1、本科毕业设计（20_届）三疣梭子蟹球状病毒的人工感染与纯化所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言22材料和方法221材料、试剂、设备2211材料2212试剂2213仪器、耗材322方法3221蟹病毒人工感染3222病蟹组织超薄切片制作与观察3223由蟹病组织纯化病毒3224纯化病毒的负染、电镜观察43结果与分析431人工感染后三疣梭子蟹病症432病蟹组织超薄切片的电镜观察433由病蟹组织纯化病毒434病毒致病性（致死性）验证64讨论641病毒纯化方法642病毒的致病性7致谢错误未定义书签。参考文献81摘要由宁波沿海采集患病三疣梭子蟹，匀浆后过滤，制备病毒匀浆液注
2、射到健康梭子蟹中，同时设置PBS注射对照组。结果为实验组全部死亡，对照组无死亡情况。证实此前在自然感染组织中观察到的球状病毒对三疣梭子蟹具有强感染力，并且致死性较强。采用差速离心法，由患病三疣梭子蟹组织纯化病毒，对纯化的病毒进行负染、电镜下观察，结果表明获得了较纯净的病毒粒子，根据该病毒的形态、大小，此病毒疑似呼肠孤病毒。纯化的病毒感染健康梭子蟹，实验组全部死亡，证实纯化后病毒完整并且有活力，纯化方法有效。关键词三疣梭子蟹；人工感染；纯化ABTRACTSSICKPORTUNUSTRITUBERCULATUSSPECIMENSWERECOLLECTEDFROMCOASTALOFNINGBOINF
3、ECTEDTISSUESWEREHOMOGENATEDAFTERFILTERATION,THEVIRUSHOMOGENATEWASINJECTEDINTOHEALTHYCRABCONTROLCRABGROUPWASINJECTEDWITHPBSASARESULT,THEEXPERIMENTALGROUPWEREALLDIEDWHILENODEATHAPPEAREDINTHECONTROLGROUPITCONFIRMEDTHATTHESPHERICALVIRUSHASSTRONGINFECTIOUSANDLETHALEFFECTTOPTRITUBERCULATUSTHEVIRUSWEREPURI
4、FIEDFROMINFECTEDCRABTISSUESBYMULTISTEPDIFFERENTIALCENTRIFUGATIONTHEPURIFIEDVIRUSPARTICLESWERENEGATIVESTAINEDOBSERVEDUNDERELECTRONMICROSCOPT,THEREAREMANYPURIFIEDVIRUSACCORDINGTOTHESHAPEANDSIZEOFTHEVIRUS,ITWASSUSPECTEDTOREOVIRUSINFECTEDHEALTHYCRABWITHPURIFIEDVIRUS,THEEXPERIMENTALGROUPWASALLDIEDWHICHCO
5、NFIRMEDTHATPURIFIEDVIRUSWASCOMPLETEANDDYNAMIC,THEPURIFICATIONMETHODISEFFECTIVEKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUSARTIFICIALINFECTIONPURIFICATION21引言三疣梭子蟹PORTUNUSTRITUBERCULATUS隶属于甲壳纲CRUSTACEA、十足目DECAPODA、梭子蟹科PORTUNIDAE，广泛分布于我国沿海，是一种经济价值较高的大型海产经济蟹类1。三疣梭子蟹味道鲜美，营养价值极为丰富，是人们非常喜爱的水产品之一，同时也是很重要的出口品种，已逐渐成为我国海水
