1、本科毕业设计（20_届）生啤酒脉冲强光冷杀菌的研究所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月00目录中英文摘要0前言21脉冲杀菌311脉冲杀菌的发展和现状312脉冲强光杀菌的原理313影响脉冲强光杀菌效果的因素314脉冲强光杀菌在水处理的应用42实验421实验材料与仪器设备422高压灭菌5221试管和培养皿的灭菌5222设备的灭菌和清洗523马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基的配制6231培养基成分6232配置方法624脉冲强光灭菌625平板菌落计数626感官评定和营养物质的检测6261感官评定6262营养物质的检测63结果与讨论731鲜啤酒脉冲强光灭菌后的剩余菌量7311静态
2、试验的剩余菌量7312动态试验的剩余菌量732鲜啤酒脉冲强光灭菌后对营养物质的影响7321脉冲强光处理鲜啤酒前后感官评价7322电子鼻数据图与分析833鲜啤酒脉冲强光灭菌后的保质期834最佳灭菌条件的确定94结论9致谢错误未定义书签。参考文献10附录错误未定义书签。11摘要脉冲强光冷杀菌技术是利用强烈白光闪照杀菌的，杀菌效果极好，不会破坏食品原有的营养物质和风味物质。本研究的目的是将脉冲强光杀菌技术应用于生啤酒，满足消费者对自然、卫生、安全营养、有益于健康的啤酒的追求，为将来新鲜啤酒的长时间保存在工业生产和商业上的应用奠定一定的基础；研究的方法是通过杀菌后剩余菌量的测定，以及杀菌后风味物质和营
3、养物质的检测，确定最佳的杀菌条件，并测定保质期限；研究的结果是杀菌后生啤酒的营养物质和风味物质均无明显变化，并且保留的部分活性酵母，是很有优势的生啤酒冷杀菌方法。关键词生啤；脉冲强光；灭菌；应用ABSTRACTPULSEDLIGHTISTHEUSEOFCOLDSTERILIZATIONSTERILIZATIONSTRONGWHITELIGHTFLASHES,ANDSTERILIZATIONISVERYEFFECTIVE,WILLNOTDAMAGETHEORIGINALNUTRIENTSANDFOODFLAVORTHEPURPOSEOFTHISSTUDYISTHEPULSEDLIGHTSTERI
4、LIZATIONTECHNOLOGYFORBEER,MEETCONSUMERDEMANDFORNATURAL,HEALTH,SAFEANDNUTRITIOUS,WHOLESOMEPURSUITOFBEER,FRESHBEERFORALONGTIMETOSAVETHEFUTUREININDUSTRIALPRODUCTIONANDCOMMERCIALAPPLICATIONTOLAYAFOUNDATIONRESEARCHMETHODISTHROUGHTHEREMAININGBACTERIAAFTERSTERILIZATIONCONTENTS,ANDSTERILIZATIONFLAVORANDNUTR
5、IENTSOFTHETESTING,TODETERMINETHEOPTIMALSTERILIZATIONCONDITIONS,ANDDETERMINATIONOFSHELFLIFEAFTERTHERESULTSOFTHESTUDYISTHESTERILIZATIONOFNUTRIENTSANDFLAVOROFDRAFTBEER,NOSIGNIFICANTCHANGESINMATERIAL,ANDRETAINEDBYTHEACTIVEYEAST,ISTHEGREATADVANTAGEOFTHEBEERCOLDSTERILIZATIONMETHODKEYWORDSDRAFTBEERPULSEDLI
