1、本科毕业设计（20_届）鲨鱼肉酶解液钙螯合物的抗氧化抗菌活性分析所在学院专业班级食品质量与安全学生姓名学号指导教师职称完成日期年月2目录1引言12材料与方法121主要材料122主要仪器223试剂224方法2241鲨鱼肉酶解液钙螯合物的分级沉淀2242钙螯合物抗氧化活性的测定2243钙螯合物抗菌性的测定325数据处理43结果与讨论431鲨鱼肉酶解液钙螯合物各级乙醇沉淀产物的得率与性质432酶解液钙螯合物的抗氧化性分析4322螯合物的清除OH自由基能力5323螯合物的DPPH清除能力6324螯合物清除O2自由基能力733钙螯合物的抗菌性测定84结论9致谢错误未定义书签。参考文献10附录113摘要以
2、鲨鱼肉酶解液为原料，以CACL2为钙源进行螯合，利用无水乙醇分级沉淀螯合物，同时测定各级螯合物的抗氧化与抗菌活性。结果显示1）水不溶物、50乙醇不溶物、80乙醇不溶物得率分别为085、086、103。2）80乙醇不溶物的抗氧化性效果最好，其清除DPPH、O2自由基、OH自由基的IC50值分别为7318MGML1、2322MGML1、560MGML1，TBA实验显示其抗氧化效果与生育酚接近；水不溶物与50乙醇不溶物均具有一定的抗氧化性效果，但弱于80乙醇不溶物。3）80乙醇不溶物的抗菌效果稍强于50乙醇不溶物，随着螯合物浓度的提高，抗菌效果增强。关键词鲨鱼肉；酶解液；钙螯合物；抗氧化；抗菌ABS
3、TRACTTHECHELATEWASPRECIPITATEDFRACTIONALLYBYALCOHOL,WHICHISMADEFROMSHARKMEATHYDROLYZATEANDCALCIUMCHLORIDESIMULTANEOUSLY,ANTIMICROBIALANDANTIOXIDANTACTIVITYWEREANALYSEDATALLLEVELSOFCHELATIONPRODUCTSTHERESULTSWEREASFOLLOWS1THEYEILDOFWATERINSOLUBLE,50ALCOHOLINSOLUBLEAND80ALCOHOLINSOLUBLEPRODUCTSWERE085
4、,086,103,RESPECTIVELY,WHICHISRELATIVETOWETMEAT2）80ALCOHOLINSOLUBLESHOWEDTHEBESTANTIOXIDANTACTIVITY,ITSIC50OFDPPHSCAVENGING,O2FREERADICALSCAVENGINGABILITY,OHFREERADICALSCAVENGINGWERE7318MGML1,2322MGML1,560MGML1RESPECTIVELYINADDITION,TBAEXPERIMENTSSHOWEDTHATTHEWATERINSOLUBLEAND50ALCOHOLINSOLUBLEALSOHA
5、VESOMEANTIOXIDANTEFFECTS,BUTLOWERTHANTHE80ALCOHOLINSOLUBLE,WHICHWASCLOSETOTHEEFFECTOFVE3THEHIGHERTHECONCENTRATIONOF50OR80ALCOHOLINSOLUBLE,THEBETTERTHEIRANTIBACTERIALEFFECTANDTHEANTIBACTERIALEFFECTOFTHE80ALCOHOLINSOLUBLEWASSLIGHTLYSTRONGERTHANTHE50ALCOHOLINSOLUBLEKEYWORDSSHARKMEATHYDROLYZATECALCIUMCH
6、ELATEANTIBACTERIALANTIOXIDAN11引言海中霸王鲨鱼广泛分布于印度洋、太平洋和大西洋，为全球性鱼类，在我国南海、东海和黄渤海均有分布。我国鲨鱼捕捞量较大，年产量近2万吨，渔获产量以东海区南部最高，约占全国产量的44。而目前对鲨鱼的利用主要局限于价值较高、占鲨鱼总重15的鱼鳍上，其加工下脚料尤其是产量巨大的鲨鱼肉并未得到很好的利用。研究表明，鲨鱼肉营养丰富，含丰富的不饱和脂肪酸和多种矿物质，其蛋白质的氨基酸比值与人体肌肉蛋白成分非常接近，其吸收利用率高，但鲨鱼肉质粗，加上含有较多的尿素，感官上并不令人满意，直接食用往往受到限制。对鲨鱼肉的研究，国内主要集中在对其产品加工工
