1、本科毕业设计（20_届）三疣梭子蟹蜕皮周期中MIH表达研究所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录三疣梭子蟹蜕皮周期中MIH基因的表达错误未定义书签。引言41材料与方法711材料712主要试剂713方法7131总RNA提取7132第一链CDNA合成7134荧光定量PCR72结果83讨论1231MIH的作用及其作用机制1232影响三疣梭子蟹蜕皮的各种因素研究13321激素13322能量13323其他因素144总结14致谢错误未定义书签。参考文献153摘要在本次研究中，以实时荧光定量PCR技术（QUANTITATIVEREALTIMEPCR,QRTPCR）相对定量2CT方法
2、，对MIH基因表达出的MRNA进行检测。实验结果表明，随三疣梭子蟹蜕皮周期进行，蜕皮周期中MIH表达水平变化呈一个明确变化的趋势，从蜕后A期MIH表达量开始上升，直到蜕皮C期达到顶峰，然后慢慢下降到蜕前D3/D4期达到最低，完成一个蜕皮过程，然后进入下一个蜕皮周期。其中以蜕皮周期中的蜕前D0期为对照，采用2CT方法计算另外各个蜕皮时期MIH基因MRNA的相对表达量。2CT结果表示，MIH基因在蜕皮周期中的表达情况，相对对照组蜕前D0期表达量，蜕后A期为042008倍，蜕后B期为109009倍，蜕皮C期为135016倍，蜕前D1期078007倍，蜕前D2期为027008倍，蜕前D3/4期为020
3、004倍。三疣梭子蟹蜕皮周期中MIH基因表达量的变化差异用SPSS软件130中的DENNETT检验法进行分析，蜕皮周期中各个时期的MIH的表达量在P005存在显著性差异的。结果表明，MIH基因的表达水平变化直接影响甲壳动物蜕皮过程的发生与进行关键字三疣梭子蟹；蜕皮；MIH；实时荧光定量PCRABSTRACTTHEMETHODFORTHEDETERMINATIONOFTHEEXPRESSIONLEVELSOFMOLTINHIBITINGHORMONEMRNAINCRUSTACEANSPORTUNUSTRITUBERCULATUS,HASBEENDEVELOPEDUSINGRELATIVEQUAN
4、TIFICATIONOFQUANTITATIVEREALTIMEPCR（QRTPCR）ANDWEWILLUSE2CTMETHODTOANALYZETHEEXPRESSIONOFTHEMRNAOFMIHTHEEXPERIMENTALRESULTSINDICATEDTHATTHEEXPRESSIONLEVELSOFMIHCHANGEDCLEARTENDENCYWITHTHEMOLTCYCLEOFPORTUNUSTRITUBERCULATUSPROGRESSED,MIHTRANSCRIPTSINCREASEDINPOSTMOLTA,ACHIEVEDTHECRESTUNTILINTERMOLTPERI
5、ODC,THENDROPPEDSLOWLYBEFOREPREMOLTD3/D4ACHIEVEDLOWESTLEVELS,COMPLETEDMOLTCYCLE,AFTERENTEREDTHENEXTMOLTCYCLEASTHECONTROLGROUPD0,RELATIVEQUANTIFICATIONRESULTSUSING2CTMETHODTOANALYZETHEEXPRESSIONLEVELSOFMOLTINHIBITINGHORMONEMRNADURINGAMOLTCYCLE,SHOWEDTHATMIHTRANSCRIPTSDOWNREGULATED042008FOLDINA,INCREAS
6、ED109009FOLDINB,INCREASED135016FOLDINC,DOWNREGULATED078007FOLDIND1,DOWNREGULATED027008FOLDIND2,DOWNREGULATED020004FOLDIND3/4MOLTINHIBITINGHORMONEMRNAEXPRESSIONSIGNIFICANTDIFFERENCESDURINGTHEMOLTCYCLEOFTHEPORTUNUSTRITUBERCULATUS,ANALYZEDBYDENNETTOFSPSS130SOFTWAREMIHTRANSCRIPTSOFEACHMOLTINGSTAGEWERESI