6、养殖的主导品种之一。浙江省沿海地区养殖业发展迅速，宁波市一带短短几年内就发展成了全国闻名的梭子蟹养殖基地。随着三疣梭子蟹养殖业的快速发展，养殖密度不断增加，养殖规模不断扩大，又因为它受到海洋环境的污染、养殖生产自身所带来的污染、养殖技术水平等多方面的原因制约，三疣梭子蟹在养殖的过程中病害问题日趋突出2。各类疾病的发病率和危害程度有逐年上升的趋势，并呈现出大规模发生和暴发性流行的趋势。由于对病原不了解而盲目用药，导致药物滥用，不但提高了水产养殖的投入产出比，危害水产养殖业者的经济利益，而且打击了消费信心，影响到出口内销，严重困扰着梭子蟹水产养殖业的健康发展3。另外由于一些虾蟹综合养殖的推广，一些
7、广宿主病毒如白斑综合症杆状病毒等也成为侵害三疣梭子蟹的病原体。三疣梭子蟹产业化人工养殖中，病害防治作为其最核心的环节，往往被养殖者所忽视，蟹类病毒性病原研究更是极其薄弱4。国内外已报道的蟹类病毒有水生呼肠孤病毒5、微核糖核酸病毒、蓝蟹疱疹病毒、蓝蟹螺旋病毒、河蟹颤抖病毒6，锯缘青蟹杆状病毒7，黄头病毒等。对蟹类病毒的研究多集中在形态观察水平上，尚未进行分子鉴定及灵敏检测方法构建8。研究发现蟹类对黄头病毒YHV具有较高的抵抗力，并不容易感染9。国内外有关三疣梭子蟹病毒研究的文献极少，对三疣梭子蟹病毒的病原和病理研究也尚不深入。其中以对虾白斑症病毒（WSSV）10研究相对透彻国内一些研究所通过实时
8、荧光定量PCR测定试验蟹体内各器官中WSSV含量,病理切片观察濒死蟹各器官组织病理改变的方法，对WSSV进行了系统的研究。近年来，梭子蟹养殖中大规模爆发性死亡现象时有发生，至今还未得到微生物学、分子生物学、免疫学的明确鉴定。此类不明病害严重威胁着我国梭子蟹蟹类养殖业。通过对奉化三疣梭子蟹发生秋季大规模死亡样品的病理观察，发现组织细胞中存在大量球状病毒。我们对人工养殖过程中的三疣梭子蟹秋季大量死亡的病样进行病毒纯化，对纯化的病毒进行形态观察，并用病毒对健康蟹进行人工感染研究，以期为三疣梭子蟹病毒病害快速诊断、防治提供理论与技术支撑。2材料和方法21材料、试剂、设备211材料患病三疣梭子蟹由奉化市
9、池养和滩涂梭子蟹养殖场采集。梭子蟹及喂养梭子蟹的缢蛏购自宁波水产批发、零售市场。212试剂TNE缓冲液50MMTRISHCL，400MMNACL，5MMEDTA，PH763TM缓冲液50MMTRISHCL，10MMMGCL2，PH76，TRIS60578G，MGCL26H2O20338G，H2O1000ML01MOL/LPBS缓冲液NACL8G，KCL02G，NA2HPO4144G，NA2HPO412H2O363G，KH2PO4024G，H2O400ML，调节PH76，补水至500ML混合蛋白酶抑制剂（PMSF）用异丙醇配成100MG/MLTRIZOL试剂购自INVITROGEN，EDTA购置
10、上海生工，青霉素，链霉素，TRISHCL，NACL，EDTA，MGCL2，25戊二醛，1锇酸，酒精，苯甲酸二丙烯醋，醋酸双氧铀一柠檬酸铅，3磷钨酸钾（PTA）。213仪器、耗材高速离心机（BECKMANAVANTIJE由美国贝克曼库尔特公司制造），低速离心机（D37520DSTERODE德国THERMO），超低温冰箱（THERMO991），匀浆机（PT1600EPOLYTRONMADEINSWITZERLANDBYKENEMATICA/G），过滤器（AP01PVACUUMPUMP天津奥特赛思斯仪器有限公司），精密电子天平（JA12002上海恒平科学仪器有限公司），超薄切片机RMCPOWERTO
