1、第四章 植物病害检疫检验技术,第一节 植物检疫性真菌常见检疫检验技术,直接检验比重检验染色检验洗涤检验保湿萌芽检验分离培养检验,1、适用范围 混杂在种子间的较大病原体（线虫瘿、菌核） 污染大量病菌孢子的种子（小麦腥黑穗病） 种子带明显病症的病粒（小麦黑胚病）,（一）直接检验-肉眼检验,小麦黑胚病粒,腥黑穗病,在检查时应先进行外表和周围的检查，然后，由表及里仔细观察病害症状、菌瘿、菌核等病症。 对于苗木、接穗、插条等，应注意茎、叶、芽、根各部位，并需检查粘着和夹带的土壤。 对块茎、块根以及鳞茎，应特别注意芽眼、凹陷处、伤口和附着的土壤。,主要工具：放大镜或解剖镜。,检查要求：,2、检验方法： 将
2、送验样品分出一半试样，放在白纸或白色塘瓷盘中，检出线虫瘿、麦角菌、黑粉菌球、菌核及病粒，称其重量，计算病害感染率。,3、注意 无病征的种子不一定是无病的种子。 不同的病害可以表现类似的症状， 同一病害也可产生不同的症状。 在确定某种病害时，须与其他方法配合使用。,1、适用范围 检查混杂在种子内较大的病原体如菟丝子、菌核、线虫瘿和杂草种子等。 利用病原体与种子形状、大小的不同，通过一定的筛孔将病原体筛出来，然后进行分类称重。,（二）过筛检验,大豆菟丝子为害,2、检验方法 将送验样品分出一半作为试样，用规定孔径的筛子过筛。 各层样品倒入白瓷盘内检查，最下层的杂质倒入黑玻璃盘中用肉眼或放大镜检查。,
3、病原体含量(%)=,病原体重量(g),试样重量(g),100,过筛检验主要用于检验粮谷、种子、油料、干果和生药材。,1、适用范围：种子表面带病而肉眼看不见的种子病害。（附着在种子表面的病菌孢子）,（三）洗涤检验,小麦矮腥黑穗病菌,洗涤检验法原理：主要用于检查附着在种子表面的各种真菌孢子。种子表面常附着真菌孢子，将一定量的样品放入容器内，加一定量的无菌水，充分振荡，可使病菌孢子洗涤下来，而后离心后，可沉淀，镜检沉淀物可确定其种类和数量。主要仪器和试剂：振荡器、离心机、显微镜、0.1吐温溶液等,2、检验方法： 样品制备：取样(5g)2份于100ml三角瓶内，加蒸馏水10ml（加0.1吐温溶液），振
4、荡510min， 显微计数：悬浮液20003000r/min离心515min，吸去上清液，留1ml沉淀部分，滴于5个载玻片，加盖玻片镜检，每片检查10个视野，并计算每视野平均孢子数,N=n1n2n3/m式中： N每克种子的孢子负荷量 n1每视野平均孢子数 n2盖玻片面积上的视野数 n31ml水的滴数 m供试样品的重量（g）,如果镜检洗涤液时，没有检查到病菌孢子，则对同一样品要重复几次取样洗涤，对每一洗涤液至少要镜检5张玻片。当一个样品两次取样，洗涤检验的结果相差很大时，则需要重复一次。,检验结果有四个影响因素： a种子或其他粮谷类产品表面所粘附的病菌孢子，不一定能完全洗涤下来。,b在离心管内，
5、悬浮液表面常形成一层极难沉降的孢子薄膜，而管壁上也可能粘附着孢子，使检验结果很难代表实际情况，因而影响计算的准确性；,c将悬浮液滴于玻片时，由于孢子迅速沉淀，造成一些视野间孢子分布极不均匀，这也影响计数的准确性，都可能增加误差程度；,d操作不够严格，会造成人为误差，以及制样中也会出现偏差。,原理：由于菌瘿、菌核、病秕粒，都要比健康籽粒轻。若将其浸入一定浓度的食盐水（糖、泥土等）或其他溶液中时，就会浮于液面。捞取浮物，结合解剖镜进行检验，即可鉴定其种类。,（四）比重检验法,比重检验法一般用于检验种子、粮谷、豆类中的菌瘿、菌核和病秕籽粒等。,原理：某些植物或植物器官被病原感染后，或某些病原物本身，
6、常可用特殊的化学药品处理，使其染上特有的颜色，帮助检出和区分病虫种类。这种方法即为染色检验法。例如：马铃薯癌肿病（薯块上癌瘤不明显时，可做徒手切片，加1滴1的“藏花红”染色液，健康组织细胞壁呈亮红色，感病组织细胞壁呈暗红色。麦类赤霉病的检验：将病粒放在0.5-1%对硝基苯胺酒精溶液中，经2-3小时，受侵染部分或有菌丝分布的部分呈现暗红色至咖啡色，而未受侵染部分为黄色，50温度下颜色更明显。,（五）染色检验法,（六）解剖检查法,有许多病害或一些病害初发生阶段，在种子、苗木及其他植物产品表面没有明显的症状，诊断比较困难有时为要了解病原物潜伏的场所，常常需要用解剖检验进行鉴定，如散黑穗病菌以菌丝体在