7、GNIFICANTLYP005INTHEMOLTCYCLETHERESEARCHRESULTSINDICATEDTHATMIHEXPRESSIONLEVELSCHANGESMAYBEINVOLVEDINTHEMOLTCYCLEOFCRUSTACEANSIMMEDIATELYKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUSMOLTMIHQRTPCR4引言三疣梭子蟹隶属于软甲纲，是中国沿海重要的大型海产经济蟹类，近年来三疣梭子蟹人工育苗与养成的研究及实践得到了较快的发展，但是仍旧面临着存活率低（平均养殖成活率5），病害频发，养殖产量低，产品品质不高等问题。其中当年性早熟现象的危害尤其
8、严重，以这种蟹种养殖商品蟹，死亡率高达6090，从而导致养殖规格下降，效率低下1等问题。因此研究甲壳动物蜕皮周期的机制就显得尤为重要，直接影响着养殖区域的产量。在甲壳动物个体发育过程中，存在蜕皮现象，即蜕去旧的外骨骼并长出新的外骨骼的过程。蜕皮是甲壳动物生长和发育的标志特征，它贯穿甲壳动物个体发育的始终，它受神经系统和内分泌系统共同调节2。根据游泳足趾节末端新旧表皮基线间距与旧表皮厚度的比值（R值）结合甲壳硬度、解剖后新壳的生长状况、蜕皮缝的开裂状况等形态学特征对三疣梭子蟹蜕皮周期进行了划分，将蜕皮前期细分为D0、D1、D2、D3和D4五个亚期。R趾节新旧表皮基线间距（D）/旧表皮厚度（C）从
9、表1中可以看出，蜕皮可以分为蜕壳前PROEEDYSISSTAGE，即D期，D0D4、蜕壳期MOLTSTAGE，即E期、软壳期SOFTSHELLEDSTAGE，即A期、薄壳期PAPERSHELLSTAGE，即B期、硬壳期HARDSTAGE，即C期，C1C45个时相3。表1三疣梭子蟹蜕皮周期分期特征描述TAB1DESCRIPTIONOFMOLTSTAGESOFPORTUNUSTRITUBERCULATUS时期PERIOD阶段STAGE甲壳硬度CARAPACERIGIDITY表皮厚度（MM）CUTICLETHICKNESSRD/C解剖后新壳的生长情况GROWTHOFTHENEWCARAPACEAFT
10、ERDISSECTION蜕皮后期蜕皮间期蜕皮前期A期B期C期D0亚期D1亚期D2亚期各个部位非常柔软，体内充满水，可随意弯曲背甲边缘变硬，腮区，心区稍软，水分减少，表面粗糙身体各部位均变硬身体各部位变硬身体各部位很硬身体各部位很1020203535450R0404R065065R09无无无开始分泌，但不成形呈很薄的膜状粘附于旧壳上膜状新壳变厚，仍粘5蜕皮期D3亚期D4亚期E期硬头胸甲腹面和螯足长节背面蜕皮缝裂开，均呈一小缝头胸甲腹面和螯足长节背面蜕皮缝进一步裂开头胸甲腹面和螯足长节背面蜕皮缝完全裂开，新壳柔软清晰可见R1R1R106002附于旧壳上基本分泌完成，新壳边缘处仍粘附于旧壳上，中间部
11、分脱离旧壳分泌完成，可完全脱离旧壳，开始吸水。新壳与旧壳分离，在隆起的旧壳下，新壳清晰可见，进一步吸水。甲壳动物的蜕皮过程是由众多激素拮抗控制的，这一点已经被大量的研究所证明，而这些激素大部分属于一种被称作为CHH（甲壳动物增血糖激素）家族的蛋白家族。研究表明在甲壳动物的眼柄中分泌着各种各样的神经内激素1，他们中的大部分是在X器官中合成的并且运送到鼻窦腺，在那里他们释放到血淋巴之中。其中的神经内激素，包括甲壳动物增血糖激素（CHH），蜕皮抑制激素（MIH），卵黄生成抑制激素（VIH）和颚器官抑制激素（MOIH），他们彼此都是十分相似的，因而组成了一个被称为CHH家族的蛋白质家族45。CHH家族
12、中蛋白有着大致相同的蛋白质序列，形成了3个稳定的二硫键保守的6个半胱氨酸残基，拥有着大概7278个氨基酸残基的相似数量，并且他们分子的重量都处在70009500DA之间。因此，有科学家认为他们是从同一个祖先基因进化而来6。目前国内外对于这类激素的研究主要在基因的获得以及表达方面，很少能够把基因的表达与蜕皮的周期变化联系起来，目前已经得到了美洲黄道蟹（CANCERMAGISTER）、可口美青蟹（CALLINECTESSAPIDUS）、三叶真蟹（CARCINUSMAENAS）、斑纹蟳（CHARYBDISFERIATUS）、日本对虾（MARSUPENAEUSJAPONICAS）、刀额新对虾（META
