1、本科毕业设计（20_届）三疣梭子蟹蜕皮周期中甲基法尼酯浓度的变化所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录摘要（ABSTRACT）1前言111三疣梭子蟹的概况112甲基法尼酯研究现状113本文研究的意义和内容22材料和方法221实验材料、仪器和试剂2211材料2212仪器和设备2213实验试剂322测定方法3221三疣梭子蟹蜕皮周期的测定3222气相色谱质谱联用仪323实验方法424数据处理43结果和分析44讨论75结论7致谢8参考文献9摘要甲基法尼酯来自于甲壳动物的大颚器，大颚器被证明是甲壳动物中唯一合成甲基法尼酯的内分泌器官。甲基法尼酯在一定程度上影响着甲壳动物的蜕皮
2、、生长发育等活动。本文通过气相色谱质谱分析的方法，探究三疣梭子蟹蜕皮周期中的甲基法尼酯浓度的变化。实验结果表明，甲基法尼酯在一定程度上影响着三疣梭子蟹的蜕皮周期。关键词三疣梭子蟹蜕皮甲基法尼酯ABSTRACTMETHYLFARNESOATEMFCOMESFROMTHEMANDIBULARORGANSMOOFCRUSTACEAN,ANDMOHASBEENPROVEDTOBETHEONLYENDOCRINEORGANWHICHSYNTHESIZESMFINCRUSTACEANTOSOMEEXTENT,MFAFFECTSCRUSTACEANMOLTING,GROWTHANDDEVELOPMENTAN
3、DOTHERACTIVITIESTHISARTICLEEXPLOREDTHECONCENTRATIONCHANGESOFMFDURINGAMOLTCYCLEOFPORTUNUSTRITUBERCULATUS,BYUSINGGASCHROMATOGRAPHYMASSSPECTROMETRYGCMSANALYSISTHEEXPERIMENTALRESULTSSHOWEDTHATMFINFLUENCEDTHEMOLTCYCLEOFPORTUNUSTRITUBERCULATUSKEYWORDSPORTUNUSTRITUBERCULATUSMOLTMF11前言11三疣梭子蟹的概况三疣梭子蟹，俗称梭子蟹、
4、白蟹，属于甲壳纲、十足目、梭子蟹科，是中国沿海的重要经济蟹类。其生长迅速，养殖利润丰厚，已经成为中国沿海地区重要的养殖品种。梭子蟹一般在35米深海底生活及繁殖，冬天移居到1030米的深海，喜在泥沙底部穴居。其能够适应盐度为1635，水温在434，PH值在79之间，最适盐度为2632之间，最适温度在2228。水质要求清新、高溶氧，当环境不适应或脱壳不遂时有自切步足现象，步足切断后能再生1。三疣梭子蟹和其他甲壳动物一样，在发育过程中，存在蜕皮现象，即蜕去旧的外骨骼并长出新的外骨骼的过程。蜕皮是甲壳动物生长和发育的标志特征，它贯穿甲壳动物个体发育的始终，它受神经系统和内分泌系统共同调节2。12甲基法
5、尼酯研究现状1987，LEROUX3首次提出甲壳动物中大颚器这个概念，主要认为大颚器是甲壳动物组织结构中类似于昆虫咽侧体的一个内分泌腺。同年，LAUFER实验室首次从血淋巴和大额器培养液中分离纯化得到了甲基法尼酯这种JH的前体物质，并且证明了大额器是甲壳动物唯一合成和分泌甲基法尼酯的内分泌器官4。甲壳纲动物的内分泌系统会产生一些重要的激素。其中很重要的一类激素是蜕皮激素，是有前胸腔分泌的一种甾类激素。蜕皮激素的功能是在刺激蜕皮时新外骨骼的合成。第二个重要的激素是甲基法尼酯，是大颚器分泌的倍半萜5。甲基法尼酯合成的经典途径乙酰辅酶A一甲羟戊酸一法尼焦磷酸一法尼醇一法尼酸一甲基法尼酯大颚器利用乙酰