6、GHTSTERILIZATIONAPPLICATIONS220前言近30年来，我国啤酒产量保持了高速增长的势头，复合年均增长率达到了近15。2010年，我国实现啤酒产量4483万千升，比2009年增长63，连续9年稳居啤酒产量世界第1位1。同时，随着人类科技进步、人们生活水平和文化水平的提高，越来越多的消费者追求口感新鲜、自然、安全营养、有益于健康的饮品2。生啤酒是不经过传统高温杀菌的啤酒，能满足消费者对口感和营养的需求，但是生啤的货架期不长，阻碍了生啤的发展。近年来，越来越多的研究人员开始将目光转向非热力杀菌技术，脉冲强光杀菌技术就是其中之一。脉冲强光杀菌是一种利用强烈白光闪照的杀菌技术，其
7、系统主要包括动力单元和灯单元，动力单元为惰性气体灯提供能量，灯便放出只持续数百微秒，其波长由紫外光区域至近红外光区域的强光脉冲，其光谱与太阳光相似，但比阳光强几千倍至数万倍。由于只处理食品表面，从而对食品营养成份影响很小3。上世纪90年代末，广州珠江啤酒厂率先推出了“纯生”啤酒。之后在中国啤酒界掀起了一股“纯生”热。短短几年，“纯生”热己开始降温，依靠“纯生”啤酒获得利润的厂家也为数不多。究其原因有几点其一，啤酒酿造过程本来就应是在纯净化条件下完成的，但是中国啤酒真正发展起来是在改革开放以后，大多数啤酒厂缺乏纯净化生产的理念和条件，微生物管理上也不到位，因此，严格意义上的生啤酒生产在中国仍有一
8、段距离；其二，生啤酒的货架期限短，生啤酒的销售范围有限，受地域限制较大。啤酒的纯净化酿造，指的是原材料纯净化和酿造生产纯净化，是一项系统工程。其不仅取决于原材料和装备，而更重要的是取决于酿造过程中的微生物管理。口味新鲜、口感纯正、营养丰富，是其追求的目标。至于酿造后的处理方法，取决于啤酒的种类和市场4，无论哪种处理方法都只可能提高啤酒的生物、理化和口感的稳定性，而不可能改善啤酒的口味和口感。所以，口味和口感最好的啤酒是纯净化酿造后未经终端处理的啤酒，即含有部分活酵母的鲜啤酒。但是啤酒的口味和口感与啤酒商品的货架期，始终是矛盾的5，延长货架期是以损失口味和口感为代价而获得的。啤酒纯净化酿造是决定
9、啤酒的口味和口感的决定性因素，是我国啤酒工业改造和进一步发展的方向。生啤酒是经过无菌酿造、无菌过滤和无菌灌装生产，不经巴氏杀菌的啤酒6，具体流程如下原料（大米、麦芽）的粉碎糖化发酵过滤灌装。同时还需要完善的CPI系统对生产各个环节进行清洗，完善的微生物检测系统对全过程进行严格的检查和监控。因此，生产生啤酒对工艺技术、设备状况、卫生管理的要求比较高，严格的微生物管理贯穿于整个生产过程。啤酒终端处理主要是去除或杀死啤酒酵母菌，以阻止生化反应的延续。从理论上来说，任何可阻止生化反应进行的手段都可采用，但对食品而言适宜采用物理方法。目前，作为啤酒除菌方法主要有两大类三种方法，即巴氏杀菌和膜过滤除菌，其
10、中，巴氏杀菌在工艺上又分为两种方法，前杀菌也叫瞬时灭菌和后杀菌。前杀菌是指产品在灌装入容器之前进行短时高温加热处理实现灭菌目的，不再需要杀菌机，但是从瞬时灭菌后到进入灌装，此段过程要求运行在无菌状态，以防止被再次污染，因此对后续的灌装过程要求较高；后杀菌目前用得较多，即利用隧道式杀菌机进行杀菌7。另一除菌方法是膜过滤除菌法。用此种方法不再33需要巴氏杀菌，对啤酒的原有风味没有大的损害，但和“前杀菌”一样，它也要求后续运行过程应在无菌状态下，防止二次污染，这对工作环境都提出了较高的要求8。针对我国生啤酒发展的现状，针对啤酒生产纯净化仍有一段距离的现实，我们希望通过脉冲强光冷杀菌这一技术应用于生啤
