1、本科毕业设计（20_届）双酶法对乌贼眼中透明质酸提取率的影响所在学院专业班级食品质量与安全学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言111透明质酸性质112透明质酸提取现状113本文的主要研究内容及意义22材料与方法221材料与设备2211材料2212设备222方法2221酶活力测定2222葡萄糖醛酸标准曲线制作4223透明质酸粗品的制备工艺5224透明质酸的纯化工艺5225透明质酸含量测定5226透明质酸紫外光谱53结果与讨论531中性蛋白酶的工艺条件532链霉菌蛋白酶酶解条件优化5321酶解时间6322酶解温度6323酶解PH7324酶浓度833酶法提取透明质酸的正交试验834透明质酸
2、紫外光谱94小结11致谢12参考文献131摘要透明质酸是生物体内普遍存在的酸性黏多糖，具有独特的黏弹性、生物相容性及非免疫原性，在生命科学、食行业以及医学领域都有较为广泛的应用。本文对乌贼眼液进行双酶提取，首先使用4中性蛋白酶在60C下进行4H的酶解，然后用链霉菌蛋白酶进行二次酶解，再通过CTAB络合，乙醇沉淀得到最终透明质酸。最后通过正交实验，优化了链霉菌蛋白酶提取透明质酸的最佳工艺条件，实验结果表明，在酶用量6，PH为7,酶解时间4H，酶解温度为55时，此时透明质酸的紫外吸光度为11970，得到的透明质酸提取率为1246，通过紫外可见光谱对比可看出提取得到的透明质酸纯度较好。关键词透明质酸
3、；提取；链霉菌蛋白酶；乌贼ABSTRACTHYALURONICACIDISORGANISMSWIDESPREADACIDICSTICKYPOLYSACCHARIDE,HASAUNIQUEVISCOELASTIC,BIOCOMPATIBLEANDNONIMMUNOGENIC,INLIFESCIENCES,FOODINDUSTRYANDMEDICALDOMAINHASAWIDERANGEOFAPPLICATIONSINTHISPAPER,THETWOENZYMESEXTRACTEDSQUIDEYEDROPS,FIRSTTOCONDUCTANEUTRALPROTEASEENZYMEENZYMECON
4、CENTRATIONWAS4,TEMPERATUREOF60C,ENZYMEEXTRACTIONTIMEWAS4HUSINGCRUDEEXTRACTOBTAINEDBYHAINTERMEDIATEGOODS,THENASECONDPROTEASEENZYMESTREPTOMYCES,ANDTHROUGHTHECTABCOMPLEXATION,ALCOHOLPRECIPITATIONFORTHEULTIMATEHYALURONICACIDEXPERIMENTATATEMPERATUREOF55C,PH7,ENZYMEEXTRACTIONTIMEWAS4H,THEENZYMECONCENTRATI
5、ONWAS6,ATTHISTIMEOFHYALURONICACIDULTRAVIOLETABSORBANCE11970,GETTO1246EXTRACTIONRATEOFHYALURONICACID,ANDCANBESEENTHROUGHTHEUVSPECTRAOFHYALURONICACIDEXTRACTEDPURITYBETTERKEYWORDSHYALURONICACIDEXTRACTIONSTREPTOMYCESPROTEASESQUID11引言11透明质酸性质透明质酸是一种由DN乙酰氨基葡萄糖和D葡萄糖醛酸为结构单元的高分子粘多糖，由于直链轴上单糖之间氢键的作用，透明质酸分子在空间上