6、辅酶A合成法尼酸图2，法尼酸在转甲基酶的作用下，转甲基生成甲基法尼酯图26。但是在昆虫CA中，因为有环氧化酶的存在，甲基法尼酯将继续环氧化为JH图4。而甲壳动物大颚器中无环氧化酶，所以甲基法尼酯不会被环氧化成为JH。图2法尼酸C15H24O2图3甲基法尼酯（C16H26O2）图4保幼激素（C16H26O3）2随着对甲基法尼酯的研究的不断深入，目前发现甲基法尼酯有着很多重要的生理功能调控蛋白质的合成代谢。对美洲龙鳌虾进行处理，摘除美洲龙鳌虾雌虾双侧大额器，在一天左右的时间后，血淋巴中蛋白质的总含量降低。这个说明大额器对甲壳动物肝胰腺的蛋白质的合成可能有促进作用，甲基法尼酯可能与DNA、RNA和蛋
7、白质的合成有关7；调控甲壳动物发育变态过程。对美洲龙螯虾浮游幼体进行试验，将其持续暴露在含甲基法尼酯的海水中，发现美洲龙鳌虾幼体的变态明显推迟8。在变态过程中，血淋巴中甲基法尼酯的滴度明显升高。甲基法尼酯可能通过PKC信号传导系统来作用，从而诱导变态9；影响甲壳动物蜕皮周期。在甲壳动物的蜕皮周期中，Y器与蜕皮关系非常紧密。对离体培养的真蟹的Y器结构进行处理，将其与甲基法尼酯和大颚器共同培养，一段时间后会发现Y器的蜕皮酮的分泌得到了促进10。同时在观察罗氏沼虾的蜕皮周期，发现其血淋巴中的甲基法尼酯滴定和蜕皮激素滴定呈现周期性变化，而且甲基法尼酯的高峰期出现的时间较蜕皮激素的高峰期稍微早些，这也就
8、意味着甲基法尼酯可能有调控蜕皮激素合成的作用11。影响甲壳动物卵巢的发育。对雌性克氏原螯虾进行处理，分别取卵巢处于卵黄发生前期、初级卵黄发生期、次级卵黄发生期、成熟期、恢复期五个不同发育时期的雌性克氏原螯虾，测定了大颚器的合成速率，各个时期的甲基法尼酯的合成速率。可以得出，在卵巢发育周期中，大颚器合成速率呈周期性变化1213。卵巢发育各个时期中甲基法尼酯的合成速率依次为次级卵黄发生期初级卵黄发生期成熟期卵黄发生前期恢复期，其中次级卵黄发生期的甲基法尼酯的合成速率最高，恢复期的甲基法尼酯的合成速率最低。对结果进行方差分析，各个发育时期之间有显著性差异P005，并且次级卵黄发生期和初级卵黄发生期的
9、甲基法尼酯合成速率与其他各时期之间的差异极显著P00114。13本文研究的意义和内容由于近些年人类对虾蟹的捕捞过度，三疣梭子蟹的自然资源也正日益减少，为满足市场需求和对环境资源的保护，沿海很多地方已开展了人工养殖。人工养殖的三疣梭子蟹与其它的甲壳类动物一样，普遍存在早熟，蜕皮过频，蜕皮未遂等问题，导致梭子蟹的产量大幅度下降。国内外研究者对三疣梭子蟹内分泌系统研究已趋于热点，但是还不能有效的解决三疣梭子蟹养殖中普遍出现的难题。因此研究三疣梭子蟹蜕皮周期的机制以及影响蜕皮周期的因素就显得尤为重要。本次实验通过气相色谱质谱分析的方法，测定三疣梭子蟹蜕皮周期中的甲基法尼酯浓度的变化，以探究甲基法尼酯对
10、三疣梭子蟹蜕皮周期是否有影响。2材料和方法21实验材料、仪器和试剂211材料三疣梭子蟹是从海中捕捞后暂养在宁波宁海长街得水育苗场的养殖池中的。样本选择体宽在911CM之间，体重在4565G之间，放养在相同条件下的育苗池中，海水盐度、水温以及水体溶解氧浓度、喂食量等保持相同，并保证池内的三疣梭子蟹都能够正常生长，从而减少因为不同环境条件而造成的误差。本实验的实验用水为宁海县长街得水产苗种场蟹苗池海水，该海水取自自然海区，经过几天的沉淀池沉淀和两次砂滤池过滤。海水进入育苗池用增氧泵进行水体增氧，保证水体的溶解氧充足。实验样本均是未经过生殖蜕皮的生长状况良好的三疣梭子蟹。212仪器和设备ANKETG