11、MEXL、透射电子显微镜（日立H7650），045UM、022UM滤膜，滤纸，冰箱，针式滤头，冰盒，注射针，剪刀，移液枪，覆有FORMVAR膜的铜网。22方法221蟹病毒人工感染取病蟹组织进行匀浆；匀浆液在4下，6000G离心10MIN；沉淀用少量PBS重新悬浮后再次离心；合并上清，经045UM、022UM滤膜先后抽滤除杂；用022UM针式滤器滤头过滤除菌后按1000IU/ML加入青霉素和链霉素；插入冰盒，放4病箱过夜，即为攻毒用病毒悬液。将梭子蟹随机分为实验组和对照组，每组四只蟹，对照组注射生理盐水，实验组每只由第四步足基部注射02ML病毒液并且每日投喂缢蛏，换水，观察死亡情况。222病蟹组
12、织超薄切片制作与观察取人工感染发病的病蟹的鳃、胃和肠组织，切成MM3的小块,按常规方法经25戊二醛和1锇酸双固定,浓度梯度酒精脱水，苯甲酸二丙烯醋包埋，聚合。于切片机上制备超薄切片。经醋酸双氧铀一柠檬酸铅双染色，在日立S3400N电镜下观察、拍照并分析。223由蟹病组织纯化病毒取病蟹腮和肌肉，快速剪成碎块，加200ML预先冰浴过的TNE缓冲液（50MMTRISHCL，400MMNACL，5MMEDTA，PH76）；0充分匀浆；缓冲液中添加了1X的混合蛋白酶抑制剂（1MMPMSF）6。4下6000G离心10MIN，收集上清，沉淀用TNE重悬，匀浆1MIN,6000G离心10MIN合并上清。800
13、0G，4离心20MIN,取上清。4下35000G离心15H，弃部分上清液，将沉淀的上层疏松部分用上清洗掉。下层结实的略带白色的部分重悬于1ML的TM缓冲液（50MMTRISHCL，10MMMGCL2，PH75）中。TM缓冲液中添加了1MMPMSF。冰浴过夜。4下3500G离心5MIN，去除沉淀。上清在4下38000G离心15H。将沉淀的上层疏松部分用TM缓冲液冲洗掉。下层结实的白色的部分即纯化的病毒粒子。取少4量病毒固定于100UL25的戊二醛中。224病毒纯化后的负染以及电镜观察取蟹病组织纯化后的病毒悬液，滴一滴此病毒悬液在载玻片上，把覆有FORMVAR膜的铜网反扣在病毒悬液上，20MIN后
14、，取下铜网，然后晾干。在病毒悬液中滴加的3磷钨酸钾（PTA）负染5MIN，用滤纸吸去多余的染液，室温下风干，在日立H7650透射电子显微镜下观察。3结果与分析31人工感染后三疣梭子蟹病症实验组梭子蟹攻毒后全部发病，病蟹临死前呈现活力差、四肢无力、肌肉颤抖、食欲差、行动迟缓。腮丝呈黑化趋势，肝脏部位稍呈红色，部分步足变红，个别可见肌肉浑浊，其他脏器肉眼观察无明显异常。上述症状出现后很快死亡，死亡率100。对照组梭子蟹没有出现死亡情况。32病蟹组织超薄切片的电镜观察将三疣梭子蟹的组织进行超薄切片，在电镜下可以观察到在切片中有明显的病毒粒子的存在。各组织、器官包括腮、肠、肌肉、心脏、肝胰腺、性腺均有
15、感染，其中肠、肌肉、心脏感染严重，存在大量病毒，病毒核心直径约20NM。感染情况及病毒粒子形态与自然感染一致。图1人工感染健康三疣梭子蟹超薄组织切片的电镜观察图片FIG1ELECTRONMICROGRAPHPICTUREOFVIRALPARTICLESFROMVARIOUSTISSUEOFINFECTEDHEALTHCRABS33由病蟹组织纯化病毒将患病三疣梭子蟹组织匀浆后经过两次差速离心，从患病三疣梭子蟹的组织，主要是内5脏中提取纯化得到了大量病毒，经过电镜负染后可以观察到大量的病毒粒子，且纯度较高。成熟病毒粒子直径约为60120NM，病毒呈球形。图2A图2B图2C图2D6图2E图2F图2纯
16、化的病毒粒子的负染电镜照片FIG2PURIFIEDVIRALPARTICLESNEGATIVESTAIN34病毒致病性（致死性）验证在人工感染实验中，我们用纯化的病毒对三疣梭子蟹进行注射感染，同时设立对照组，每组四只蟹，在感染发病的周期内，三疣梭子蟹全部死亡，且死亡率高达100，对照组没有出现死亡情况。与养殖业中该病爆发时蟹群大量快速死亡现象相符，实验结果表明，该病毒对三疣梭子蟹具有致病性，且致死率极高。应该引起水产养殖业的重视。4讨论41病毒纯化方法为了研究病毒的本质并对病毒性疾病进行诊断，必须对病毒颗粒的物理化学性质和病毒遗传物质的结构进行研究，需要高度纯净的病毒制品并且获得一定量纯病毒颗