6、呈刚性的螺旋柱型1，柱的内侧由于存在大量的羟基而产生强烈的亲水性；同时羟基的连续定向排列，又在分子链上形成高度的憎水区，HA分子的亲水和憎水特性，使得浓度低于1的HA也能形成连续的三维蜂窝状网络结构，水分子则在网络内通过极性键和氢键与HA分子相结合，使得这些水在柱内固定不动，不易流失，HA亲和吸附的水分约为其本身重量的1000倍，这是其它粘多糖无法比拟的。HA具有独特的分子结构和理化性质，它在有机体内显示出多种重要的生理功能，具有特殊的保湿作用；分子量大的可在皮肤表面形成膜状，起到比较强的保湿润滑作用，而且分子量小的还能被皮肤吸收进入真皮层，促进人体血液循环、改善中间代谢等，从而使皮肤变得光滑
7、、柔嫩2，而且透明质酸无致炎性及抗原性，是理想的“粘性手术”材料，对眼科、骨科手术的完成和康复起重要作用3，所以被广泛应用于化妆品、医药等方面。但是EGURA4和TMIYAZAKI5等人的研究表明，透明质酸的构想受温度、PH、外界机械剪应力以及盐浓度的影响，因此在获得相对分子量分布带比较窄的的透明质酸时需要控制好各个实验条件。12透明质酸提取现状透明质酸广泛分布于各种动物组织中，而且不同的动物组织中得到的与细菌发酵得到得透明质酸无种属差异6。目前所了解的制备透明质酸的方法主要有两种，一种是从动物组织中提取，一种是从微生物发酵液中提取7。国内大多从鸡冠以及动物眼球等组织中提取透明质酸。但是动物组
8、织提取法所得的HA的纯度相对不是很高，而且生产效率低、成本高，其原料来源也受限制。虽然该法有很多缺陷，但它仍然是现今生产医学用HA主要的方法8。HA制备的方法目前主要有组织提取法、细菌发酵法和人工合成法。组织提取法的工艺流程比较简单，获得的HA分子量也较大，一般大于60万，且其粘度高，保湿性能好。透明质酸在动物组织中的分布很广泛，几乎所有的动物组织中都含有一定水平透明质酸，只是含量不同而已。目前我们已从下列组织中分离出了透明质酸结缔组织、脐带、皮肤、人血清、鸡冠、关节滑液、脑、软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、兔卵细胞、动脉和静脉等，但考虑到原料中透明质酸含量的高低、数量的多少和提取难易的程度等因素
9、的影响，能够真正投于生产的原料主要为鸡冠、人脐带和动物眼球，同时HA又还与硫酸软骨素等粘多糖共存于生物组织中，这就导致了透明质酸提纯难度加大，生产成本也比较高910。姚美琴等11采用水提醇沉，等电点法脱蛋白质与超滤相结合的加工工艺，运用正交实验法对提取工艺参数进行优化，制备得到的透明质酸为白色粉末，得率为296。酶法提取一般有单酶提取和双酶提取两种，但由于蛋白酶不能断裂糖肽键及其附近的肽键，因此为去除生成物中较长的肽段在不改变糖链结构的前提下，可先采用碱提法或GDNHCL抽提法1214,再用两种或两种以上的酶水解,能有效地提高粘多糖的得率。所得的多糖提取液有的因粘稠，常常用离心法除去不溶物。郭
10、育涛15，赵玉红16等人用胰蛋白酶水解动物组织，得到纯度较好的HA；汪建等17人采用粗胰蛋白酶水解鸡冠，并分批次加入酶，水解效果较好。此外常见的水解酶还有木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、和链霉菌蛋白酶等。酶法脱蛋白效果较好，损失率低，但酶解强度不宜过大、时间不宜过长，否则易使太多多糖蛋白质的复合物分解，造成某些多糖蛋白质复合物特有的生理活性降低18,192透明质酸无种属差异，不同动物组织提取的透明质酸，在化学本质和分子结构上是一致的，只是相对分子质量（R）有差别。13本文的主要研究内容及意义以乌贼眼球为原料提取透明质酸方面的研究在国内未见报道，而乌贼眼睛是一类数量巨大的废弃物，相对于其他鱼眼较大，晶状体