11、L16C离心机上海安亭科学仪器厂ALC2103电子天平ACCULAB有限公司SB4200D超声波清洗机宁波新芝生物科技股份有限公司3GSMS气相色谱质谱联用仪上海智岩科学仪器有限公司其他设备1ML注射器，试管，试管架，烧杯若干213实验试剂双蒸水，甲醇，NACL，乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司），正己烷，色谱正己烷，内标（十二烷酸甲酯）（图5）图5十二烷酸甲酯C15H30O222测定方法221三疣梭子蟹蜕皮周期的测定三疣梭子蟹蜕皮周期是根据游泳足趾节末端新旧表皮基线间距与旧表皮厚度的比值（R值）结合甲壳硬度、解剖后新壳的生长状况、蜕皮缝的开裂状况等形态学特征进行划分的，R趾节新旧表皮基线间距
12、（D）/旧表皮厚度（C）（56）/（234）图1）。每个蜕皮阶段的R值都是在不同水平的，据此，蜕皮可以分为蜕壳前期（即D期，D0D4、蜕壳期（即E期、蜕皮后期（即A/B期、蜕皮间期15。图1蜕皮中游泳足趾节末端结构观察注1刚毛2旧壳上表皮3管状结构4旧壳外表皮5旧壳内表皮6新壳刚毛7新壳上表皮和外表皮8色素层222气相色谱质谱联用仪甲基法尼酯在300C左右能汽化，考虑用GCMS进行分析，因为GCMS使用EI源，得到的质谱信息多，可以进行库检索。毛细管柱的分离效果也好。气相色谱的流动向为惰性气体，气相色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对
13、每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。4图6气相色谱质谱联用仪组成框图23实验方法在对三疣梭子蟹的暂养阶段中，每天对样品进行称重，观察，拍照并根据R值来判断蜕皮周期，从梭子蟹的游泳足基部抽取1000L血淋巴。实验需要很纯的血淋巴样品，所以选择从游泳足基部抽取，而且取材方便。加入含有1000L乙腈和1000L09NACL及10L内标（十二烷酸甲酯）于15ML的玻璃离心管内，涡旋震
14、荡2MIN，让实验材料充分混合在乙腈中，再经过超声波清洗5MIN，清洗干净待测物表面的细微杂质。加入1ML正己烷，涡旋震荡2MIN，3000R/MIN离心10MIN，吸取上层正己烷（含有甲基法尼酯）放置于编号的4ML色谱瓶中，下层重复提取一次，混合正己烷20保存。将实验材料充分提取溶解在正己烷中，得到比较纯的甲基法尼酯。一周内将正己烷旋转蒸发，蒸发后加100L正己烷定容，进行气相色谱质谱分析。根据样品中甲基法尼酯特征离子响应强度与内标十二烷酸甲酯的特征离子响应强度比值，由标准曲线方程求出样品中甲基法尼酯的含量。24数据处理采用SPSS130软件中的单因素ANOVA分析工具对实验数据进行方差分析
15、及显著性差异分析。3结果和分析31蜕皮各阶段血淋巴中甲基法尼酯浓度变化由表1可知，在三疣梭子蟹蜕皮前期的血淋巴中甲基法尼酯的浓度很高，平均值从D0到D4时期分别处于13323NGML1、13375NGML1、12884NGML1、12500NGML1、17100NGML1的水平。在蜕皮后期浓度平均值只有1895NGML1，蜕皮间期的浓度平均值也只有2341NGML1，这两个阶段的甲基法尼酯的浓度比蜕皮前期的浓度低了很多。根据以往的研究发现，对虾蟹做切除眼柄处理后，大颚器合成甲基法尼酯能力和血淋巴中甲基法尼酯滴度都显著提高16。相反，当给美洲龙螯虾注射眼柄X器窦腺提取物后，会发现大颚器合成甲基法