13、PENAEUSENSIS）、中国对虾（FENNROPENAEUSCHINENS）和锯缘青蟹（SCYLLASERRATA）、三疣梭子蟹等（PORTUNUSTRITUBERCULATUS）MIH基因78的CDNA全长序列。其中，对于以三疣梭子蟹为代表的甲壳动物中，蜕皮的过程中由MIH基因编码的蜕皮抑制激素起着十分重要的作用。但是，目前很少有研究MIH基因与蜕皮周期变化之间的关系，在红陆蟹（GECARCINUSLATERALIS）的研究中表明，经原核表达的MIH蛋白能对蜕皮过程产生抑制作用，从而对其蜕皮调控产生影响9。有研究者以NORTHERNBOLT的方法对可口美青蟹蜕皮周期中MIHMRNA水平变
14、化进行了测定分析，发现在蜕皮前期MIH的MRNA水平逐渐降低，蜕皮以后MIH的水平突然升高，在蜕皮期间持续升高，这在MRNA水平证实了MIH的生理功能10。MIH的靶器官是Y器官，新产生的MIH通过抑制已形成的Y器官的6合成和分泌蜕皮激素，起到抑制蜕皮的作用11。MIH通过和受体结合，激活了位于细胞膜上的腺甘酸环化酶而提高细胞内CAMP水平，或是激活了位于细胞膜上的鸟甘酸环化酶而升高细胞内CGMP水平，CAMP或是CGMP进而激活蜕皮激素生成途径上的一种起重要负调控作用的激酶，进而抑制Y器官蜕皮酮的合成，使甲壳动物体内蜕皮激素保持在较低水平12。MIH基因有6个半胱氨酸残基在严格的保守区域存在
15、（图1），有这6个半胱氨酸（CYS7CYS44，CYS24CYS40和CYS27CYS53）组成的二硫键对于维持其分子结构起着十分重要的作用13。其他的存在于MIH及MIH类似片段的一些保守的残基基本上分布在12，13，19，20，48，56，59，61，62，69，72，73和76位处。对于MIH基因而言，其N末端比C末端显得更加保守，C末端一般被修饰或自由存在，而N末端经常是游离的。一般情况下，对于MIH基因的检测，我们通常采用CDNA序列分析的方法，而已知的一些CHH家族的序列也能够给予我们一些关于MIH基因序列的借鉴，但是最近的研究证明关于MIH分子的一些特征在CHH家族的分子中也有所
16、体现。通过对于MIH基因的CDNA序列进行分析研究表明，发现CDNA包含210BP的5端非编码区、342BP的编码区和1020BP的3端非编码区。图1多种MIH基因的生物信息学比对FIG1BIOINFORMATICSCOMPARISONOFVARIOUSMIHGENES注6个半胱氨酸残基已经用标出，通过对CHFMIH，MEEMIHA，MEEMIHB，PEMMIH1，PEMMIH2，PEMSGPC1，PEMSGPC2，LIVEMIH1,和LIVMIH2的分析，内含子的部分已经用标出。3端非编码区包含一个保守的加尾信号（AATAAA），距离下游的POLYA12BP。编码区序列编码113个氨基酸，包
17、括35个氨基酸组成的信号肽和78个氨基酸组成的成熟肽8。7MIH基因的序列，目前在国内外已经被研究的比较清楚，朱冬发等通过CDNA的克隆与序列分析等方法对其进行了比较系统的研究8。虽然如此，但是很少有人去研究MIH在蜕皮周期中各个分期时的分泌情况，因此本次试验拟以此为研究目标，希望能够为以后的研究者提供借鉴，并对于甲壳动物在蜕皮周期中可能出现的一些症状进行判断。1材料与方法11材料从海里捕捞新鲜的三疣梭子蟹，暂养于宁海得水育苗场。根据DRACH和TCHERNIGOVTZEFF（1967）划分把蜕皮周期标准为蜕壳前期（PROEEDYSISSTAGE，即D期，D0D4）、蜕壳期（MOLTSTAGE
18、，即E期）、软壳期（SOFTSHELLEDSTAGE，即A期）、薄壳期（PAPERSHELLSTAGE，即B期）、硬壳期（HARDSTAGE，即C期，C1C4）5个时相，选取生长旺盛体重在4080G之间，头胸甲宽为812CM之间的三疣梭子蟹，采集蜕皮周期中各个时期的眼柄X器窦腺复合体，迅速保存于液氮中。12主要试剂DEPC（RNASEFREE），TRIZOL，购自SANGON公司加拿大；引物合成由上海英骏生物技术有限公司（INVITROGEN）完成；DNASEI（RNASEFREE），PRIMESCRIPTRTREAGENTKIT，SYBRPREMIXEXTAQII，试剂盒均购自TAKARA公