7、艺方面，对其深度加工及其生理活性的研究较少。如农绍庄1等研究了鲨鱼肉鱼肠的制作工艺；袁秋萍2对鲨鱼肉松保健食品进行了研制；谢荣辉3以鲨鱼肉为原料制作猫食宠物食品，并对其中添加的抗氧化剂进行筛选。目前对鲨鱼肉的利用多是将其加工成宠物食品或肉肠、鱼松制品，这大大限制了鲨鱼肉的应用范围。金属螯合物是由中心离子和多齿配体结合而成的具有环状结构的配合物。在螯合物的结构中，有一个或多个多齿配体提供多对电子与中心体形成配位键4。金属螯合物的研究始于上世纪70年代，最初由美国ALBION实验室进行，以动植物蛋白和铁元素为原料合成了铁蛋白复合物。一般认为金属离子被氨基酸或多肽鳌合后，能生成具有稳定结构形态的金属
8、螯合物，有机物中的金属离子在配位体氨基酸的保护下，可有效抵御与其它离子生成难溶的无机盐，克服了无机盐的一些缺点，抑制了矿物质之间的相互影响，大大提高生物对于各种金属元素的吸收利用率。由于金属螯合物具有良好的利用率和适口性，加上低廉的成本，已被广泛的应用在食品和饲料行业，尤其是在保健品中。国内的蛋白酶解物金属离子螯合研究开始于上世纪90年代，而鱼肉蛋白酶解物的金属离子螯合研究在近几年才逐渐出现。目前对蛋白降解物金属离子螯合物的生物学功能研究报道较多，如刘安军5等研究表明胶原蛋白多肽铬螯合物可显著提高小鼠肝脏内超氧化物歧化酶（SOD）的表达量，证明胶原蛋白多肽铬螯合物可以清除小鼠体内大量的自由基，
9、对肝脏的损伤进行保护；杨燊等6以南海低值鱼蛋白为原料，采用木瓜蛋白酶和风味酶的复合酶水解制备多肽复合物，并进一步研究鱼肉蛋白多肽的钙螯合物，研究表明该钙螯合物具有一定的抗氧化作用。鱼肉经酶作用水解后，功能和品质可得到提高，再经过金属离子如钙、铁、锌等螯合，不仅能提升其品质与功能性，而且有可能体现出新的有益活性。目前利用鲨鱼肉酶解液为原料，制备金属螯合物，并进一步研究其生理活性的研究国内外未见报道，本实验室在酶解鲨鱼肉，优化酶解液钙螯合条件的基础上，得到了鲨鱼肉酶解液钙螯合物。本文利用无水乙醇作为萃取剂，对优化条件下制备的鲨鱼肉酶解液钙螯合物进行分级沉淀，得到水不溶物、50乙醇不溶物、80乙醇不
10、溶物三个螯合物组分，以硫代巴比妥酸法（TBA法）、自由基清除率等分别测定螯合物的抗氧化活性，同时以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌为试验菌，以抑菌圈大小为指标分析其抗菌活性，旨为鲨鱼肉的开发、鲨鱼肉酶解液钙螯合物的进一步利用提供理论依据。2材料与方法21主要材料鲨鱼肉由温州某水产开发有限公司提供，为鱼翅加工的副产品。鲨鱼肉酶解液钙螯合物由本实验室自制。试验菌种大肠杆菌ESOHERICHIACOLI、金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS和枯草芽孢杆菌2BACILLUSSUBTILIS均由本院微生物实验室提供。22主要仪器电子分析天平BP221S德国SARTORIUS公司电热恒
11、温鼓风干燥箱DHG9070A上海精宏实验设备有限公司电子天平TD3102余姚市金诺天平仪器有限公司电热恒温水浴锅DKS24上海精宏实验设备有限公司高速冷冻离心机GL21MC湘仪离心机仪器有限公司双光束紫外可见分光光度计UV4802UNICO公司（美国）PH计DOCUMETERSARTORIUS公司（德国）23试剂名称纯度生产企业木瓜蛋白酶（酶活111105U/G）食品级广西南宁庞博生物公司邻菲罗啉分析纯天津市博迪化工有限公司过氧化氢分析纯杭州高晶精细化工有限公司磷酸二氢钠、磷酸氢二钠分析纯汕头市金砂化工厂硫酸亚铁分析纯四达表面处理材料厂三氯化铁分析纯上海展云化工有限公司铁氰化钾分析纯上海试剂一
12、厂邻苯三酚分析纯国药集团化学试剂有限公司TRIS三羟甲基氨基甲烷分析纯上海生物工程有限公司EDTANA2分析纯宁波神化化学品经营有限责任公司三氯乙酸分析纯国药集团化学试剂有限公司DPPH二苯代苦味酰基自由基分析纯和光纯药工业株式会社（日本）盐酸分析纯杭州化学试剂厂无水乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司24方法241鲨鱼肉酶解液钙螯合物的分级沉淀蛋白酶解液经过钙离子螯合，得到不同的螯合物，根据其极性的不同可采用不同浓度的乙醇浓度将其分离。酶解液钙螯合物8000RPM离心15MIN，沉淀即为水不溶组分A；上清液中加入等体积无水乙醇，室温静置30MIN，离心，沉淀即为50无水乙醇不溶性组分B；剩余的