11、酒的杀菌，在现有的生产条件下，生产出既能符合消费者需求，又有较长货架期的生啤酒，实现生啤酒的跨地区销售，进而提高企业改善现有生产条件的实力，将啤酒纯净化生产做大做强，从而达到推动生啤酒业发展的目的。1脉冲杀菌11脉冲杀菌的发展和现状脉冲强光杀菌技术开始主要应用在医药卫生领域医疗器械表面杀菌消毒和透明药剂溶液菌9，取得了比较显著的杀菌效果，随着该杀菌技术和设备的成熟，逐渐过渡应用到食品杀菌保藏中，1996年美国食品及药物管理局（FDA）批准采用脉冲强光作为控制食品表面微生物的灭菌手段10。目前国内，对脉冲强光杀菌技术的研究处于初始阶段，主要表现在脉冲强光杀菌技术的研究，脉冲光处理食品及包装物DU
12、RM。1996，脉冲光杀菌新技术在食品及包装中的应用，脉冲强光杀菌技术在食品工业中的应用，脉冲强光杀菌对食品成分的影响及保鲜研究，脉冲强光杀菌对酶的钝化作用研究，自动控制脉冲强光杀菌装置的研制，脉冲强光杀菌在水处理中的应用。12脉冲强光杀菌的原理脉冲强光杀菌是采用脉冲的强烈白光闪照而使惰性气体灯发出与太阳光谱相近，但具有强度更强的紫外线至红外线区域光来抑制食品和包装材料表面、固体表面、气体和透明饮料中的微生物的生长繁殖。JOSEPHDUNN11等的研究表明脉冲强光对多数微生物有致死作用12。细菌、酵母菌等微生物都是由水、蛋白质、碳水化合物、脂肪和无机物等复杂化合物构成的一种凝聚态物质。脉冲强光
13、有一定的穿透性，当闪照时，脉冲强光作用于其活性结构上，使形成如单链断裂和嘧啶二聚体在酵母细胞中形成的DNA损伤13，以及细胞膜蛋白质及蛋白质和其他大分子修饰等结构变化，包括液泡膜膨胀和歪曲等14，从而使细胞失去生物活性，达到杀菌的目的。周万龙设计的脉冲强光技术对微生物和钝化酶的效果显著，其研究结果表明1随着闪照次数的增加，残余菌数明显减少。枯草芽孢杆菌起始浓度2L05个ML时，输入190V电压，闪照间隔为6S，高压脉冲触发宽度为20S，闪照30次后，残余菌数为0。2脉冲强光对微生物致死作用明显，可进行彻底杀菌。对不同的食品，不同种类的微生物，需要控制不同的条件。光照脉冲还可钝化液态淀粉酶和蛋白
14、酶，其活力随闪照次数的增加而降低15。13影响脉冲强光杀菌效果的因素被处理对象的物态。国内有人研究发现，脉冲强光能降低液态淀粉酶和蛋白酶的活力，而对固态淀粉酶和蛋白酶活力的影响很小。其原因可能是固态淀粉酶、蛋白酶被闪照时是以细小颗粒存在，光对其穿透性弱，只能作用到其表面，故对其活力及结构都无大的影响。闪照次数、输入电压和闪光间隔。通过研究发现影响淀粉酶活力的主次因素依次是闪照次数、输入电压、闪光间隔。闪照次数是影响酶活力的最大因素。闪照次数越多，酶活下降越大。分段闪照对酶的活力影响不大16。因此，在保证同样的杀菌效果下，可以对设备的要求有所降低，以及在实际生产中可前后安排多台设备以达到要求。脉
15、冲装置中受照射物体离光源的距离、触发脉冲宽度等参数也影响杀菌效果。4414脉冲强光杀菌在水处理的应用脉冲强光是处理罐装或配料水的有效手段。因为它对多数微生物有致死作用，如枯草芽孢外菌、大肠杆菌、酵母，可应用于含大量大肠杆菌的普通水处理中17。实验室演示脉冲强光可高度灭活水中的陆生克雷伯杆菌KLEBSIEUATERRIGENA、似隐球菌小球卵胞菌CRYPTOSPORIDIUMPARICONOOCYTES以及水中其他悬浮微生物，前者是环保部门推荐的检测水的杀菌效果的指标菌；后者则是水中最具抗性的病原菌，氯及传统的紫外线方法都不能杀灭。而经1JCM2的脉冲强光闪光照射一次，由动物试验表明，含似隐球菌