19、司（日本）。13方法131总RNA提取按TRIZOL试剂说明书提取相同时期8个X器窦腺复合体TOTALRNA，TOTALRNA经1琼脂糖凝胶电泳检测完整性，紫外分光光度计进行纯度分析。提取TOTALRNA后，再使用DNASEI分解混入的基因组DNA，最后进行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等纯化TOTALRNA。132第一链CDNA合成每个TOTALRNA样品取10G，5PRIMESCRIPTBUFFER2L，PRIMESCRIPTRTENZYMEMIXI05L，OLIGO（DT）PRIMER（50MOL/L）05L，RANDOM6MERS（100MOL/L）05L，RNASEFREEDH2O，补足1
20、0L。具体操作参照PRIMESCRIPTRTREAGENTKIT说明书。表2内参基因与目的基因的引物序列TABLE2PRIMERSEQUENCESFORINTERNALCONTROLGENESANDTARGETEDGENES基因GENE引物序列PRIMERSEQUENCEA18SRRNA5TTGGTGGAGCGATTTGTCTGG35AGAAGAAGCTGCGAACTGGAC3预期扩增片段长度为350BPMIH5GACGCTTTTCAGATCCGGCC35GCCTGTGCCAGTCGTCAGAGG3预期扩增片段长度为110BP注A产物大小BPNOTEAPRODUCTSIZEBP134荧光定量P
21、CR荧光定量PCR在MASTERCYCLEREPREALPLEXREALTIMEPCREPPENDORF上完成，25LPCR8的反应体系包括SYBRPREMIXEXTAQII2缓冲液125L，正向和反向引物10MOL/L各05L（参见表2）。CDNA模板1L，DH2O105L。程序采用三步法为9530S（1个循环），随后进行40个循环，每一循环包括，955S，5530S，6830S。PCR结束后对扩增产物进行熔解曲线分析，以确保特异性扩增，条件是9530S，55S，9515S（1个循环）从55上升到95的过程耗时20MIN。135相对定量相对定量采用2CT方法，CT（CT目的基因CT管家基因）
22、实验组（CT目的基因CT管家基因）对照组，计算实验组目的基因的相对表达量。本实验研究三疣梭子蟹蜕皮周期中MIH表达变化，18SRRNA用于内参基因。为保证荧光定量PCR结果的准确性，每一个样品重复分析3次，包括目标基因（MIH）和内参基因（18SRRNA）。荧光定量的结果采用仪器自带程序读取，三疣梭子蟹蜕皮周期中MIH基因表达的变化差异用SPSS软件（130）中的DUNNETT检验法进行分析，以P005为显著性差异，试验结果均以平均值标准差（MSD）的形式表示。2结果以三疣梭子蟹蜕皮周期中各个时期的X器窦腺复合体为材料提取总RNA，在本次实验中我们进行GENOMICDNA污染的去除，因为此方法
23、可以有效的获得MIH基因的总RNA，并且可以通过反转录合成CDNA，部分总RNA提取后的电泳结果见图2。通过这种方法，我们获得的总RNA浓度为3001000NG/L，它在260NM和280NM处得吸光值的比值为180205。图2提取RNA的琼脂糖凝胶电泳分析FIG2AGAROSEGELELECTROPHORESISANALYSISOFMRNA9提取的总RNA经反转录合成的CDNA第一链直接用做荧光定量RTPCR的模板，进行RTPCR反应（图3），结果显示，内参基因达到所需荧光阈值的CT值远远小于MIH基因所需的CT值。因此可知，在三疣梭子蟹整个蜕皮周期中MIH基因的表达有着显著的变化，相比较于
24、内参基因更是有着显著的差异。对于得到的结果进行溶解曲线分析，发现MIH基因与18S内参基因有着显著差异的两个峰（图4），内参基因在前，MIH基因在后，两者达到峰值所需的温度不同，内参基因达到最高点的问题约为8401，而MIH基因到达最高点的温度约为86701。两者的峰值均比较显著，表示通过RTPCR得到的产物纯度比较高，没有引物二聚体和其它非特异扩增产物的干扰，因此实验结果比较理想。在电泳条件下对于得到的产物进行验证，得到的MIH的条带约为370BP，18SRNA内参条带为110BP，均在可接受范围之内，符合预期目标，同时又一次验证，得到的两个片段纯度较高（图5）。CYCLE403938373
25、635343332313029282726252423222120191817161514131211109876543210FLUORESCENCENORM4400420040003800360034003200300028002600240022002000180016001400120010008006004002000THRESHOLD75NOISEBANDBASELINESETTINGSAUTOMATIC,DRIFTCORRECTIONOFF图3对于MIH和18S内参基因进行RTPCR分析，二者的表达量显著差异。FIG3THERTPCRANALYSISOFMIHAND18SREFER