7、胚中越冬,有的果树病害以菌丝体在花芽或鳞片中越冬。,解剖检验主要采用徒手切片或切片机切片，经过染色，制成玻片标本后，放在显微镜下观察鉴定。对于某些病害或种子苗木及其产品，有时采用粗放的解剖方法也可进行检查。,（七）保湿萌芽检验原理：种子携带的真菌，无论外表黏附的还是潜伏种子内的，在种子萌发阶段即可开始侵染，甚至有些在种子还未萌发时就可长出病菌。主要仪器及试剂：吸水纸、沙土、冰箱、培养箱等。,常规植物病理学方法,保湿萌芽检验的方法： 1、保湿培养检验 2、沙内萌芽检验 3、土内萌芽检验 4、试管幼苗症状测定,1保湿培养检验 此法一般又分为：吸水纸法、冰冻吸水法和琼脂平皿法等。,(1) 吸水纸法
8、广泛用于各种类型的种子，包括禾谷类、豆类、麻类、烟草、各种蔬菜、观赏植物和树木种子等种传真菌病害的检验。,吸水纸法的标准操作： a 用三层无菌吸水纸，吸足无菌水后，滴掉多余的水，放人经消毒的培养皿内，将种子排列在吸水纸上。 b 各粒种子间要保持一定距离，一般不得少于1-1.5cm，再将培养皿置于适当温湿度的恒温箱培养。 c 在培养期间，每天用12h光照和黑暗交替处理，保持一定周期。 d 作物种子和病菌一般经2-10d培养，种子表面就会长出待检病菌，最后进行镜检。,优点:设备简单，应用范围广，操作方便；花费少，快速准确，易于掌握；受检病症立体感强，容易鉴定和便于制作标本等。缺点:在此条件下，有些
9、真菌的菌丝生长不旺盛和产孢量少，而很快被许多杂菌快速生长，超过或掩盖被检病菌。,吸水纸法的特点：,(2)冰冻吸水法 这是一种改进的保湿培养法，其操作步骤如下： a 种子排列在吸水纸上，一般谷物种子在10下保持3d，使其先萌芽。 b 20的温度下，保持2d（其他种子在20下保持4d)。 c 再将幼苗在-20的温度下，进行冰冻过夜，以死亡的幼苗作为培养基。 d 20的温度下，用光暗交替处理12h，保持5-7d。 为了防止细菌的污染，可在吸水纸上加些抗生素，如210-4金霉素或土霉素等数滴。,优点：有利于病原物形成孢子，同时又避免因种子萌芽伸长后造成相互覆盖，便于检查。,(3)琼脂平皿法 此法与吸水
10、纸法所不同之处，就是用1.5%-1.7琼脂，经灭菌后倒入无菌培养皿中，制成一定厚度的平面，代替吸水纸。 优点：因含水量均匀一致，有利于病原菌生长，皿内洁净，杂菌少，便于检查，因此常用于植物检疫检验。,琼脂平皿法用于棉花枯、黄萎病菌的检验。,将沙用清水洗去泥垢，然后用沸水煮过，铺在经酒精或福尔马林液消毒过的萌芽器内，加冷开水至含沙量的60左右。 沙面应低于容器边缘4cm，在铺平的沙上排列种子，间隔一定距离。排好种子后，再加细沙覆盖2-3cm，并加容器盖，置于25的温箱中。 当第一个幼芽长高碰到顶盖时，即应去盖。经过一定时期，将幼芽连根取出，并取出发芽的种子，根据幼苗和未发芽种子所表现的症状及种苗
11、上有无孢子，就可计算发芽率及发病率。,2沙内萌芽检验,3土内萌芽检验 将种子播种在含有灭菌土壤的盆钵或播种箱内，保持适宜发芽的温、湿度。待种子发芽出土后，进行检验，分析其发病情形。,4试管幼苗症状测定 做试管斜面，每管放人1粒种子，塞紧管口。再置于20下，用人工光照和黑暗各半处理。当幼苗达到管顶时，即可将管盖取掉。待培养期到后，检查幼苗症状。,保湿萌芽检验的优点: 容易检查根部和绿色部分，也可避免相互传染，但操作较麻烦，一般可用于检验珍贵的繁殖材料。,保湿萌芽检验的缺点： 1、在对寄主生长发育不良，而适宜于病菌生长发育的条件下，则某些腐生菌可能变成萌芽阶段的寄生菌，造成幼芽发生部分病斑。,2、
