌刺激的实验组三疣梭子蟹血细胞、肝胰腺、心脏、鳃和肌肉等组织的总RNA。方法同124。2283CDNA的合成采用PRIMESCRIPTTM1STSTRANDCDNASYNTHSEISKIT试剂盒逆转录CDNA第一
29、链，方法同125。2284ACTIN和LGBP基因的RTPCR检测PCR反应体系1超纯水157LSMARTCDNA10LDNTP25MMOL/L25LMGCL225MMOL/L15L1010PCRBUFFER20LACTINR10MOL/L10LACTINF10MOL/L10LEXTAQ5U/L03L总体积25LACTIN基因的扩增条件94C4MIN94C30S56C40S28个循环72C1MIN72C10MINPCR反应体系2超纯水157LSMARTCDNA10L10PCRBUFFER25LMGCL225MMOL/L15LDNTP25MMOL/L20LLRT110MOL/L10LLRT210
30、MOL/L10LEXTAQ5U/L03L总体积25LLGBP基因的扩增条件94C4MIN94C30S56C40S35个循环72C1MIN72C10MIN重复RTPCR三次后，经琼脂糖凝胶电泳，并于QUANTITYONE462软件分析电泳，得到LGBP基因和ACTIN基因PCR产物量的比值，以此当作LGBP基因MRNA的相对表达量。113实验结果31总RNA提取利用上海博星公司的UNIZOL试剂盒提取得到三疣梭子蟹血细胞的总RNA，总RNA经超微量核酸蛋白测定仪测定OD260/280约为19，再经琼脂糖凝胶电泳检测证实获得的总RNA完整性和质量均较好，可进行后续研究。32全长CDNA的克隆根据同
31、源引物LGF1（5CCCGTGCATGATCTTCGA3）和LGR1（5ACTTCTGGTCGAAGGGCG3），以三疣梭子蟹的血细胞SMARTCDNA为模板，经PCR技术得到一条核酸片段，经测定这条核酸片段长度约为800BP（如图1A），利用BLAST结果表明，这条核酸片段与虾、中华绒螯蟹等其他物种的LGBP基因序列有很高的相似性，因此认定其为LGBP基因片段。利用引物3RACEADAPTOR（5GGCCACGCGTCGACTAGTACT173），以三疣梭子蟹的血细胞SMARTCDNA为模板，经巢式PCR后获得一条核酸片段如（图1B），其长度约为550BP，利用BLAST结果表明该序列与以上
32、得到的保守序列完全重叠部分达127BP，并与其他物种LGBP基因序列高度相似，被证实为三疣梭子蟹LGBP基因的3端序列。采用CLONTECH的SMARTTMRACECDNAAMPLIFICATIONKIT试剂盒进行的5RACE实验结果得到一条长度为524BP的基因序列（如图1C），利用BLAST结果显示，此序列与保守序列的完全重叠部分长为227BP，并和中国对虾、克氏原螯虾等其他物种的LGBP基因序列具有很高的相似度，从而被认定为三疣梭子蟹LGBP基因的5端序列。利用以上得到的保守序列、5端和3端序列进行拼接后，除去重叠部分序列得到了三疣梭子蟹LGBP基因的全长CDNA序列。图1三疣梭子蟹血细
33、胞LGBP的基因克隆FIG1GENECLONINGOFLGBPINHAEMOCYTESFROMPTRITUBERCULATUSMDNA分子量标准DL2000；A1保守序列扩增结果；B23RACE扩增结果；C35RACE扩增结果。MDNAMARKERDL2000AAMPLIFICATIONOFCONSERVEDSEQUENCEBAMPLIFICATIONOF3RACECAMPLIFICATIONOF5RACE33三疣梭子蟹LGBP基因序列分析12331LGBP基因及其对应氨基酸序列根据以上得到的LGBP基因的全长CDNA序列（如图2），测得该CDNA序列全长为1378BP，其中包含1095BP的
34、开放阅读框，在基因的5端含有138BP的非编码区UTR，3端含有144BP的UTR，加尾信号为AATAAA。GAGAAGCGAGAGCTCTGCTCCTCCGTCACACCACCGGTCTTATCAACGTAACGGAAAGCCTACATCTTG69TACCAATGCCACTGGTACATCACACCGTCACTACCACCTCCTCAGTGCTGCGCAGGTTATCAGGTCAAG138ATGCAGGCCGCCCTATGTGCATTACTCCTAGTCTCGGGAGCCCTCGCTGCAGACGTGCTGGATCCCGCC207MQAALCALLLVSGALAADVLDPA23TCCTGC
35、ACTGCCTTTCCTTGTCTGATCTTCGACGAGGAATTCAACTCTTTTGACCATGATACCTGGGAA276SCTAFPCLIFDEEFNSFDHDTWE46CACGAGATCACAATGTCCGGCGGTGGGAACTGGGAATTTCAAGCTTATCTCAACAACAGAAGTGTGAGC345HEITMSGGGNWEFQAYLNNRSVS69TACACCCGCGACTCCACCTTGTTCATAAAGCCGCAACTGATGAGTGATTGGAAGGGCGAGGACTTCCTG414YTRDSTLFIKPQLMSDWKGEDFL92AGCAGCGGCGAGCTC