16、尼酯的能力和血淋巴中甲基法尼酯的滴度都显著下降17。这两种实验确切的证实了大颚器抑制激素的存在。原因分析如下1三疣梭子蟹在蜕皮前期时处于一个新壳和旧壳的替换时期，身体很硬，含水量低，所以此阶段的甲基法尼酯的浓度特别高。而在蜕皮后期和前期，各个部位非5常柔软，体内充满水，导致甲基法尼酯浓度很低。2在三疣梭子蟹的蜕皮后A/B期和蜕皮间期，可能存在大颚器抑制激素分泌逐渐增加，导致了大颚器合成甲基法尼酯的能力下降18。表1蜕皮各阶段血淋巴中甲基法尼酯浓度（单位NG/ML）蜕皮后A/B期蜕皮间期蜕皮D0期蜕前D1期蜕前D2期蜕前D3期蜕前D4期组11522184813323114731517710101
17、16530组2305522481462914459135481492617720组3110829281201814194109261247217050均值189523411332313375132171250017100标准差102565461130551652821447241265966注组1、组2、组3为三组平行实验的结果。三疣梭子蟹在被抽取血淋巴后无法再被利用，所以每个蜕皮阶段用于取材的三疣梭子蟹不是同一个。图7蜕皮各阶段血淋巴中甲基法尼酯的浓度图7中可以直观的看到，甲基法尼酯的浓度在三疣梭子蟹的整个蜕皮周期中呈现出有规律性的变化。蜕皮后A/B期和蜕皮间期甲基法尼酯含量很低，在蜕皮到蜕
18、皮前D0D4期的时候的浓度突然升高很多，这和三疣梭子蟹蜕皮周期中身体由硬到软，不断吸水的生理变化是相符合的，但是只是单纯的因为物理变化，图中的甲基法尼酯的浓度不会变化如此剧烈，一定在生理方面也发生了变化，同样也说明了甲基法尼酯在三疣梭子蟹蜕皮周期中的调控作用。32采用SPSS对实验数据进行方差分析6表2方差分析表离差平方和自由度均方F比显著组间6302646061050441044389000组内331302214236644总数6633948220对实验数据进行方差分析，由表2可以明确的看出来，组间的差异性非常显著，随着三疣梭子蟹蜕皮期的进行，甲基法尼酯的浓度也随之发生了很大的变化。这也就意
19、味着，甲基法尼酯在三疣梭子蟹中能起到影响三疣梭子蟹蜕皮周期，或者能够调控蜕皮激素合成分泌的作用。表3显著性差异比较表蜕皮后A/B期蜕皮间期蜕前D0期蜕前D1期蜕前D2期蜕前D3期蜕前D4期蜕皮后A/B期蜕皮间期蜕前D0期蜕前D1期蜕前D2期蜕前D3期蜕前D4期注表示数据之间有显著差异（P005）表3是对每个蜕皮阶段甲基法尼酯的浓度的差异性做的比较，由表可知，蜕皮后A/B期和蜕皮间期浓度的变化没有显著的差异，波动性差异不大，同样蜕皮前D0、D1、D2、D3的浓度变化也没有显著的差异，蜕皮后A/B期和蜕皮间期的浓度变化和蜕皮前期D0、D1、D2、D3浓度变化有显著差异，但是蜕皮前D4期是个特殊的时