12、由于主要还是依靠肉眼检查，多种病害可以产生类似的病症，就是同一种病害也可发生不同的症状等，这些情况都足以影响检验结果的准确性。,（八）分离培养检验,分离培养主要应用于检验潜伏于种子、苗木或其他植物新产品内部，不易发现和鉴定的病原菌；或当种子、苗木或其他植物产品上虽有病斑，但无特殊性的病原菌可供鉴定的场合。不同的病原菌，其所用的培养基、分离方法、培养条件等不尽相同，必须因病制宜地加以使用。 通过分离培养所得到的待检病菌，应通过必要的步骤进行仔细鉴定。,分离真菌的方法有： 1、组织分离法： 将样品材料经表面消毒并冲洗后切成小块，轻轻置于培养基平板表面，写好标签后，即可培养观察。,2、稀释分离法：将
13、寄主组织受害部位的孢子洗下配成悬浮液，经稀释后与熔化并冷却45左右的琼脂培养基混合，然后倒在灭菌的培养基中。,从种子、苗木及其他繁殖材料上获得的病菌，有时还需接种到植株上，使其表现典型症状后，再检查鉴别。,（九）接种方法,由于病原种类与传播方式不同，其接种的方法也各不相同，常用接种方法有下列几种： (1)拌种接种：用病菌孢子拌种，是接种黑粉病（如矮腥黑穗病）最常用的方法。 (2）浸种接种：用病原真菌孢子悬浮液浸种，也是常用的接种方法。 (3)花期接种法：主要用于从花期侵入的病菌。如：大麦、小麦散黑穗病菌的接种。在抽穗后1-2天，用冬孢子悬浮液注射到花内。 (4）整株喷雾接种：孢子悬浮液喷在叶片
14、或茎部 (5)土壤接种法：针对一些土传病菌，如棉花枯、黄萎菌。,核酸技术是一种DNA分析鉴定技术，其方法快速、准确，因此，在植物病原菌的分类鉴定和亲缘关系分析等方面已有广泛的应用。 核酸技术基于PCR（聚合酶链式反应），它是一种体外DNA扩增技术，由于其快速、准确、所需样品量少的特点，十分符合植物检疫检验过程的要求。根据不同的检疫对象，需设计出特异性的引物，就可鉴定特定的病原菌。,（十） 核酸技术,(十) 隔离种植检验 不易发现症状或病原物，需要在生长发育阶段进行病害观察或分析鉴定。 隔离种植应在温室或极为严密的隔离区进行，并在各个生长发育阶段进行观察。,对不同的病害，用不同的方法：,1.2.
15、3.4.5.,对较大的病原体,过筛,肉眼,对种子外表有明显症状的,表面带菌但看不见的,洗涤,滤纸培养,胚内病菌,离体胚培养,种子内部的病原菌,琼脂培养,肉眼,第二节 植物病原细菌检疫检验技术,主讲：王晓东 副教授,所有已知植物细菌病害都可以通过种苗传播，通过种子传病的占40以上，准确检测种子和种苗是否携带检疫性病原细菌，是防治这类病害的关键。,一、病原细菌的检测,植物病原细菌的检测方法，大致可分为直接检测和间接检测两大类。直接检测：检测病原细菌时，病原物不被提取或分离出来。间接检测：先把病原细菌提取、分离或破坏以后进行检测。 又分为活菌检测和非活菌检测。,（一）直接检测,1.直观检验 直观检验
16、是以症状为主的田间检测，植物细菌病害的产地检疫主要是以这种方式进行的。通过肉眼观察植株的症状、菌脓以及镜检观察，并结合田间诊断结果而做出。,快速诊断细菌性病害方法-细菌溢,2. 生长检验 ：生长检验有实验室和田间幼苗症状检验两种。(1)实验室检验：这种检验是将种子播种在湿润吸水纸上，或水琼脂培养基平板上，根据幼芽和幼苗症状做出初步诊断。 (2)田间幼苗症状检验：此法常受到环境条件的影响。 在植物检疫中，生长检验多作为初步检验。,（二）间接检测,1. 活菌检测（1）分离培养法检验A 分离病原细菌 一般用稀释分离法。稀释分离有以下两种方法。 培养皿稀释分离法 平板划线分离法,培养皿稀释分离法,平板
17、划线分离法,取小块病组织用灭菌玻棒研碎。静置一定时间，用灭菌的移植环蘸取以上组织液在琼胶平板上划线培养；先在平板的一侧顺序划35条线，再将培养皿转60将移植环灭菌后,从第二条线末端，顺序划出3-5条线。目的都是使细菌分开形成分散的菌落。,传统鉴定方法,培养性状观察 培养性状对细菌的鉴定是很重要的。不同属的植物病原细菌，它们的培养性状显然不同。 培养性状要分别在培养液、琼胶斜面和琼胶平板上观察。描述时，要指明培养基、培养时间和培养温度等。,细菌的色素非水溶性色素:水溶性色素:,细菌的形态,革兰氏染色法,阳性菌紫色 阴性菌红色,鞭毛染色,涂片,干燥,固定,染色1min,水洗、吸干,镜检,制备涂片标