13、上清液中加入无水乙醇，至乙醇浓度达到80，室温静置30MIN，离心，沉淀即为80无水乙醇不溶性组分C。采用真空冷冻干燥法，将各级样品冷冻干燥，冷藏备用。242钙螯合物抗氧化活性的测定2421TBA法（硫代巴比妥酸法）将02ML亚油酸的样品加入30ML试管中，然后加入10ML995乙醇和10ML50MOLL1磷酸盐缓冲液PH70。每一种样品50MG加入到此混合溶液中，然后用蒸馏水定容至25ML。将其放入到培养箱中在403培养。TBA溶液根据OHKAWA等8方法配制，该溶液含有08ML水、02ML81SDS和15ML20的醋酸，后用10MOL/L的NAOH和15ML08TBA调PH至35。将50L
14、的氧化性亚油酸溶液（分别经40培养1天、3天、5天、7天、9天）加入到TBA混合液中，并在5培养1H，然后在100加热1H，冷却后测定535NM吸光值。结果被表示为对亚油酸的氧化抑制率，同生育酚（VE）的抗氧化性作对照比较。抑制率的计算公式抑制率（AB）100/AC式中A为对照组（50L去离子水、02ML亚油酸）的吸光度；B为样品组（50L样品液、02ML亚油酸）的吸光度；C为生育酚液组（50L生育酚液、02ML亚油酸）的吸光度。2422DPPH清除能力的测定9具塞试管中加入样品液2ML及2ML1104MOL/LDPPH溶液用95乙醇配制，摇匀，室温下密闭静置30MIN，于517NM下测定吸光
15、度。DPPH清除率1A1A2/A0100式中A1酶解液DPPH溶液的吸光度；A2酶解液95乙醇溶液的吸光度；A0DPPH溶液蒸馏水的吸光度。2423O2自由基清除能力的测定10取50MMOLL1，PH820TRISHCL缓冲液45ML其中含有2MMOLL1EDTANA2，加入03ML不同浓度的样液，25保温10MIN，然后加入25预温的45MMOLL1的邻苯三酚用10MMOLL1HCL配制02ML，混匀后迅速于干燥的比色皿中，在320NM下每隔半分钟测定一次吸光值（A），测到4MIN。以等体积10MMOLL1HCL代替邻苯三酚溶液为空白调零，对照组以等体积去离子水代替样品。作吸光度随时间变化曲
16、线的回归方程，其斜率为邻苯三酚的自氧化速率V，按下式计算样品对O2的清除率。100对照样品对照）清除率（VVV式中V对照对照组邻苯三酚自氧化速率A/MIN；V样品样品组邻苯三酚自氧化速率A/MIN。2424清除OH自由基能力测定邻二氮菲法11取075MMOLL1的邻二氮菲无水乙醇溶液1ML于试管中，依次加入2ML02MOLL1醋酸钠缓冲溶液和1ML蒸馏水，充分混匀后，加入075MMOLL1硫酸亚铁溶液1ML，混匀后加入001双氧水1ML，37水浴加热50MIN，在536NM测其吸光值，所测吸光值为损伤管的吸光值。未损伤管以1ML蒸馏水代替损伤管中1ML001的双氧水，样品管以1ML样品代替损伤
17、管中的1ML蒸馏水，操作方法同损伤管，以蒸馏水调零，测得536NM未损伤管和样品管的吸光值。100清除率损未损样）（AAAA243钙螯合物抗菌性的测定2431菌种活化和菌悬液的制备分别将大肠杆菌ESOHERICHIACOLI、金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS和枯草芽孢杆菌4BACILLUSSUBTILIS接种于固体斜面培养基上，37培养24H。取活化培养好的菌株，用无菌生理盐水将菌苔洗下，采用菌落计数法制成菌体悬浮液，将菌悬液的菌数稀释为LL08CFU/ML。2432抑菌圈的测定采用管碟法（牛津杯法）测定12。1ML菌悬液与15ML左右的营养琼脂培养基后摇匀，放置冷却后，
18、用无菌镊子摄取已经干热灭菌的牛津杯，轻轻平置于平板表面，每皿等距放入4个牛津杯，每一菌种做2个平皿，用无菌微量注射器按顺序分别加入相应浓度的样品液025ML，平皿的中央用无菌生理盐水做对照。细菌置于37培养箱进行培养，15H后测定抑菌圈直径。25数据处理实验平行次数35，取平均值作图。采用图表法对所得到数据进行分析，并通过添加趋势线的方法分别计算DPPH清除能力、O2自由基清除能力、清除OH自由基能力的IC50值。3结果与讨论31鲨鱼肉酶解液钙螯合物各级乙醇沉淀产物的得率与性质利用乙醇对螯合物进行分级沉淀，共有组分A（水不溶物）、组分B（50乙醇不溶物）和组分C（80乙醇不溶物）三种产物，各级
19、产物的得率如图1所示。图1各级产物得率FIG1THEYIELDOFTHREEKINDSPRODUCTS其中水不溶物、50乙醇不溶物、80乙醇不溶物得率分别为085、086、103。三种产物经冷冻干燥后特征性质如下组分A灰白色粉末状，较细腻，不溶于水。组分B浅褐色晶体状物质，具有一定的水溶性。组分C深褐色晶体状物质，干燥前粘性较强，干燥后呈现颗粒状晶体，水溶性较好，在低浓度的醇溶液中也有良好的溶解性。32酶解液钙螯合物的抗氧化性分析321螯合物的抗亚油酸氧化能力油脂受到光、热、空气中氧的作用，发生酸败反应，分解出醛、酸之类的化合物，丙二醛即是其中的5一种分解产物，它能与TBA（硫代巴比妥酸）作用