17、粒11。因而当前迫切任务之一仍是进一步改进病毒提纯技术。目前，从感染动物组织内纯化病毒的方法，主要有离心法、沉淀法和透析法等，其中超速离心法是应用最为广泛的一种纯化病毒的方法12。超速离心法可分为平衡密度梯度离心法和等密度梯度离心法，较常使用的梯度材料有甘油、氯化铯、蔗糖和重水等。氯化铯13主要用于平衡密度梯度离心法，其成本很高、价格较贵；蔗糖用于等密度梯度离心法，因为它溶于水，对蛋白质和核酸无不良影响，应用相对来说更为普遍。密度梯度离心法14虽然是一种常用的病毒纯化方法，但是它的缺点是操作复杂并且成本较高。差速离心是利用了不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过
18、不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。病毒纯化时离心力的选择通常是根据病毒大小、密度来确定的，对于中、大型病毒，在8O000G离心60MIN，即能沉淀15。利用差速离心法提纯各种大小的颗粒和病毒是一种有效的手段。在纯化病毒的工作中，我们必须根据需要分离的病毒的特点，选择适宜的纯化方法。我们从对三疣梭子蟹分离纯化的这种球状病毒的研究结果表明，该病毒个体较小，一般的高速离心较难获得纯净病毒。通过参考文献1617，我们设计了纯化流程。在实验中发现，经过多次低速离心时去除大部分的组织碎片后，通过调整病毒纯化缓冲液中盐离子浓度，可以促进病毒的沉降。同时在第一次高速离心后
19、及时更换较低盐离子浓度的缓冲液，可以更好的保护裸露的病毒粒子，尽量保持病毒粒子的完整性。通过上述方法获得了较好的病毒纯化效果电镜下观察病毒较纯净、结构完整；用纯化的病毒对健康蟹进行人工感染，致死率高。用纯化的病毒进行核酸分析发现其为RNA病毒，基因组分节，为呼肠孤病毒，这进一步表明纯化获得成功，这也是在国内外首次在三疣梭子蟹中发现呼肠孤病毒（另文发表）。虽然从核酸分析其为呼肠孤病毒，但形态上该病毒与以往报导的呼肠孤科病毒有较大差异，可能是新病毒。742病毒的致病性在人工感染试验中，对照组未出现死亡。病毒注射感染组，所有个体均成功感染，出现食欲减退甚至停食、反应迟缓等症状，且在感染后全部死亡，这
20、与自然状况下发病死亡的三疣梭子蟹的情况一致。通过对人工感染实验的结果分析发现，此球状病毒为三疣梭子蟹发病死亡的病原，而且这种病毒对三疣梭子蟹有很强的致死性，三疣梭子蟹一旦感染这种病毒，经过短暂的潜伏期后，快速死亡。由于这种疾病具有潜伏期短，发病快等特点，使得在该病的防治过程中存在一定的难度。对感染濒死个体三疣梭子蟹的组织病理观察可见，病蟹肝胰腺、肌肉、鳃组织的靶细胞核肿大、变形，并出现以坏死为主的病变，电镜下可在濒死蟹的肝胰腺、肌肉等组织细胞中观察到大量病毒粒子。成熟病毒粒子直径约为60120NM，病毒呈球形。呼肠孤病毒是蟹类病毒中常见的一种病毒。呼肠孤病毒在锯缘青蟹、中华绒螯蟹以及河蟹中曾被
21、报道1820。WENG等18报道了一种新的锯缘青蟹病毒性疾病“睡眠病SLEEPINGDISEASE”，病蟹的典型特征是肝胰腺萎缩。2004年511月该病在东南沿海福建省和广东省广泛流行，致螃蟹的死亡率非常高在养殖塘中青蟹死亡率接近70。WENG等通过一系列的实验证实青蟹类呼肠孤病毒是“睡眠病”发生的主要病原。该病毒在病蟹的心脏、鳃、肝胰腺和肠细胞等组织中广泛分布，且在细胞浆中分散分布或呈晶格状排列。贡成良19等在对江苏等地的患颤抖病的中华绒螯蟹进行研究后发现，该病的病原为一种球状病毒，大小约为55NM。经核酸电泳后证实该病毒为呼肠孤病毒。陈吉刚20等在对浙江省三门县等地区患病锯缘青蟹的组织电镜