18、本染色,生理和生物化学性状,用细菌的培养物接种于一些特定的培养基上或检测管内，通过产酸、产气、颜色变化等反应，检测细菌的耐性、好氧或厌氧性、对碳素、氮素和大分子化合物的利用和分解能力等，以达到鉴定的目的。,常见的生化反应,对糖的发酵,甲基红试验,单糖发酵试验,对蛋白质的发酵,吲哚试验,硫化氢试验,其他试验,尿素酶试验,枸橼酸盐利用试验,目前，在传统测定的基础上，发展了测定细菌多项生理生化指标并且借助于计算机统计和决策的快速测定方法。常见的有生化测定试剂盒、Biolog测定、甲基脂肪酸气相色谱分析法等。,（2）浓缩接种及离体叶检测法,把繁殖材料或种子的提取液经浓缩后，通过注射、针刺、摩擦、剪叶或
19、喷雾接种等方法，接种到感病植物上观测是否发病及其症状特点,（3） 噬菌体检验,原理：噬菌体侵染细菌，裂解寄主细胞，在固体平板上培养，则出现噬菌斑。噬菌体具有专化性，利用此特点，可鉴别细菌的种类。噬菌体是侵染细菌的病毒，能在活细菌细胞中寄生、繁殖，并裂解寄主细胞。,优点：噬菌体法要是简便、快速，能直接用种子提取液测定。 缺点：非目标菌量多存在时敏感性较差，噬菌体寄生的专化性和细菌对噬菌体的抵抗性，都可能影响检验的准确性。,过敏性反应致病性的初步测定,为了确定分离到的大量菌种哪些是致病性的，用常规接种方法比较费事，有的要经过相当长的时间。用植物的过敏性反应，来快速筛选致病性细菌。方法是将浓度107
20、/ml的细菌的悬浮液注射在烟草叶片的细胞间致病性细菌往往在6-24h内就在注射点周围出现过敏性枯斑，而腐生性细菌则不表现这种反应。注射Pseudomonas属细菌的，一般在6-10h 即出现枯斑，注射 Xanthomonas属细菌的要10-24h。 烟草、蚕豆叶片也是很好的试验材料。,用于植物病原细菌鉴定和检测的主要方法,2、非活菌检测,（1）免疫吸附分离检测法,原理：结合血清学与平板分离技术，利用与抗原高度亲和性的抗体，来捕获目标细菌，样本中其他细菌均被冲洗掉，再将目标细菌转移或释放到培养基上生长。方法：平皿免疫吸附评价测定法和免疫吸附稀释培养法,该法可以定性、定量检测样品中的抗体或抗原，具
21、有灵敏、简单、快速等优点，已被广泛地用于植物病原细菌的检测。,在这种测定方法中有3种必要的试剂：固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）酶标记的抗原或抗体（标记物）酶作用的底物（显色剂）,免疫荧光抗体测定是先将荧光染料（异硫氰酸荧光黄或罗丹明等）与抗体，以化学方法结合起来，形成标记抗体。当与相应的抗原反应后，产生有荧光标记的抗体-抗原复合物。,（2 ）免疫荧光抗体法,荧光染料不影响抗体的免疫特性，但在荧光显微镜下，能观察到黄绿色荧光，荧光的存在就表示抗原的存在。,（3）PCR技术及其应用,PCR的原理,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,引物,DNA聚合酶,94变性,50-65退火,X
22、X延伸,72,PCR的过程,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,标准的PCR反应体系,4种dNTP混合物 各200mol/L引物 各10100pmol模板DNA 0.12gTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L,PCR的特点,灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(g=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，24h完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低 血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA,总之，对于植物病原细菌的检验检疫，目前，国内外多采用一种“活体检测法”和一种“非活体检测法”相结合的办法进行植物病原细菌的检测，两种方法取长补短，以达到理想的效果。,