11、所占体积也大。在水产品加工过程中产生大约1540的下脚料，其中鱼眼约占25，所以如何从废弃的乌贼眼球中提取透明质酸，进行科学的综合利用，变废为宝是一件非常有意义的事。本研究以乌贼鱼眼为原料，研究了乌贼眼透明质酸的提取工艺，使乌贼资源得以合理开发利用，从而利于提高其加工的综合效益及经济附加值，变废为宝。本实验确定了最佳提取工艺以透明质酸得率为指标，通过单因素和正交试验考察了酶解时间、PH值、酶解温度、酶用量对HA提取率的影响，并优化了工艺参数。2材料与方法21材料和设备211材料乌贼来自宁波庄市菜市场，清洗破碎，收集眼睛中的液体，除去泥沙、色素等沉淀后备用。中性蛋白酶（20万U/G，南宁庞博生物
12、工程有限公司），链霉菌蛋白酶（4000U/G，北京奇松生物有限公司进口分装），葡萄糖醛酸，其余试剂均为分析纯212设备电子分析天平，梅特勒托利多仪器（上海）有限公司；DKS24型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；冷冻高速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；T6新锐可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；CARY100紫外分光光度计，美国VARIAN公司。22方法221酶活力测定202211试剂福林试剂FOLIN试剂于2000ML磨口回流装置内，加入钨酸钠NA2WO42H2O100G，钼酸钠NA2MOO42H2O25G，蒸馏水700ML，85磷酸50ML，浓盐酸100ML，文火回
13、流10H。取去冷凝器，加入硫酸锂LI2SO450G，蒸馏水50ML，混匀，加入几滴液体溴，再煮沸15MIN，以驱逐残溴及除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴溴液，再煮沸除去之。冷却后，定容至1000ML，用细菌漏斗过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。04MOL碳酸钠溶液称取无水碳酸钠NA2CO3424G，定容至1000ML。04MOL三氯乙酸TCA溶液称取三氯乙酸CCL3COOH654G，定容至1000ML。PH72磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠NAH2PO42H2O312G，定容至1000ML，即成02MOL溶液A液。称取磷酸氢二钠
14、NA2HPO412H2O7163G，定容至1000ML，即成02MOL溶液B液。取A液28ML和B液72ML，再用蒸馏水稀释1倍，即成01MOLPH72的磷酸盐缓冲液。2酪蛋白溶液准确称取干酪素2G，称准至0002G，加入01MOL/L氢氧化钠10ML，在水浴中加热使溶解必要时用小火加热煮沸，然后用PH72磷酸盐缓冲液定容至100ML即成。配制后应及时使用或放入冰箱内保存。3100G/ML酪氨酸溶液精确称取在105烘箱中烘至恒重的酪氨酸01000G，逐步加入6ML1MOL/L盐酸使溶解，用02MOL/L盐酸定容至100ML，其浓度为1000G/ML，再吸取此液10ML，以02MOL/L盐酸定容
15、至100ML，即配成100G/ML的酪氨酸溶液。2212标准曲线的绘制分别吸取不同浓度酪氨酸1ML，各加入04MOL碳酸钠5ML，再各加入已稀释的福林试剂1ML。摇匀置于水浴锅中。40保温发色20MIN在660NM波长测OD值。一般测三次，取平均值，同时做空白试验。所得酶活力标准曲线回归方程为Y00115X00145，相关系数R09987，其中，Y吸光度；X酪氨酸浓度UG/ML，绘制标准曲线见图1。Y00113X00013R209992002040608112020406080100120酪氨酸浓度（）吸光值OD图1酪氨酸标准曲线FIG1STANDARDCURVEOFENZYMEACTIVIT