36、AACCTGTGGGGAATGAACGGACGTGGCGATGTGTGCACCGCCAACCAGAACTAT483SSGELNLWGMNGRGDVCTANQNY115GGATGCGACCGATTCGGAGACCCAGTCAACATCATCAATCCCATCATGAGCGCCAGGCTTCGATCCCTC552GCDRFGDPVNIINPIMSARLRSL138CCGAGCTTCGCCTTCAGGTATGGACGCATTGAGGTTCGGGCCAAGATGCCACGTGGAGACTGGCTGTGG621PSFAFRYGRIEVRAKMPRGDWLW161CCGGCCGTGTGGTTGCTGCCG
37、CAATACTTCACCTACGGACTGTGGCCAGCCAGCGGTGAAATTGACATT690PAVWLLPQYFTYGLWPASGEIDI184CTGGAATCAAGGGGTAATGACGACTACGGTGACCTGAGTAACAGAAATGCCGGCACCACCCTTCACTGG759LESRGNDDYGDLSNRNAGTTLHW207GGACCCTACTGGCCTCTTAACTTCTACGAAAAGACAATGGTTGAATACACCGCCAACGACGGTTCATTC828GPYWPLNFYEKTMVEYTANDGSF230GCCGACAGCTTCCATACCTGGCGTGTA
38、GACTGGACCAGCACTGAAATTAAGGCGTATCTGGATGACGAG897ADSFHTWRVDWTSTEIKAYLDDE253CTGAAGATAACGATCGACCCGGTCACCAACTTCTGGAACTTTGCCGGCTTGGACGACTCTATTGACAAT966LKITIDPVTNFWNFAGLDDSIDN276CCTTGGACTTCAGGAAGCAAGATGGCGCCTTTTGACCAGAAGTTCTACATCGTCATTAACCTTGCTGTG1035PWTSGSKMAPFDQKFYIVINLAV299GGCGGCACCGGTGGATTCTTCCCTGACGGCAT
39、CGCTGAAAAGCCTTGGTCCAACGATTCGCCACAAGCC1104GGTGGFFPDGIAEKPWSNDSPQA322TTCCTCGACTTCTGGAACGGACGTGGGAAGTGGCTGCCCACGTGGGAACAGGGTGAGGGCAAGATCAGC1173FLDFWNGRGKWLPTWEQGEGKIS345GAGAAGGCAGCATTGCAAGCGGATTACATCAAAGTATGGAAGATGACTAGCTCCGAGGAATAAAGTAAT1242EKAALQADYIKVWKMTSSEE365GAAGAATGAGCCATGGAAGGCACGCAAAACACTGTACG
40、TTTGTGGCACATGTTTCTTTCCATACATGAT1311TGTAAAGTAAAACAAAATAAGTAATATGATCGCCTTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA1378图2三疣梭子蟹LGBP基因CDNA序列及其对应的氨基酸序列FIG2COMPLETECDNASEQUENCEANDITSDEDUCEDAMINOACIDSEQUENCEOFLGBPFROMPTRITUBERCULATUS表示翻译终止；下划线表示信号肽；阴影部分为预测的N糖基化位点；方框中的两个RGDARGGLYASP表示细胞粘附肽；13点式下划线的SAR为激酶C的磷酸化位点。THEAST
41、ERISKINDICATESTHESTOPOFCODINGANDTHEUNDERLINEDAMINOACIDSEQUENCEREPRESENTSTHESIGNALPRPTIDEPOTENTIALNGLYCOSYLATIONSTIESARESHADEDTWORGDARGGLYASPPUTATIVECELLADHESIVEPEPTIDESAREBOXEDADOTTEDLINEMARKSAPOTENTIALKINASECPHOSPHORYLATIONSITE332LGBP氨基酸序列同源性比较利用GENBANK数据库，将三疣梭子蟹LGBP基因序列与其他物种的序列进行对比发现，其与中华绒螯蟹FJ6051
42、721、中国对虾FCHINENSISAY8712671、克氏原螯虾PROCAMBARUSCLARKIIFJ4109101、细角滨对虾LITOPENAEUSSTYLIROSTRISAF4735791、凡纳滨对虾EU1022861、罗氏沼虾MACROBRACHIUMROSENBERGIIGQ2284811和淡水螯虾PLENIUSCULUSAJ2501281的氨基酸序列同源性分别为2、69、70、67、67、71、63（如图3）。PTRITUBERCULATUSCTAFPCLIFDEEFNSFDHDTWEHEITMSGGGNWEFQAYLNNRSVSYTRDSTLF77ESINENSISCTAFPC