20、生成粉红色化合物，在538NM处有吸收峰。利用TBA法，以培养1、3，5，7，9天的亚油酸为原料，分别对水不溶物、50乙醇不溶物、80乙醇不溶物的抗氧化性进行测定，并与生育酚进行对比，结果如图2。图2三种钙螯合物组分抗亚油酸氧化的能力FIG2THREEKINDSOFCALCIUMCHELATESCOMPONENTSRESISTANCETOLINOLEICACIDOXIDATIONABILITY由图2可知，组分C（80乙醇不溶物）的抗亚油酸氧化的效果最好，与生育酚抗氧化力比值在9011012范围内；其次为组分B（50乙醇不溶物），与生育酚抗氧化力比值在851963范围内；而组分A（水不溶物）抗氧
21、化能力稍弱，与生育酚抗氧化能力的比值在796969范围内。322螯合物的清除OH自由基能力机体在生命活动中会不断产生各种活性氧自由基REACTIVEOXYGENSPECIES，ROS，引起DNA损伤、癌变、细胞衰老等，从而引发各种疾病，包括肿瘤、衰老、心脑系统损伤，并与神经系统及糖尿病并发症等很多疾病的发生密切相关13。各种活性氧自由基中以羟自由基OH作用最强，毒性最大。OH是一种氧化还原能力很强的自由基，可使体内蛋白质、核酸和多糖发生氧化而破坏。因此，OH的存在和人体的衰老、肿瘤等许多疾病有密切关系。根据邻二氮菲FE2的溶液呈红色，在536NM下产生吸收峰14。当邻二氮菲FE2被反应体系产生
22、的羟自由基氧化后，红色褪去，536NM吸收值大幅下降。当加入清除剂后，吸收值的下降速度减缓，以此来衡量样品清除羟自由基的能力。以010MGML1的浓度梯度分别测定了组分B（50乙醇不溶物）与组分C（80乙醇不溶物）清除OH自由基能力，结果见图3与图4。6图380乙醇不溶物清除OH自由基能力FIG3OHFREERADICALSCAVENGINGABILITYOF80ALCOHOLINSOLUBLEPRODUCTS由图3可以看出，组分C（80乙醇不溶物）具有很好的清除O2能力，且与其浓度呈现一定的量效关系，在一定的范围内呈线性相关，其线性方程为Y64145X12173（R208321），计算得出其
23、IC50值为560MGML1。图4组分B（50乙醇不溶物）清除OH自由基能力FIG4OHFREERADICALSCAVENGINGABILITYOF50ALCOHOLINSOLUBLEPRODUCTS图4可以看出，组分B（50乙醇不溶物）具有较好的清除O2能力，且与其浓度呈现一定的量效关系，并在一定的范围内呈线性相关，其线性方程为Y4397X2424（R209664），计算得出其IC50值为1192MGML1。由两者的IC50值可知，组分B的抗氧化效果明显较组分C差。这可能与组分B的复溶性较差有关，也可能与两者形成螯合物的小肽氨基酸种类不同有关。323螯合物的DPPH清除能力二苯代苦味酰自由基
24、（DPPH）在有机溶剂中是一种稳定的自由基，含有3个苯环，1个氮原子上有1个孤对电子，呈紫色，在517NM有强吸收15。在有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学计量关系的，因此可用于检测自由基的清除情况，该法简单快速，是最早用于测定抗氧化活性的间接方法16。将组分C807乙醇不溶物按010MGML1的浓度梯度，测定其清除二苯代苦味酰自由基（DPPH）的能力，结果见图5。图5组分C（80乙醇不溶物）清除二苯代苦味酰自由基（DPPH）能力FIG5DPPHSCAVENGINGABILITYOF80ALCOH
25、OLINSOLUBLEPRODUCTS由图5可见，组分C（80乙醇不溶物）具有显著的清除DPPH能力，酶解产物清除DPPH的能力与其浓度呈现一定的量效关系。当组分C的浓度达到10MGML1时，其对DPPH的清除能力可以达到8018，其线性方程为Y07427X214416X20552（R209955），计算得到其IC50值为7318MGML1。324螯合物清除O2自由基能力超氧阴离子自由基O2可作为多数氧自由基的母体，在生物体内经过一系列反应生成其它自由基。超氧阴离子自由基本身及其衍生的自由基均具有细胞毒性，会导致细胞DNA损伤及细胞膜损伤。对超氧阴离子自由基的清除可以有效地减少氧自由基的生成，