16、小球卵胞菌量达106107的水对大鼠失去了感染力18。2实验21实验材料与仪器设备样品与试剂鲜啤酒（未灭菌）宁波大梁山啤酒厂提供马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基仪器设备脉冲强光杀菌仪宁波纯亮杀菌设备有限公司（定做）；便携式电子鼻德国AIRSENSE公司PEN3；ZHJH1109型超净工作台；LDZX40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌器；LRH190S恒温培养箱；WH861型恒温振荡器；DHG914AS烘箱；SB4200D超声波清洗机；电冰箱。图1脉冲强光杀菌仪脉冲闪照功率18J/次55图2脉冲强光杀菌仪灯管的结构图其原理图17如图3所示图脉冲强光杀菌原理图直流电源向主电容C1充电贮能，同时经电阻
17、R2和R3组成分压器向触发器电容C2充电，当开关S闭台后，C2放出的电能与脉冲变压器构成点振荡，在次级产生具有一定能量的高频高压脉冲触发丝口使灯光由惰性气体电离，贮在C1的电能迅速通过脉冲灯释放出来，形成强光。22高压灭菌221试管和培养皿的灭菌（1）选取适当培养皿和试管；有些试管须加9ML）蒸馏水包好（2）高压灭菌锅121摄氏度灭菌30MIN；（3）之后将培养皿在烘箱下烘干试管在常温下待冷却（4）取出放置无菌台使用。222设备的灭菌和清洗（1）将设备的4根不锈钢管取下；（2）管口的橡皮圈拿下先用自来水清洗，再放置沸水中煮沸10分钟；（3）将4根不锈钢管放入高压灭菌锅121摄氏度灭菌30MIN
18、；（4）灭菌结束后，取出，冷却数分钟后将橡皮圈放入管口，对设备进行连接，用保险膜对出口和进口进行密封；（5）取2个物料罐，先用自来水进行冲洗，后用蒸馏水进行润洗；（6）加入4L蒸馏水，用油皮纸包好出口和进口，高压灭菌锅115摄氏度灭菌20MIN（为了防止物料罐变形）；（7）灭菌结束后，取出，进料罐先与高压泵再与设备连接；66（8）将设备中的灭菌装置与电压装置连接，插上电源；（9）按下灭菌按钮和高压泵开关，先用2次/秒的闪照频率让装置稳定运行，再用5次/秒的闪照频率对灭菌装置进行灭菌5分钟，然后用灭菌水先对装置进行冲洗，流速控制在6升/分，继续用5次/秒的闪照频率灭菌；（10）冲洗一次完毕后，再
19、用出料罐中的灭菌水进行第二次冲洗，冲洗完毕后，将出料罐连接至装置出料口，关掉高压泵和灭菌装置，等待实验。23马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基的配制231培养基成分马铃薯100G、葡萄糖10G、琼脂89G、水500ML、自然PH。232配置方法（1）配制20马铃薯浸汁取去皮马铃薯100G，切成小块，加水500ML。煮沸20分钟，用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。（2）配制时，按每500ML马铃薯浸汁加入10G葡萄糖，加热煮沸后加入89G琼脂，继续加热融化并补足失水。（3）分装、加塞、包扎（4）高压蒸汽灭菌115摄氏度灭菌20MIN。24脉冲强光灭菌（1）开启灭菌装置和高压泵，流速控制在3升/分
20、，闪照次数控制在5次/秒，让进料罐中的酒液全部通过灭菌装置后，关闭灭菌装置和高压泵，为一次灭菌进程；（2）重复以上操作数次，第一次先做静态杀菌，分别取灭菌0，3，6，9分钟后的样液进行细菌计数；动态杀菌取杀菌，3，6，9次后的样液进行细菌计数；（3）灭菌完毕后，将酒液处理掉，再用自来水对装置冲洗数次，待出液澄清为止，关闭灭菌装置和高压泵，拔掉电源开关，断开灭菌装置与电压装置的连接，用保鲜膜对出口和进口密封，等待下次实验前的灭菌和清洗25平板菌落计数（1）用移液枪移取1ML原液，沿管壁徐徐注入含有9ML无菌水的试管内，振摇试管混合均匀，制成110的稀释液，做好标记；（2）稀释到102就可以了，每