16、Y2213样品测定称取酶粉0100G，加入PH72磷酸盐缓冲液定容至100ML，吸取此液5ML，再用缓冲液稀释至25ML，即成5000倍的酶粉稀释液。取样品稀释液1ML，置于40水浴中预热2MIN，再各加入经同样预热的酪蛋白1ML，精确保温10MIN，时间到后，立即再各加入04MOL三氯乙酸2ML，以终止反应，继续置于水浴中保温20MIN，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取滤液1ML，再加04MOL碳酸钠5ML，已稀释的福林试剂1ML，摇匀，40保温发色20MIN后进行光密度OD测定。空白试验测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加04MOL三氯乙酸2ML，使酶失活，再加入酪蛋白。计算方法为在4
17、0下每分钟水解酪蛋白产生1G酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。样品蛋白酶活力单位干基10A4NW11式中A由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数或OD值K；44ML反应液取出1ML测定即4倍；4N酶液稀释的倍数；10反应10MIN；W样品水分百分含量。222葡萄糖醛酸标准曲线制作2221标准曲线的制作精密称取葡糖醛酸AR20MG，置100ML量瓶中，加水溶解至刻度，摇匀备用。精密量取标准溶液05、10、15、20、25ML，分别加入10ML量瓶中，加水稀释至刻度，得10、20、30、40和50G/ML浓度的对照品溶液。取6只具塞刻度试管分别加入硼砂硫酸液5ML，置冰浴中冷至4左右。然
18、后分别取空白溶液蒸馏水和不同浓度的对照品溶液各1ML加入试管中，先轻轻振摇，再充分混匀，并不断用冰浴冷却，将试管置沸水中加热10MIN，置常水中冷至室温。加入咔唑试剂02ML，混匀，水浴中再加热15MIN，冷至室温。在530NM处测定吸收度，以吸收度对浓度作图即可绘出标准曲线,或作直线回归数据处理,计算出吸收度和浓度的线性回归方程CBKA，B截距，K斜率。所得标准曲线回归方程为Y00130X00136，相关系数R09963，其中，Y吸光度；X葡萄糖醛酸浓度UG/ML，绘制标准曲线见图2。Y0013X00136R209963001020304050607080102030405060葡萄糖醛酸浓
19、度（UG/ML）吸光值图2葡萄糖醛酸标准曲线FIG2STANDARDCURVEOFGLUCURONICACID样品的测定取待测样品溶液1ML，按照绘制标准曲线的方法测定吸光度。从标准曲线上查出相应的葡糖醛酸浓度。按照下式计算得透明质酸得率（以干重计）透明质酸提取率（）50000084461000）葡萄糖醛酸含量（1）2222样品测定取本品01G/L的溶液1ML，照标准曲线项下的方法测定吸收度。从标准曲线上查出相应的葡糖醛酸浓度，按（1）式计算含量。223透明质酸中间品的制备工艺5乌贼眼液盐提中性蛋白酶一次酶解双氧水脱色乙醇沉淀沉淀真空冷冻干燥透明质酸中间品224透明质酸的纯化工艺透明质酸中间品
20、溶解链霉菌蛋白酶二次酶解CTAB络合乙醇沉淀沉淀真空冷冻干燥透明质酸多糖粗品2241链霉菌蛋白酶二次酶解将透明质酸中间品配置成5103G/ML浓度的溶液，酶解时吸取10ML样液置于锥形瓶中，与链霉菌蛋白酶在选择的条件下充分反应，然后沸水浴酶灭活10MIN，离心取上清液。2242CTAB络合在所得的上清液中,加入等体积的质量体积分数为1的CTAB溶液,形成絮状络合物静置过夜,使络合完全以6000R/MIN离心10MIN,将沉淀溶于15MOL/L的NACL溶液中,以相同条件离心除去不溶物取上清液加35倍体积的95浓度的乙醇使多糖沉淀。225透明质酸含量测定葡萄糖醛酸含量采用BITTERMUIR咔唑