20、期，虽然每组数据都发生了变化，但是D4期的变化幅度大小和其他蜕皮时期都不一样，有显著差异。分析原因可能是1，每个作为样本的三疣梭子蟹，我们只是在某个蜕皮阶段抽取它的血淋巴，然后再解剖看一下新壳的生长状况，便不再利用此样本，所以每个蜕皮阶段提取的血淋巴和测出的甲基法尼酯的浓度并非来自同一个三疣梭子蟹，我们只能在取材和养殖时尽量做到条件相似，最大化的减小误差。所以在获取三疣梭子蟹血淋巴时，样本在培养中由于自身或者其他原因发生变化，导致样本之间数据出现差异的情况，是我们无法避免的。2，三疣梭子蟹蜕皮前D4期，已经是蜕皮前期的最后一个阶段，此时的三疣梭子蟹头胸甲腹面和螯足长节背面蜕壳缝完全裂开，新壳柔
21、软清晰可见，分泌完成，可完全脱离旧壳，开始吸水。整个蜕皮前D4阶段，三疣梭子蟹反应比较平稳，这也可能导致三组平行试验中D47时期的浓度变化差异不大。4讨论本次实验结果说明，甲基法尼酯的浓度随着三疣梭子蟹的蜕皮而不断变化，同样也证实了甲基法尼酯在三疣梭子蟹蜕皮周期中有调控作用。结论和目前对甲壳动物大颚器分泌的甲基法尼酯对蜕皮周期的影响的研究成果比较接近。对龙鳌虾幼体进行处理，在其培养液中加入甲基法泥酯，用放射免疫法检测幼体蜕皮酮的变化，在培养后的48H，幼体的蜕皮酮含量相对没有加入甲基法尼酯的对照组有了明显的提高19。采用甲基法尼酯对蜘蛛蟹Y器进行离体培养，结果表明，与没有加入甲基法尼酯的对照组
22、相比，实验组在处理后的24H后Y器分泌到培养基中的蜕皮酮明显增加，而且随MF的剂量和培养时间的增加而增加20。甲壳动物蜕皮周期除了甲基法尼酯的调控以外，也同样受到多种激素共同起作用。甲壳动物成体眼柄内的神经内分泌器官X器官XO窦腺SG复合体是甲壳动物神经内分泌的主要调控中心，其分泌物能抑制甲壳动物蜕皮，称为蜕皮抑制激素MIH；切除眼柄将使甲壳动物缩短蜕皮周期，加快蜕皮。由于幼体蜕皮频繁和蜕皮周期短以小时或天计，人们认为XOSG复合体在幼体期不发挥作用，至少要到后期幼体蟹类的大眼幼体，虾类的仔虾才发挥作用，迄今还没有关于幼体XOSG复合体详细的组织学证据，也没有从幼体眼柄中直接分离纯化出MIH。
23、但眼柄切除实验、注射SG提取物和免疫细胞化学的研究结果表明，幼体的蜕皮存在与成体蜕皮具有一样的激素调节机制2122。除了MIH外，能量对甲壳的发育起着十分重要的作用，还有很多影响因素。温度在甲壳动物的蜕皮周期中起着十分重要的作用，不仅仅对于蜕皮周期的长短以及蜕皮的启动有影响，甚至还有影响到幼体期的发育期数，当外界温度超过30时，长臂虾没有第四幼体，也就是所说的后期幼体，而在低温1720时候，长臂虾幼体的发育被延长，这也是在暂养三疣梭子蟹时养殖池里面的水温要保持一致的原因，避免三疣梭子蟹蜕皮受到温度的影响。5结论本次实验中，在三疣梭子蟹蜕皮各阶段中，血淋巴中甲基法尼酯的浓度发生了很大的变化，在蜕
24、皮前期甲基法尼酯的浓度含量很高，随着蜕皮周期的进行，在蜕皮后期和蜕皮间期，甲基法尼酯的浓度发生很大变化，远远低于蜕皮前期，平均值处于20NG/ML左右的水平。从方差分析的结果来看，蜕皮后期和蜕皮间期的变化并无差异，同样在蜕皮前期的几个阶段中，除了D4期有些不同，其他时期的变化也无差异。总体来看，甲基法尼酯浓度在三疣梭子蟹的蜕皮周期中不断发生变化，二者相互关联着，也说明了甲基法尼酯在一定程度上影响着三疣梭子蟹的蜕皮周期。8参考文献1迟大利,高焕,沈颂东三疣梭子蟹分子生物学研究进展J水产养殖,2008,433362LONGMUIRESETALDEVELOPMENT,MOULTSTAGINGANDE