26、具有非常重要的意义17。邻苯三酚在弱碱性环境中自身氧化分解产生O2和有色中间物在320NM处有最大吸收峰，有色中间产物的积累在滞后3040S与时间成良好的线性关系，一般维持4MIN，随后减慢18。O2对自氧化又起催化作用，依据有色中间物生成量的多少，可判断O2生成量的多少。当有抑制剂存在时，可以将O2歧化分解成H2O和O2，从而抑制了邻苯三酚的自氧化，达到阻止中间产物的积累的目的19，根据数值的变化可判断产物清除O2的能力。以024MGML1的浓度梯度测定样品清除超氧阴离子（O2）的能力，结果见图6。图6组分C（80乙醇不溶物）清除超氧阴离子（O2）能力FIG6THEO2FREERADICAL
27、SCAVENGINGABILITYOF80ALCOHOLINSOLUBLEPRODUCTS8由图6可以看出，组分C（80乙醇不溶物）具有较好的清除O2能力，抑制率与其浓度呈现一定的量效关系，在一定范围内呈线性增长，其一次线性方程为Y16865X10834R20982，计算得出其IC50值为2322MGML1。通过以上4个指标的测定，显示组分C（80乙醇不溶物）有较高的抗氧化性，其DPPH清除能力、O2自由基清除能力、OH自由基清除能力的IC50分别为7318MGML1、2322MGML1、560MGML1，分别以不同程度高于鲨鱼肉酶解液的抗氧化活性（另文报道）。TBA法显示其抗氧化效果与VE接
28、近。夏松养20等以低值鱼蛋白为原料通过复合酶水解法和钙修饰法获得了蛋白质酶水解物的修饰产物并对其功能活性进行了初步研究，分析了三种螯合组分水不溶物、50乙醇不溶物和80乙醇不溶物的抗氧化活性，结果发现组分水不溶物具有最高的抗氧化活性，且高达未螯合水解物抗氧化活性的14倍，A生育酚的94。这与本实验鲨鱼肉酶解液钙螯合物抗氧化性的测定结果不一致，可能与酶解液组成、螯合物结构存在差异所致。BOU等21对星鲨肉用五种不同酶进行酶解，研究其体外抗氧化活性，其中碱性蛋白酶酶解产物抗氧化活性最强，将该酶解产物经SEPHADEXG25分离后得到3个片段，其中分子量低于3500DA的活性最强，经分析其富含组氨酸
29、、甲硫氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和精氨酸。其他研究也表明蛋氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸和亮氨酸对清除自由基有较好的效果22。研究表明鲨鱼肉酶解液中的碱性氨基酸赖氨酸、组氨酸、精氨酸在螯合金属离子时起了重要的作用23，而本实验利用的鲨鱼肉酶解物中上述氨基酸占总水解氨基酸量的4971（另文报道），使鲨鱼肉酶解液的钙螯合物具有较好的抗氧化性。33钙螯合物的抗菌性测定以大肠杆菌ESOHERICHIACOLI、金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS和枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILIS为指示菌，测定组分B和C的抑菌圈直径，结果如表2。表150乙醇不溶
30、物与80乙醇不溶物对三种菌的抑菌圈TABLE1THEBACTERIOSTATICCIRCLEOF50ALCOHOLINSOLUBLEAND80ALCOHOLINSOLUBLEPRODUCTSONTHREEKINDSOFBACTERIA抑菌圈直径（MM）螯合物浓度大肠杆菌金黄色葡萄球菌枯草杆菌组分B组分C组分B组分C组分B组分C011010101210101111311141113由表1可见，组分B（50乙醇不溶物）和组分C（80乙醇不溶物）均表现出一定的抗大肠杆菌ESOHERICHIACOLI、金黄色葡萄球菌STAPHYLOCOCCUSAUREUS和枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILIS
31、的活性，1溶液的抗菌效果均强于01溶液，说明随着样品浓度的提高，抗菌效果增强。同时，组分C（80乙醇不溶物）的抗菌效果稍强于组分B（50乙醇不溶物）。宁正祥等24发现食品防腐剂的抗菌性主要取决于分子中由电子接纳中心和电子供给中心构成的电子中继系统的电子缓冲能力，由于螯合作用，组分与组分的电子受体如CA、CO的C和CO的C和电子供体如CO的O和CO的O数量增多，电子缓冲能力得以显著增加，而且螯合作用形成的环状结构类似于苯甲酸的苯环，不仅改善了螯合环的电子分布也改善了羰基的电子分布，有利于螯合组分显示抗菌活性。94结论以鲨鱼肉为原材料，分级提纯优化条件下制备得到的鲨鱼肉酶解液钙化螯合物，其水不溶物