21、法测定，经换算得到样品中HA的含量。226透明质酸紫外光谱将上述纯化得到的样品溶解于水中，利用紫外分光光度计在紫外波长下扫描。3结果和讨论31中性蛋白酶的工艺条件本实验在中性蛋白酶与链霉菌蛋白酶双酶解技术，首先将乌贼眼液先用02MOL/L的NACL溶液盐提4H，加入4的中性蛋白酶，在60C下酶解4H，沸水浴中灭酶10MIN后，离心取上清液。加双氧水脱色后用乙醇沉淀，然后将沉淀进行冷冻干燥得到透明质酸的中间品21。采用中性蛋白酶一次酶解效果较好，但是提取得到的透明质酸的纯度偏低。32链霉菌蛋白酶酶解条件优化在中性蛋白酶酶解的基础上使用链霉菌蛋白酶进行二次酶解，并对影响链霉菌蛋白酶提取乌贼眼中透明
22、质酸的因素进行重点研究。本实验对链霉菌蛋白酶提取透明质酸的时间、温度、PH值和酶添加量等因素进行了优化，选取酶解时间210H，PH值6585，酶解温度3060与酶用量210等条件，以HA提取率为考察指标进行单因素和正交实验，确定提取的最佳工艺条件。321酶解时间在链霉菌菌蛋白酶用量为1，酶解温度45，自然PH的条件下，在酶解时间210H范围内浸提，比较不同酶解时间对HA提取率的影响，以选择最佳酶解时间。结果如图3。602468101214024681012酶解时间HHA提取率（）0920930940950960970980991101102103紫外吸收值HA提取率（）紫外吸收值图3酶解时间对
23、透明质酸提取率的影响FIG3THEINFLUENCEOFEXTRACTIONTIMEONTHEYIELDINGRATEOFHA图3表明，酶解时间为4H时，透明质酸提取率最高1197，水解时间进一步延长，透明质酸提取率反而下降。理论上讲，反应时间越长，酶解越充分，HA提取率越高，而当酶浓度达到一定值时，酶促反应时间的延长并不能使提取率增加甚至会引起下降，这说明在4H时间里酶解反应已经进行的较为充分。而且链霉菌蛋白酶具有高度专一性，随着水解时间的延长，蛋白酶可水解的肽键减少，同时蛋白酶活力以半衰期方式下降，而且时间太长可能引起糖结构变化甚至使碳环裂解，导致HA提取率下降。这在紫外吸收值中也得到了同
24、样的体现。因此在酶解时间4H选定为最佳酶解时间。322酶解温度在链霉菌菌蛋白酶用量为1，在酶解时间为4H，自然PH的条件下，在酶解温度30C60C范围内浸提，比较不同酶解时间对HA提取率的影响，以选择最佳酶解温度。结果如图4。702468101214203040506070酶解温度HA提取率（）002040608112紫外吸收值HA提取率紫外吸收值图4酶解温度对透明质酸提取率的影响FIG4THEINFLUENCEOFEXTRACTIONTEMPERATUREONTHEYIELDINGRATEOFHA由图5可见，当温度达50，透明质酸提取率最高1226，酶解效果最好。当温度高于50，透明质酸提取
25、率随温度的升高而呈下降的趋势。一是因为温度升高，酶逐渐变性；二是因为透明质酸在温度高的条件下会发生降解，所以反应温度是透明质酸提取率高低的一个重要参数，酶解温度选取50。323酶解PH值在链霉菌菌蛋白酶用量为1，在酶解时间为4H，在酶解温度为45，PH在6585范围内浸提，比较不同酶解PH对HA提取率的影响，以选择最佳酶解PH。结果如图5。0246810126657758859酶解PHHA提取率090920940960981102104106紫外吸收值HA提取率紫外吸收图5PH值对透明质酸提取率的影响FIG5THEINFLUENCEOFPHONTHEYIELDINGRATEOFHA8图5表明，