25、CDYSISINTNEBANANAPRAWNPENAEUSMERGUIENSIJMARINEBIOLOGY,1983,771831903LAUFERH,BORSTD,BAKERFC,ETA1IDENTIFICATIONOFAJUVENILEHORMONELIKECOMPOUNDINACRUSTACEANJSCIENCE,1987,2354782022054ANTONIOR,CHAVESEFFECTSOFSINUSGLANDEXTRACTONMANDIBULARORGANSIZEANDMETHYLFARNESOATESYNTHESISINTHECRAWFISHJCOMPARATIVEBIOCHE
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27、ILNERY,LAUFERH,ETALAPROTEINSYNTHESISINTHEOVARYOFMACROBRACHIUMROSENBERGIIDURINGTHEREPRODUCTIVECYCLEEFFECTSOFMETHYLFARNESOATEMFJAMZOOL,1993,331231318BORSTDW,LAUFERH,LANDAUM,ETALMETHYLFARNESOATEANDITSROLEINCRUSTACEANREPRODUCTIONANDDEVELOPMENTJINSECTBIOCHEM,1987,17112311279杜育哲,顾景龄,吕宪禹,等中华绒螯蟹大颚器分泌物的HPLC分
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29、LAMTHODEDEDTERMINATIONDESSTADESDINTERMUEETSONAPPLICATIONSGNRALEAUXCRUSTACSJ,VIEETMILIEUSERA,1967,1859760716LAUFERH,LANDAUM,HOMOLAE,ETALMETHYLFARNESOATEITSSITEOFSYNTHESISANDREGULATIONOFSECRETIONINAJUVENILECRUSTACEANJINSECTBIOCHEM,1987,171129113117TSUKIMURAB,BORSTDWREGULATIONOFMETHYLFARNESOATEINTHEHEM
30、OLYMPHANDMANDIBULARORGANOFTHELOBSTER,HOMARUSAMERICANUSJJEXPZOOL,1992,26542743118亓一舟,朱冬发,杨济芬,等甲壳动物蜕皮抑制激素调控机制的研究进展J动物学杂志,2010,45216517019CHANGESPHYSIOLOGICALANDBIOCHEMICALCHANGESDURINGTHEMOLTCYCLEINDECAPODCRUSTACEASANOVERVIEWJJEXPMARBIOLECOL,1995,19311420CHANGES,BRUCEMJREGULATIONOFCRUSTACEANMOLTINGAMULTIHORMONALSYSTEMJAMZOOL,1993,17181882621VANNOSTRANDWE,SCHMAIERAHEXPRESSIONPURIFICATIONANDCHARACTERIZATIONOFTHEKUNITZTYPEPROTEINASEINHIBITORDOMAINOFTHEAMYLOIDBPROTEINPRECURSORLIKEPROTIEN2JBIOCHIMBIOPHYSACTA,120916517022朱小明,李少菁甲壳动物幼体蜕皮的调控J水产学报,2001,2541119