32、、50乙醇不溶物、80乙醇不溶物得率分别为085、086、103。其中80乙醇不溶物的抗氧化性效果最好，其DPPH清除能力、O2自由基清除能力、OH自由基清除能力的IC50分别为7318MGML1、2322MGML1、560MGML1，TBA实验显示其抗氧化效果与VE接近。而水不溶物与50乙醇不溶物均具有一定的抗氧化性效果，但效果较80乙醇不溶物差。此外，分离提纯得到的样品还具有一定的抗菌性，且当50乙醇不溶物与80乙醇不溶物样品溶液的浓度提高时，抗菌效果增强。同时，后者的抗菌效果稍强于前者。综合考虑产物的得率以及其抗氧化效果与抗菌效果，将其进一步加工成适合的产品后，不但可制成有益健康的保健品
33、，还能够成为一种良好的食品添加剂，有着不错的市场前景。10参考文献1农绍庄,韩君鲨鱼肉肠制造工艺的研究J食品科学,1997,18736382袁秋萍鲨鱼松保健食品的研制J食品工业科技,1999,21459593谢荣辉鲨鱼肉猫用食品的试制究J食品科技,2007,22582604胡奇伟金属螯合物的营养作用J湖北畜牧兽医,L994,3241455刘安军,王维君,曹东旭等胶原蛋白多肽铬螯合物对小鼠肝脏SOD表达的影响J食品研究与开发,2007,1222256杨燊,邓尚贵,秦小明低值鱼蛋白多肽钙螯合物的制备和抗氧化、抗菌活性研究J食品科学,2008,2912022067SANGEETHAS,NEILWR,
34、SHAWNALMCOMPARISONOFANTIMICROBIALACTIVITYINTHEEPIDERMALMUCUSEXTRACTSOFFISHJCOMPARATIVEBIOCHEMISTRYANDPHYSIOLOGY,PARTB,2008,15085928KLOMPONGV,BENJAKULS,KANTACHOTED,ETALANTIOXIDATIVEACTIVITYANDFUNCTIONALPROPERTIESOFPROTEINHYDROLYSATEOFYELLOWSTRIPETREVALLYSELAROIDESLEPTOLEPISASINFLUENCEDBYTHEDEGREEOFHY
35、DROLYSISANDENZYMETYPEJFOODCHEMISTRY,2007,1024131713279王会,郭立,谢文磊抗氧化剂抗氧化活性的测定方法二J食品与发酵工业,2006,3249810210顾林,孙婧鲫鱼蛋白水解及其中性蛋白酶水解液抗氧化活性研究J食品科学,2008,29817718011许庆陵,曾庆祝,朱莉娜等鲢酶解物对羟自由基的清除作用J水产学报,2004,281939912张建荣,马俪珍,甄润英等鲶鱼骨酶解产物抑菌活性的酶解工艺优化J食品科技,2008,817317613丁利君,钟森辉鳕鱼蛋白酶解工艺优化及其酶解液抗氧化研究J食品科学,2008,29839840114胡文婷
36、,张凯,孙谧鳕碎肉酶解物清除羟自由基作用研究J水产科学,2007,26420720915STEPHEND,FIONAR,HELENHTHECHARACTERIZATIONOFSTRUCTURALANDANTIOXIDANTPROPERTIESOFISOFLAVONEMETALCHELATESJJOURNALOFINORGANICBIOCHEMISTRY,2010,1041091109816郭雪峰,岳永德,汤锋等用清除有机自由基DPPH法评价竹叶提取物抗氧化能力J光谱学与光谱分析,2008,2871578158217吴春,陈林林菟丝子黄酮体外清除自由基活性的研究J天然产物研究与开发,2005,1
37、75242718玄红专,桑青,麻建军邻苯三酚自氧化法测定不同蜂产品抗氧化活性的研究J食品科技,2008,413713919邓尚贵,杨燊,秦小明等低值鱼蛋白多肽铁螯合物的酶解制备及其抗氧化、抗菌活性J湛江海洋大学学报,2006，134545820夏松养,谢超,霍建聪等鱼蛋白酶水解物的钙螯合修饰及其功能活性J水产学报,2008,323717721BOUGATEFA,HAJJIM,BALTIR,ETALANTIOXIDANTANDFREERADICALSCAVENGINGACTIVITIESOFSMOOTHHOUNDMUSTELUSMUSTELUSMUSCLEPROTEINHYDROLYSATESO