26、ENCEGENEWHICHHASASIGNIFICANTDIFFERENCE其中以蜕皮周期中的蜕前D0期为对照，采用2CT方法计算各个蜕皮时期MIH基因MRNA的相对表达量。QRTPCR实验表明（图3），三疣梭子蟹蜕皮周期中各个时期MIH基因MRNA表达量差异性显著（P005），在整个蜕皮阶段MIH基因MRNA的变化趋势还是比较明显的，随着蜕皮行为的接近，MIH基因MRNA表达量有所波动，但是整体上还是基本处于逐渐降低的趋势，蜕皮行为结束后MIH基因MRNA表达量逐渐升高到蜕皮C期达到顶峰，然后又慢慢下降开始新一轮的蜕皮行为（图6）。10TEMPERATURE癈9492908886848280
27、787674727068666462605856DI/DT100908070605040302010010THRESHOLD33图4REALTIMEPCR实验结果溶解曲线分析FIG4RTPCRMELTINGCURVEANALYSISOFEXPERIMENTALRESULTS图5对于产物进行电泳条件下验证FIG5AUTHENTICATIONOFPRODUCTONTHECONDITIONSOFTHEELECTROPHORESIS11005115225蜕后A期蜕后B期蜕皮C期蜕前DO期蜕前D1期蜕前D2期蜕前D3/D4期MIH基因MRNA相对表达量RELATIVEEXPRESSIONOFMIHMRN
28、A图6实时荧光定量PCR分析研究三疣梭子蟹蜕皮周期中MIH基因MRNA表达变化FIG6QRTPCRANALYSISOFMOLTCYCLEPORTUNUSMIHGENEMRNAEXPRESSION本实验应用荧光定量PCR技术研究三疣梭子蟹蜕皮周期中MIH基因MRNA表达变化经过统计学分析，差异性较为显著，结果符合要求（表3）。与KARAJLEE等（1998）用NORTHENBLOT方法对可口美青蟹蜕皮周期中MIHMRNA水平变化进行测定的方法所得出的结论，从蜕皮周期MIHMRNA水平变化并没有很大的差异，基本规律还是一致的。12表3三疣梭子蟹蜕皮周期中各个时期MIH基因MRNA表达量差异性显著，
29、蜕前D0期为对照组。TABLE3MOLTINHIBITINGHORMONEMRNAEXPRESSIONSIGNIFICANTDIFFERENCESDURINGTHEMOLTCYCLEOFTHEPORTUNUSTRITUBERCULATUS,THECONTROLGROUPD03讨论31MIH的作用及其作用机制经过试验中观察到的结果可知，在蜕皮周期中，其进程的变化中一直伴随着MIH基因表达量的波动。在进入蜕前D0期后，MIH基因的表达逐步的降低，蜕皮行为结束后MIH基因RNA的表达量逐步的升高，直到蜕皮C期达到顶峰。这说明了，蜕皮抑制激素对于甲壳动物的蜕皮有着明显的调节作用的，在蜕皮周期中，MIH
30、MRNA水平在蜕皮前期稳定下降，达到一个最小值后，在蜕皮后期上升，在蜕皮间期一直保持上升水平，正好与血淋巴中蜕皮激素的水平成负相关14。国内外相关方面的研究中曾经证明，切除眼柄可缩短蜕皮间期，促进蜕皮，从而推测眼柄中存在某种蜕皮抑制因子，随后其他人发现切除眼柄不仅可以促进蜕皮，还可产生其他一系列显著的生理变化。OKUMURA等对日本囊对虾（KURUMAPRAWN）的研究发现，通过在虾蜕皮间期注射具有生物活性的重组MIH蛋白，日本囊对虾的蜕皮C期由（9004）D延长到（9505）D，而且血淋巴中蜕皮激素的含量从（194109）NG下降到（128039）NG。这一结果表明，MIH基因表达过量可以延
31、长日本囊对虾的蜕皮间期并且抑制Y器蜕皮激素的分泌，从而对日本囊对虾的蜕皮周期调控并产生抑制作用15。MIH控制甲壳动物的蜕皮，在蜕皮间期血淋巴中高水平的MIH抑制Y器官的蜕皮酮的合成和释放，因此，MIH在蜕皮周期的多数时间内抑制Y器官的活动只有当MIH的分泌量减少或停止时蜕皮现象才会发生。MIH能抑制甲壳动物蜕皮是由于它能显著抑制Y器官分泌蜕皮激素体外培养试验结果充分证明了这一点将眼柄抽提物加人体外培养Y器官的培养液中，Y器官的分泌功能大大降低16。一般认为MIH的受体主要有两种可能一种认为受体是鸟甘酸环化酶，而另一种是G蛋白偶联受体。组织表达研究表明CSGCYO1在Y器以及其他组织中都有所表