21、个稀释度做三个平皿（注意不要染菌）；（3）将凉至40的PDA培养基（不烫手即可）注入平皿约1315ML，并转动平皿，混合均匀。同时将PDA培养基倾入加有1ML稀释液的灭菌平皿内作空白对照；（4）待琼脂凝固后，翻转平板，置371温箱内培养48小时；（5）培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，不要遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品中每ML中的菌落数，进行分析报告。26感官评定和营养物质的检测261感官评定取3个试管的杀菌时间为0MIN、3MIN、6MIN、9MIN的啤酒样品，分别置于温度为0的环境下，每天都观察，记录下啤酒变质的时间和状态。
22、262营养物质的检测用便携式电子鼻检测啤酒的营养物质在杀菌前后是否发生变化。773结果与讨论31鲜啤酒脉冲强光灭菌后的剩余菌量为了使研究更严谨周密，我们进行了静态试验和动态试验，根据杀菌效果进行比较，并结合生产实际确定其可行性。311静态试验的剩余菌量表1静态试验的剩余菌量闪照频率0MIN3MIN6MIN9MIN3次/S剩余菌量（CFU/ML）2201751431124次/S剩余菌量（CFU/ML）220164132825次/S剩余菌量（CFU/ML）22015511443从表1可以看出，脉冲光的闪照频率为5次/S时的剩余菌量最少，即杀菌效果越好；同等闪照频率的条件下，闪照时间越长剩余菌量越少
23、，即杀菌效果越好。但是最佳杀菌条件要根据生啤酒杀菌后的颜色、风味、营养物质等的变化情况来确定。312动态试验的剩余菌量表2动态试验的剩余菌量闪照频率0MIN3MIN6MIN9MIN3次/S剩余菌量（CFU/ML）2201801621304次/S剩余菌量（CFU/ML）220172144955次/S剩余菌量（CFU/ML）22015812961注动态试验由于实验室设备条件有限，无法实现连续循环的杀菌，因此在试验过程中，由于接口的不断打开，使生啤酒容易受空气中细菌的影响，效果略逊于静态试验。经脉冲强光灭菌后，平板上没有出现杂菌，且随着闪照时间和闪照频率的提高，酵母菌落的数量随之减少，即杀菌效果越好
24、。由于啤酒原液的穿透率没有稀释后的啤酒高，因此酵母菌仍能保存一定的量，能够符合人们对生啤酒口感和营养的要求。32鲜啤酒脉冲强光灭菌后对营养物质的影响由于动态试验会受杂菌影响，因此灭菌后对营养物质的影响的测定我们采取经静态杀菌后的生啤酒作为样品。321脉冲强光处理鲜啤酒前后感官评价取灭菌时间分别为0MIN、3MIN、6MIN和9MIN的生啤酒三分之一试管，进行感官评定。首先，观察颜色是否发生变化；其次，检验风味是否变差，记录下生啤酒颜色、气味、温度的变化情况，进行综合评价。表3脉冲强光处理鲜啤酒前后感官评价杀菌时间/MIN颜色气味温度综合评价/分0正常正常正常103无变化无变化无变化96无变化微
25、小变化，能接受升高0579无变化有点臭氧的味道升高26表3为鲜啤酒杀菌后的感官评价，其中综合评价是10名较专业人评价的平均值。从表3我们可以看出，杀菌时间为3MIN时颜色、气味、温度均未发生变化；杀菌时间88到6MIN时颜色无变化，但是气味发生微小变化，并且温度也开始变化，升高05；杀菌时间到9MIN时，有臭氧的味道，表明虽然杀菌时间越长杀菌效果越好，但是到达一定程度时开始对生啤酒的成分、风味出现负面影响，因此杀菌时间不宜超过3MIN。322电子鼻数据图与分析对不同脉冲强光条件处理后的鲜啤酒进行电子鼻检测，用PCAPRINCIPALCOMPONENTANALYSI，主成分分析法分析法如下图图4