22、切片观察中发现大量的呼肠孤病毒，该病毒粒子的大小为60NM左右，二十面体对称，无囊膜。我们的研究发现，此次三疣梭子蟹中所纯化得到的病毒在大小和形态等方面与已报道的蟹中感染的呼肠孤病毒均类似。在其后对该病毒进行的进一步研究结果证实了该病毒确实为呼肠孤病毒（另文阐述）。此次对三疣梭子蟹病害的研究结果表明，呼肠孤病毒正是浙江地区三疣梭子蟹爆发性死亡的致病原，这在国内外的三疣梭子蟹病害研究报道中尚属首次。8参考文献1丁朋晓,张连英养殖蟹类病害的研究进展M畜牧与饲料科学,20103133352MOMOYAMAK，HIRAOKAM，VENEGAS,ETALPATHOGENICITYOFPENAEIDROD
23、SHAPEDDNAVIRUSPRDVTOJUVENILESOFSIXCRUSTACEANSPECIESC4SYMPONDISEASESINASIANAQUACULTUREDAAIV，CEBUCITYPHILIPPINES19991122263阎斌伦,梁利国,张晓君三疣梭子蟹主要病害研究进展J水产科技情报,2010129374肖国华，赵春龙，崔兆进三疣梭子蟹人工育苗及养成病害发生的主要原因及防治方法J齐鲁渔业，2006，23336375方勤，朱作言水生呼肠孤病毒研究进展M中国病毒学，2003（18）82866孙学强,陆承平河蟹颤抖病病毒的分离纯化及其动物致病性试验M中国病毒学,200217185
24、1887陈吉刚,杨季芳,王海丽,等养殖锯缘青蟹呼肠孤样病毒粒子的电镜观察J海洋学研究,20082617228阎斌伦，梁利国，张晓君三疣梭子蟹主要病害研究进展J水产科技情报，2010129379LONGYANTS,SATTAMANS,CHAIVISUTHANGKURAP,ETALEXPERIMENTALINFECTIONOFSOMEPENAEIDSHRIMPSANDCRABSBYYELLOWHEADVIRUSYHVJSCIENCEDIRECTAQUACULTURE,200626839110ZHANWB,ZHANGLF,WANGYH,ETALWHITESPOTSYNDROMEVIRUSWSSVIN
25、FECTIONTOCRABSJACTASCIENTIARUMNATURALIUMUNIVERSITATISSUNYATSENI,20003915415811严隽骐虾池中蟹病毒的研究M水产科学,1995（5）141512薛清刚,宫云浩,王文兴中国对虾肝胰腺细小病毒的纯化与鉴定J海洋与湖沼,199627555713石拓,孔杰,包振民从中国对虾分离纯化的一种杆状病毒及其超微结构的研究J海洋学报,19982252814黄剑南,林蠡,翁少萍,等赤点石斑鱼诺达病毒的纯化及其衣壳蛋白的WESTERNBLOT分析M南方水产,20051232815沈辉,万夕和,王李宝一种文蛤球形病毒分离纯化的初步研究M江苏农业
26、科学,2006633634016孙磊,王维娜,郭明申,等对虾一种杆状病毒的分离纯化及超微结构J河北大学学报,20042423423817汪包扳,民邵匀中国对虾PENAEUSCHINENSIS的白点综合征病毒WSSV的提纯和核酸提取M海洋与湖沼,20003511512018WENGSP,GUOZX,SUNJJ,ETALAREOVIRUSDISEASEINCULTUREDMUDCRAB,SCYLLASERRATA,INSOUTHERNCHINAJJFISHDIS,2007，30313313919贡成良,薛仁宇,曹广力,等中华绒螯蟹呼肠孤病毒样病毒病研究M中国病毒学,20001539539920陈吉刚,杨季芳,王海丽,等养殖锯缘青蟹呼肠孤样病毒粒子的电镜观察M海洋学研究,2008239396