38、BTAINEDBYGASTROINTESTINALPROTEASESJFOODCHEMISTRY,2009,11441198120522GIMNEZB,ALEMNA,MONTEROP,ETALANTIOXIDANTANDFUNCTIONALPROPERTIESOFGELATINHYDROLYSATESOBTAINEDFROMSKINOFSOLEANDSQUIDJFOODCHEMISTRY,2009,114397698323SAIGAA,TANABES,NISHIMURATANTIOXIDANTACTIVITYOFPEPTIDESOBTAINEDFROMPORCINEMYOFIBRILLARPR
39、OTEINSBYPROTEASETREATMENTJJOURNALOFAGRICULTURALANDFOODCHEMISTRY,2003,51123661366724宁正祥,高建华食品防腐剂抗菌机理和构效关系J广州食品科技,1997,132L411附录文献综述蛋白酶解液金属螯合物的研究茅宇虹（宁波大学生命科学与生物工程学院宁波315211）摘要鳌合物在上世纪70年代就开始研究，最初是由美国ALBION实验室进行，以动植物蛋白和铁元素为原料合成了蛋白铁IRONPROTEINASE复合物。国内的蛋白酶解物金属离子螯合研究开始于上个世纪九十年代，关于鱼肉的酶解物金属离子螯合研究在近几年才逐渐出现。本
40、文主要介绍蛋白酶解液金属螯合物的制备及其抗氧化性和抗菌性的研究。关键词蛋白酶解液；螯合物；制备；抗氧化性；抗菌性0前言螯合物通常专指金属与二个氨基酸或多个氨基酸通过较牢固的化学键配位键和离子键形成的杂环五环或六环结构1，整个分子结构呈中性，也有人称其为肽螯合，能借助原有的小肽吸收机制被机体吸收，快速，高效，低耗能，不易饱和。在众多的有机矿物质当中，二肽螯合物是最理想、最高效、效果也最好的有机物。鳌合物的研究始于上世纪70年代，最初由美国ALBION实验室进行，以动植物蛋白和铁元素为原料合成了蛋白铁IRONPROTEINASE复合物。国内的蛋白酶解物金属离子螯合研究开始于上世纪90年代，关于鱼肉
41、的酶解物金属离子螯合物的研究在近几年才逐渐出现。1蛋白降解物金属螯合物的制备蛋白降解物金属螯合物的制备一般分为如下几个步骤蛋白降解物制备加入金属离子调整反映环境螯合分离提纯2。蛋白降解物的制备往往是通过对蛋白的水解获得。根据其生产方法出现先后顺序主要包括酸水解法、碱水解法和酶水解法。酶法水解是上世纪90年代后期至今普遍采用的水解方法。生物酶能在温和的条件下进行反应，而且可以通过酶制剂种类的筛选、酶反应时间、反应PH值、反应温度及水解度等参数的控制来得到人们想要的水解产物，使蛋白的水解过程变得可控。因此，酶法水解成为制取各类水解蛋白的主要方法和发展方向。目前对于蛋白降解物金属离子的鳌合研究较多，
42、但多集中于单体氨基酸类物质和铁元素的鳌合研究。在采用亚铁离子作为螯合离子的时候必须加入一定量的抗氧化剂（例如维生素C），以防止亚铁离子的被氧化成三价铁离子。螯合反应对于阴离子也有一定的选择性，不同的金属离子与不同的蛋白降解物对阴离子的选择不同，一般以溶解度好和适应的PH为原则。曹银娣3等,以米渣为蛋白肽原料，以FESO4为铁源制备蛋白肽螯合铁，通过单因素实验和正交实验，采用氮气保护措施，确定了最佳螯合工艺条件。杨燊4等确定了多肽螯合钙离子最佳工艺条件为在螯合物形成后，产物会自动从酶解液或者多肽液中沉淀下来，一般采用离心分离的方式就能将其中的水不溶物给分离出来。还有一种方法就是通过往反应液中添加
43、不同体积分数的酒精，来实现分级分离。12邓尚贵5等在实验中通过先后加入50、80两种体积分数的酒精实现了对铁螯合物的分级分离并使用红外光谱分析了这分级沉淀后产品，发现不同级别的分离物在吸收峰上有着明显的不同，并且发现样品水不溶物、50乙醇沉淀物以及80乙醇分离的两种物质的铁质量分数分别为L769、L093、724和513，可以看出螯合物随着水溶和醇溶能力增加铁含量减少，螯合能力减弱。2蛋白降解物金属螯合物功能的研究目前，对肽和氨基酸螯合金属离子的作用模式尚不清楚被研究者较为接受的是氨基酸或肽的吸收机制。ASHMEAD6等证明，氨基酸螯合金属离子的吸收是利用氨基酸或小肽的吸收机制，不同于小肠中普
44、通金属的吸收机制。FOUND7研究表明，位于具有五元环或六元环中心的金属离子可以直接通过小肠绒毛刷状缘，以胞饮的形式吸收。此理论的根据是金属离子以共价键和离子键与氨基酸的配位体键合，被保护在复合物的核心，避免了一些理化因子的攻击，而且金属螯合物被肠粘膜吸收，使得所携带的金属离子得到更有效的吸收。WEBB8等的研究表明，对所有动物来说，氨基酸以肽的形式吸收和以游离氨基酸的形式吸收同样重要，甚至更重要。BRONK9等证明小肽能完整地被吸收，通过肠粘膜细胞进入体循环。刘安军10等通过肽质量指纹图谱对差异蛋白的分析和无SDS丙烯酰胺电泳的抗氧化染色研究表明胶原蛋白多肽铬螯合物可显著提高小鼠肝脏内SOD