32、达，因此认为这种CDNA编码MIH受体，将抗CSGCYO1的抗体结合到Y器的膜蛋白上，表明各个时期MOLTCYCLENALPHA005123456DUNCAN2蜕前D3/4期91989蜕前D2期92789蜕后A期94256蜕前D1期97833蜕前D0期910044蜕后B期910944蜕皮C期913533显著性0761000100010001000100013CSGCYO1的免疫学活性严格位于细胞外围区域，而并没有出现在细胞质或是在核内，这就表明CSGCYO1是一个膜关联蛋白。而受过抗体处理的Y器中，MIH对于蜕皮的抑制作用受到抑制；而且，利用实时定量PCR对CSGCYO1的含量进行测定，发现其
33、在蜕皮间期含量上升，而进入蜕皮前期含量下降。这些结果也表明CSGCYO1即为MIH受体17。而有些研究者却认为G蛋白偶联受体是MIH的受体，HAN等通过对普通滨蟹的研究发现，Y器中蛋白质的分泌受G蛋白偶联受体的调控；用霍乱毒素活化G蛋白，可以通过抑制蛋氨酸与Y器的结合，从而显著减少Y器蛋白的分泌量18。LEE等在对于侧向地蟹的研究中发现了GC蛋白的三种构型，分别是对于NO敏感的含有亚基的GC蛋白（GLGCI），膜受体GC蛋白（GLGCII），以及对于NO不敏感的可溶性GC蛋白（GLGCIII）。他们对切除眼柄后Y器中三种GC蛋白MRNA水平进行观测，发现GLGCI和GLGCIII表达水平上升，
34、而GLGCII水平不变。他们认为这是由于动物血淋巴组织对于眼柄神经肽含量过低的一种补偿19。MIH能够促使Y器中CGMP含量的大量增加，而NO合酶在Y器中的磷酸化表明，由MIH引起的CGMP的大量增加是由NO敏感的GC调控。这也证明了细胞内GC参与了细胞调控2021。32影响三疣梭子蟹蜕皮的各种因素研究321激素如本次试验中所证实的那样，MIH对于三疣梭子蟹的蜕皮有着重要的调控作用，但不仅仅只与MIH一种激素有关，事实证明三疣梭子蟹的蜕皮是由多种激素共同起作用完成的。甲壳动物的蜕皮是受多激素系统调控的，但是却受蜕皮激素的直接调控22。在十足类甲壳动物成体，蜕皮周期的蜕皮间（C相）附肢自切将使蜕
35、皮加速，并伴随着附肢的快速再生,而且这种效应还与自切和再生的附肢数目相关；在蜕皮周期的D0D1相后的自切不会引起再生，也不会延期蜕皮；在D0D1相前的自切会稍微延长蜕皮周期，而附肢再生也很快完成射肢的再生包括肢芽的生长和蜕皮前的快速生长相两个过程，而第二个过程是与激素控制的蜕皮复杂地结合在一起的。附肢自切和再生对幼体蜕皮影响的报道较少泥蟹大眼幼体和仔蟹都具有附肢再生的能力，附肢开始再生的数目与自切的附肢数及自切发生在蜕皮周期的哪一时相有关；自切而没有再生的个体呈现了蜕皮加快的趋势；蜕皮周期的延长至少部分地与附肢的再生抑制了YO蜕皮酮的合成有关23，从而对蜕皮周期的各时相进行重新调整；这种YO蜕
36、皮酮合成的抑制是非眼柄因子或MIH调控的，可能是附肢神经，或胸部神经节，或头部食道下神经节的激素直接反馈抑制调节。322能量能量对于甲壳动物幼体的发育起着十分重要的作用，食物中的一些能够积储能量的物质如甾类化合物以及长链的不饱和的脂肪酸是与蜕皮周期分泌调控作用息息相关的重要外源性的因子，能量和一些重要物质一样同样与蜕皮周期中的关键点有关联。ANGER和DAWIRS24从幼体能学研究提出饱和储存点（POINTOFRESERVESATURATION,PRS）和不可恢复点（POINTOFNORETURN,PNR）两个概念,解释幼体蜕皮的能量调控。PRS是蜕皮或孵化后就给予饵料，到蜕皮周期的某一点，此
37、时幼体积累了足够的能量储备（或营养），允许蜕皮进入下一个蜕皮周期，而无论此点后有无饵料供应；PNR是蜕皮或孵化后就饥饿到蜕皮周期的某一点，14即使再给饵料幼体也无法蜕皮进入下一个蜕皮周期。PRS和PNR是幼体蜕皮周期内的两个关键点，而饵料是蜕皮启动的主要限制因子。有些研究者对于滨蟹和蛤蟆蟹从孵化到PRS50的生物量进行控制，实验组相较于对照组的62和6269，即使在不再供应能量的情况下，仍然大概有一半的幼体可以顺利的发育。幼体刚孵化或刚蜕皮就饥饿达到PNR,即使再供应饵料幼体也不可能进一步发育,可能是由于饥饿使幼体中肠腺的线粒体和脂贮系统达到了不可恢复的损伤程度。甲壳动物成体蜕皮的调控与组织生