43、LIFHDEFDFLDHDVWEHEITLSGGGNWEFHAYLNNRSVSYTRDSTLF76FCHINENSISCASFPCMIFEDNFDYLDNDIWEHEITMSGGGNWEFQAYVNNRSISYTRDSTLF78FMERGUIENSISCTSFPCMIFEDNFDYLDNDIWEHELTMSGGGNWEFQAYVNNRSISYTRDSTLF78LVANNAMEICASFPCMIFEDNFDYLDNDVWEHELTMSGGGNWEFQAYVNNRSISYTRDSTLF78LSTYLIROSTRISCASFPCMIFEDNFDYLDNDVWEHELTMSGGGNWEFQAYVNNR
44、SISYTRDSTLF88MJAPONICUSCASIACIVFQCEICPSGGGNWEFQAYVNNRSISYTRDSTLF66MROSENBERGIICTSFPCLIFNDDFDFLDHEVWEHEVTMSGGGNWEFQVYVNNRSVSYTRDSTLF76PLENIUSCULUSCSSFPCLIFNDDFNDLNRNVWKPEVTMSGGGNWEFQMYLNNPSLGYTRDSTLI76PCLARKIICTGFPCLIFNDEFDFLDHEVWEHEITMSGGGNWEFQMYINNRSISYTRDSTLF78CFARRERISGRAIPNCQSYPCLIFEDNFDTLDLDTWE
45、HEITASGGGNWEFEYYLNNRSNSYVRDGVLY240PTRITUBERCULATUSIKPQLMSDWKGEDFLSSGELNLWGMNGRGDVCTANQNYGCDRFGDPVNIINPIMSARLRS137ESINENSISIKPQLTSDWRGEAFLTSGELNVWGMNGRGSVCTSNAFYGCNRVGTATNLINPIMSARLRT136FCHINENSISIKPELTSTWKGEEFLSSGNLDLWGMNGRGDVCTGNSYYGCSRVGSSSNIVNPVLSARLRT138FMERGUIENSISIKPELTADWKGEEFLSSGNLDLWGMNGRGD
46、VCTGNSYYGCSRVGSSSNIVNPVLSARLRT138LVANNAMEIIKPELTANWKGDDFLTSGTLDLWGMNGRGDVCTGNSYYGCSRTGSSSNLVNPVLSARLRT138LSTYLIROSTRISIKPELTANWKGDDFLTSGTLDLWGMNGRGDVCTGNSYYGCSRTGSSSNLVNPVLSARLRT148MJAPONICUSIKPDLTSNWKGEEFLSSGNLDLWGMNGRGDVCTGNSYYGCSRVGSSSNIINPITSARLRT126MROSENBERGIIIRPALVSEWKDEAFLTSGNLNLWGMNGRGDVCTG
47、NSFWGCERTGTADNLINPVMSARLRT136PLENIUSCULUSIKPELTSKWYSEHFLFNDELNLGDKCTDHRDYGCVRKGTSEHIINPIMSAKFTT130PCLARKIIIRPDLTSNWQTTDFLSSGDVNLWGMNGRGDVCTGNSYYGCERVGNPVNIINPVISARLRT138CFARRERIIKPTLTTDRFGPDFLTKGTLDLWGGTPGDTCTSAQFYGCKRDGSGEHPVNPIQSARLRS299PTRITUBERCULATUSLPSFAFRYGRIEVRAKMPRGDWLWPAVWLLPQYFTYGLWPASGEI
48、DILESRGNDDYGDLS197ESINENSISLSDFAFRYGRIEVRAKMPRGDWLRPAIWMLPRYWPYGEWPASGEIDIVECRGNDRYGSIN196FCHINENSISMSNFAFRYGRIEIRAKMPRGDWLWPAIWMLPRNWPYGSWPASGEIGILESRGNDDFGTLG198FMERGUIENSISMSNFAFRYGRIEIRAKMPRGDWLWPAIWMLPRNWPYGSWPASGEIDILESRGNDDFGTLG198LVANNAMEIMSNFAFRYGRIEIRAKMPRGDWLWPAIWMLPRNWPYGAWPASGEIDILESRGN
49、DNFGTLG198LSTYLIROSTRISMSNFAFRYGRIEIRAKMPRGDWLWPAIWMLPRNWPYGAWPASGEIDILESRGNDNFGTLG208MJAPONICUSMSDFAFRYGRLEIRAKMPRGDWLWPAIWMLPRNWPYGLWPASGEIDILESRGNDDFGTLG186MROSENBERGIILSDFAFKYGRIEVRAKMPRGDWLWPAIWLLPRNWPYGAWPASGEIDIVETRGNDNYGELG196PLENIUSCULUSHPSFAFRYGRVEVRAKMPRGDWLWPAIWLMPKDSRYGGWPASGEIDIVESRGNND