45、表达量，从而证明胶原蛋白多肽铬螯合物可以清除小鼠体内大量的自由基，进而证明胶原蛋白多肽铬螯合物可以对肝脏的损伤进行保护。21螯合物抗菌性的研究通过抑菌圈大小能反映某物质抗菌能力的强弱，其中主要有牛津杯双层半板法。在无菌平皿中倒入10ML加热融化的2琼脂，待其充分冷却凝固后，放入已灭菌的牛津杯数个，并按一定次序排放整齐。将分装于大试管中的15ML固体检测培养基融化后冷却全50左右，加入10G个ML指示菌液1ML，迅速混合均匀，倒入半皿。冷却后，用无菌镊子取出牛津杯，作为活性肽螯合物活性检测平板。用01ML吸管吸取1002001待测样品，以无菌操作加入到检测平板圆孔内，37培养15H，观察并测定抑
46、菌圈直径MM。据报道11螯合物的肽分子可能和细菌细胞膜受体蛋白结合，改变细胞质膜通透性，造成膜结构破坏，引起膜内水溶性物质大量渗出，从而导致细菌死亡。有许多研究12表明一些小肽具有广谱杀菌作用，相对分子量较小，具有热稳定、水溶性好等优点。近年来的研究发现，食物蛋白经酶解也有可能产生出有效的抗菌肽。这方面的研究多以由乳蛋白产生的抗菌肽，以水产原料的报道较少。张建荣13等对鲶鱼骨酶解产物的抑菌活性进行了研究，其以大肠杆菌、枯草杆菌和藤黄色葡萄球菌为供试菌种，以抑菌性为指标对酶解条件进行了优化。杨燊14等以南海低值鱼蛋白为原料，采用木瓜蛋白酶和风味酶的复合酶水解制备多肽复合物，对及价值鱼类的蛋白多肽
47、的钙螯合物的研究，研究表明出钙螯合物都具有一定的抗氧化作用，螯合反应后未经过无水乙醇分级沉淀得到的物质抗氧化作用最强，其抗氧化效果达到生育酚的9443，并在抗菌性实验中采用牛津杯双层平板法对鱼蛋白酶解的钙螯合物进行研究，发现螯合反应后加80无水乙醇分级沉淀得到的物质对枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌均有较好的抗菌效果，活性肽及其螯合物抑菌作用均不明显，活性肽样品无抑菌圈出现。田萍15等以低值鱼蛋白为原料通过复合酶水解法和钙修饰法获得了蛋白质酶水解物的修饰产物并对其功能活性进行了初步研究，分析了三种螯合组分的抗氧化活性与抗菌性，分别是水不溶物、50乙醇不溶物和80乙醇不溶物，结果发现组分水不溶物具有
48、最高的抗氧化活性，且高达未螯合的水解物抗氧化活性的14倍，结果同样为A生育酚的94，80无水乙醇不溶物具有较高的抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的活性。1322螯合物抗氧化性的研究抗氧化性的研究方法主要有TBA（硫代巴比妥酸）法、抗油脂过氧化LPO法、自由基清除指标法等。221TBA法是基于不饱和脂肪酸通过自由基反应，形成过氧化自由基，而氧化生成环氧化物，后者分解生成丙二醛，丙二醛与TBA作用生成TBA染料，最大吸收波长为535NM。222抗油脂过氧化LPO法生物体内细胞膜的流动性和渗透性由其磷脂等成分保证，过多的自由基袭击、油脂过氧化会导致细胞死亡。因此，抗氧化剂对脂类氧化的抑制作用
49、也显得至关重要。RATHEE等16用老鼠肝脏线粒体作底物，一植物芽体提取物抗脂质过氧化能力为一生育酚水一乙醇提取物甲醇提取物。223自由基清除方法自由基是含有未成对电子的原子、原子团或分子。活性氧如超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢由正常的生理过程和各种外在因素造成。它们一旦产生，就会引发油脂过氧化，与人体很多疾病相关。自由基损伤生物大分子，是衰老衍变的启动。因此，自由基清除能力的测定对生物研究非常重要。2231DPPH2，2一二苯代苦味肼基清除法大部分自由基性质活泼，寿命非常短，但DPPH和ABTS例外，是两种稳定的自由基。DPPH乙醇溶液呈深紫色，在517NM处有一强吸收。若有单电子配对，则吸收消失，其褪色程度与接受的电子数成定量关系，因而可用分光光度法进行定量分析。RATHEE等17用DPPH法的甲醇提取物和水一乙醇提取物的抗氧化性，结果显示甲醇提取物的清除能力IC508334,0391GML优于水一乙醇提取物的清除能力。而其被各种氧化剂生成蓝绿色的自由基阳离，而抗氧化剂的存在又可使ABTS还原，颜色褪去。特征吸收峰下比色，清除能力用TEACTROLOXEQUIVALENTANTIOXIDANTCAPACITY，