38、长和血清蛋白水平有关；幼体中肠腺的脂贮库可能起了十分重要的作用，,因为其贮存主要是在蜕皮周期的蜕皮间C相完成的，在蜕皮前最饱满；而甾类化合物是脂肪中最重要的成分，因为其是蜕皮激素的前体，而甲壳动物本身不能合成甾类化合物，必须从饵料胆固醇转化而来。这些假设和最近关于饥饿幼体蜕皮酮合成虽被延迟但最大浓度与对照组相似的实验结果一致。323其他因素温度在甲壳动物的蜕皮周期中起着十分重要的作用，不仅仅对于蜕皮周期的长短以及蜕皮的启动有影响，甚至还有影响到幼体期的发育期数，当外界温度超过30时，长臂虾没有第四幼体，也就是所说的后期幼体，而在低温1720时候，长臂虾幼体的发育被延长，对于三疣梭子蟹蜕皮周期中
39、温度的影响，至今没有看到有关方面的具体报道。4总结本次试验主要采用实时荧光定量PCR技术进行的，通过对于MIH表达过程中MRNA的测定我们基本上得到了与预期一致的结果，得到了关于MIH基因表达与蜕皮周期变化的量上的一致性，与其他的研究者的成果比较还是比较接近的，得出的变化趋势基本一致，但是也存在细微的差异。与KARAJLEE等研究报道存在差异主要是在蜕皮后期A，B期，同样与本实验室后续利用高效液相色谱电喷雾串联质谱（LCMS/MS）法测定三疣梭子蟹血淋巴中蜕皮激素所得出的结论在蜕皮后期A，B期存在不是完全相互拮抗的差异。上述MIH表达量的差异与KARAJLEE等应用NORTHERNBLOT方法
40、对可口美青蟹蜕皮周期中MIHMRNA水平变化进行测定的方法所得出的所得出的实验数据相比，物种差异性是一方面原因，另外本文采用的是未发育的三疣梭子蟹在蜕皮周期中本身分泌的MIH含量可能也会有所差异。而另外一方面因素在于测定方法的不同，本文应用荧光定量PCR测得的数据使用相对定量2CT方法计算得出结论会有所误差，但是在能够接受的范围25。而相对于KARAJLEE等应用NORTHERNBLOT方法所测定的实验数据更准确、敏感、简便等在低丰度MRNA的检测方面荧光定量PCR更具有优势。另外一方面主要原因是关于蜕皮周期划分的标准，与实际采集样品时候的状态。蜕皮周期的划分主要参考了1967年DRACH和T
41、CHERNIGOVTZEFF所制定的标准。对照可口美青蟹蜕皮前期的划分标准，对三疣梭子蟹观察后发现，由于本文采所集样本蟹龄普遍较小，梭子蟹背面的铁锈很不明显，头胸甲上的裂纹在蜕皮后35天就就变的清晰可见，但是直到蜕皮后期也未并有明显加深的痕迹。雌蟹腹部区域黑紫色的纹路在基本不可见，在大多数所采集的样本中，而梭子蟹体本身是否饱满又存在着个体差异性，上述标准均不能成功作为准确划分三疣梭子蟹蜕皮阶段的标准。在解剖三疣梭子蟹的过程中，我们发现在蜕皮后期A，B期的三疣梭子蟹体内含水量较高，体积比蜕皮前增加3040，刚蜕完壳的软壳蟹处于蜕后A期，继续吸水，身体15柔软，此阶段一般持续23个小时。蜕皮后43
42、0小时的梭子蟹进入蜕后B期，水分较蜕后A期明显减少，表面粗糙，背甲边缘变硬，腮区、心区稍软。这些因素可能导致采集的样品MIH的表达量会有所下降，最后通过荧光定量PCR分析时，会呈现与KARAJLEE等所测得的实验数据相比时存在差异，同时与本实验室通过高效液相色谱电喷雾串联质谱（LCMS/MS）法所测得实验数据成不完全拮抗。理论上是蜕后A期MIH的表达量达到最高，随后慢慢下降，但是在实际的操作过程，通过荧光定量PCR分析所得出的结论，却是蜕后A期MIH的表达量没有达到最高，比蜕前D3/D4期MIH的表达量高出一点。随着进入蜕后B期，梭子蟹体内的水分慢慢减少，从而MIH的表达量上升。最后进入蜕皮C
43、期，梭子蟹体内的多余的水分完全排除，从而致使MIH的表达量达到最高。究竟以上原因会给实验数据造成多大的误差，需要进一步比对试验进行研究。参考文献1刘昌杰，侯艳丽，王纬等虾池养殖三疣梭子蟹当年性早熟初报J齐鲁渔业，1996，16（6）19202LONGMUIRESETALDEVELOPMENT,MOULTSTAGINGANDECDYSISINTHEBANANAPRAWNPENAEUSMERGUIENSIJMARINEBIOLOGY,1983,771831903DRACHANDTCHERNIGOVTZEFFSURLAMTHODEDEDTERMINATIONDESSTADESDINTERMUEETS