26、鲜啤脉冲强光处理前后电子鼻检测结果注图中0、3、6、9分别代表脉冲强光处理时间为0MIN、3MIN、6MIN、9MIN后的样品。表4不同时间脉冲强光处理鲜啤后差异度处理时间/MIN03690007600940282300760035011260094003500239028201120023从图4可以看出，啤酒经过0MIN，3MIN，6MIN，9MIN处理后，主成分（X轴）基本没变，次要成分（Y轴）变化较大，杀菌0分钟的和3分钟的有交集，说明有相似的物质，3分钟和6分钟的有交集，6分钟和9分钟的有交集，说明他们有共同的物质，但与其他处理时间没有交集，也就是说一些物质发生了变化。从表4中的数据（
27、不同处理时间下的差异度）可以得出，经过3、6、9分钟处理后，与原样（0分钟）基本没变（D05），属于同一种物质类别。同时随着处理时间延长，差异度越大。33鲜啤酒脉冲强光灭菌后的保质期由于动态试验会受杂菌影响，因此保质期的测定我们采取静态试验。取灭菌时间分别为990MIN、3MIN和6MIN的生啤酒三分之一试管，置于0保存观察。每半天观察一次，看颜色是否发生变化，颜色有变化的再继续检验看风味是否变差，记录下生啤酒变质的时间点，保存变质了的生啤酒，继续观察。表5脉冲强光处理鲜啤后0保存天数与品质变化杀菌时间/MIN保存时间/D123456780正常正常正常开始变坏变坏变坏变坏变坏3正常正常正常正常
28、正常开始变坏变坏变坏6正常正常正常正常正常正常正常开始变坏从表5我们可以看出，灭菌时间为0分钟即未经杀菌的啤酒，其在0的条件下可保存3天，灭菌时间为3分钟的啤酒可保存5天，灭菌时间为6分钟的生啤酒可保存7天。变质后的生啤酒也没有发生新的变化。34最佳灭菌条件的确定结果表明鲜啤经过频率为5次/S闪照处理3分钟后，酵母菌在啤酒中的含量从220CFU/ML降至175CFU/ML，0下啤酒保质期延长3天。同时通过感官评定和电子鼻检测，发现在上述冷杀菌条件下处理后的鲜啤酒风味无显著变化。4结论脉冲强光这个新的杀菌技术，使用起来非常强大，它的高峰值功率脉冲光，对高度污染非常有效，能严重损害孢子，病毒和虫卵
29、等这些抗紫外线能力很强的真菌，同时，由于脉冲光的穿透性弱，只能作用于表面，因此，脉冲强光是处理罐装或配料水的有效手段，将脉冲强光杀菌技术应用于生啤酒的杀菌的可行性就在于此。从目前的结果，可以清楚的看出，脉冲强光杀菌，确实实现了对生啤酒的杀菌，并且酵母菌在啤酒中的含量从220CFU/ML降至175CFU/ML，即保留了活性酵母，也延长了生啤酒的保质期。从实验结果我们可以看出，脉冲强光杀菌杀菌能力强，与现有两种啤酒杀菌方法相比较优势明显。首先，所需设备简单，成本低，据保守估计实际应用中包括设备固定投资、灯的替换、电能及维修费,折合所耗总功率为4JCM2，那每平方英尺处理面积的生产成本还不到一美分1
30、9；其次，此法不像巴氏杀菌需要加热，能耗低，也不需要像膜过滤杀菌繁琐高要求的清洗，对环境不造成污染；再者，经试验杀菌后的啤酒风味不会有明显变化，营养物质也基本保持不变。脉冲强光杀菌在啤酒中的应用，给处于发展水平不是很高、缺乏纯净化生产的理念和条件，微生物管理上也不到位的中国啤酒产业提供了一个新的发展路径，通过本试验，我们确定了脉冲强光冷杀菌在啤酒中应用的最佳杀菌条件，为将来新鲜啤酒的长时间保存在工业生产和商业上的应用奠定一定的基础。脉冲光的穿透率不是很高，超出一定的穿透范围杀菌效果将会受到限制，对于不同品种的啤酒的杀菌条件还需要进一步的研究和确定。要实现脉冲强光杀菌真正应用于啤酒生产，还需要更
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