44、ONAPPLICATIONSGNRALEAUXCRUSTACSJ,VIEETMILIEUSERA,1967,185976074KELLERRCRUSTACEANNEUROPEPTIDESSTRUCTURES,FUNCTIONSANDCOMPARATIVEASPECTSEXPERIENTIA,1992,484394485WAINWRIGHTG,WEBSTERSG,WILKINSONMC,ETALSTRUCTUREANDSIGNIFICANCEOFMANDIBULARORGANINHIBITINGHORMONEINTHECRAB,CANCERPAGURUSJBIOCHEM,1996,2711274
45、9127546CHENSH,LINCY,KUOCMINSILICOANALYSISOFCRUSTACEANHYPERGLYCEMICHORMONEFAMILYJMARBIOTECHNOL,2005,71932067UMPHREYHR,LEEKJ,WATSNRD,ETALMOLECULARCLONINGOFACDNAENCODINGMOLTINHIBITINGHORMONEOFTHECRAB,CANCERMAGISTERJMOLCELLENDOCRINOL,1998,1361451498朱冬发，沈建明，杨济芬等三疣梭子蟹蜕皮抑制激素CDNA的克隆与序列分析J动物学报2008，54（6）11121
46、1189LEEKJ,KIMHWMOLTINHIBITINGHORMONEFROMTHETROPICALLANDCRAB,GECARCINUSLATERALISCLONING,TISSUEEXPRESSION,ANDEXPRESSIONOFBIOLOGICALLYACTIVERECOMBINANTPEPTIDEINYEASTGENCOMPENDOCRINOL,2007,150350551310ECDYSTEROIDTITERDURINGAMOLTCYCLEOFTHEBLUECRAB,CALLINECTESSAPIDUSJBIOCHEMICALANDBIOPHYSICALRESEARCHCOMMU
47、NICATION,1998,24962462711OHITAT,WATANABET,NAGASAWAH,ETA1MOLECULARCLONINGOFAMOLTINHIBITINGHORMONECDNAFROMTHEKURUMAPRAWNPENAEUSJAPONICUSJZOO1SCI,1997,141578578912姚俊杰，赵云龙甲壳动物蜕皮的调节机制研究进展J水利渔业，2006，26（6）81013KATAYAMAH,OHIRA,T,NAGATA,K,ETAL,ARECOMBINANTMOLTINHIBITINGHORMONEOFTHEKURUMAPRAWNHAS16ASIMILARSEC
48、ONDARYSTRUCTURETOANATIVEHORMONEDETERMINATIONOFDISULFIDEBONDARRANGEMENTANDMEASUREMENTSOFCIRCULARDICHROISMSPECTRAJBIOSCIBIOTECHNOLBIOCHEM,2001,651832183914LEEKJMOLECULARCLONINGOFACDNAENCODINGPUTATIVEMOLTINHIBITINGHORMONEFROMTHEBLUECRABCALLINEETESSAPIDUSJBIOCHEMBIOPHYRESCOMMAN,1995,2091126116115OKUMURA
49、T,OHIRAT,KATAYAMAH,ETALINVIVOEFFECTSOFARECOMBINANTMOLTINHIBITINGHORMONEONMOLTINTERVALANDHEMOLYMPHECDYSTEROIDLEVELINTHEKURUMAPRAWNJMARSUPENAEUSJAPONICASZOOLSCIENCE,2005,2231732016赵红霞甲壳动物蜕皮调控研究及蜕皮素的使用J广东饲料，2006，15（1）333517ZHENGJY,LEECY,WATSONRDMOLECULARCLONINGOFAPUTATIVERECEPTORGUANYLYLCYCLASEFROMYORGANSOFTHEBLUECRAB,CALLINECTESSAPIDUSJGENCOMPENDOCRINOL,2006,14632933618HANDW,WATSONRDTRIMERICGPROTEINSINCRUSTACEANCALLINECTESSAPIDUSYORGANSOCCURRENCEANDFUNCTIONALLINKTOPROTEINSYN