26、在PH75左右提取率较高，说明酶解作用存在一个最适PH值，在最适范围内提取率相差不大，偏离此PH值，酶的空间构象就会改变，酶活力降低，甚至导致酶变性而失活。另外，酸性或碱性过强均会引起透明质酸自身分解，从而导致透明质酸的含量下降。因此在调试PH时，选择PH75为最适合条件。324酶浓度在酶解时间为4H，自然PH的条件下，在酶解温度为45C，酶浓度210范围内浸提，比较不同酶浓度下对HA提取率的影响，以选择最佳酶浓度。结果如图6。024681012024681012酶浓度（）HA提取率（）1101102103104105106107紫外吸收值HA提取率紫外吸收图6酶用量对透明质酸提取率的影响FI
27、G6THEINFLUENCEOFENZYMEAMOUNTONTHEYIELDINGRATEOFHA如图6所示，当酶浓度在26时，透明质酸的提取率一直在增加，而6酶浓度之后，透明质酸的提取率表现出比较大的下降趋势，因此6的酶浓度作为酶解的最佳酶浓度。酶添加量是影响HA提取率的重要因素，一般来说，酶浓度越大反应速率越快，HA的提取率也应该随之增加，但是在本次试验中，可能由于链霉菌蛋白酶的酶活性非常大，酶浓度在6时达到了一种饱和状态，过多的酶导致透明质酸化学键的不必要断裂而引起透明质酸含量的直接减少。33酶法提取透明质酸的正交实验本试验在单因素实验基础上，考察酶解时间、温度、酶用量、酶解PH四因素对
28、HA提取率的影响。利用L9（34）正交表作正交试验，选取因素水平和结果见表2，方差分析见表3。从表1可以看出，时间对透明质酸提取率的影响最大，其次是PH值，酶浓度和温度影响均很小，酶法提取的最适工艺为A2B1C2D3，即链霉菌蛋白酶酶用量6，PH为7，酶解时间4H，酶解温度为55时，此时透明质酸的紫外吸光度为11970，得到的透明质酸提取率为1246。从表2的方差分析可以看出，时间对透明质酸提取率有显著的影响，加酶量、PH值和酶解温度对透明质酸提取率无显著影响。9表1正交实验结果TAB1RESULTOFTHEORTHOGONALEXPERIMENT实验编号NO因素FACTOR实验结果（紫外吸收
29、值）A加酶量BPH值C时间（H）D温度（C）1141（70）1（2）1（45C）11458212（75）2（4）2（50C）11150313（80）3（6）3（55C）0310542612311970522310316162312114197381320347683213113509332110965均值10857089711410853均值20885085511360868均值30860085003250881极差0028004708160028表2正交实验方差分析表TAB2THERESULTOFANALYSISVARIANCE枯草杆菌蛋白酶偏差平方和自由度F比F临界值显著性加酶量00012
30、04006940PH0004216006940时间132525300006940温度0001204006940误差0014注为具有显著性34透明质酸紫外光谱图图9中的（A）图为乌贼眼液经过中性蛋白酶一次酶解后经等电点去蛋白后得到的透明质酸中间品稀释25倍后的测量得到的紫外可见光谱图，峰出在205NM处，且其在260NM和280NM处有很明显的核酸和蛋白质的吸收峰。图（B）链霉菌蛋白酶二次酶解后稀释25倍测量得到的紫外可见光谱图，峰出在196处，与文献中所描述的透明质酸纯品的出峰点相同，且其杂质峰也明显变小。图（C）是二次酶解后经过CTAB络合和乙醇沉淀后的HA的紫外可见光谱图，图中可看出杂质峰
31、几乎已经消失。由此可得，链霉菌蛋白酶的二次酶解对于透明质酸纯度有很大的影响，并且提纯效果较好。10（A）经过中性蛋白酶酶解得到的透明质酸中间品的紫外可见光谱B中间品经过链霉菌蛋白酶二次酶解后得到得紫外可见光谱C二次酶解后经CTAB络合和醇沉后的HA紫外可见光谱图9透明质酸的紫外可见光谱FIG9ULTRAVIOLETSPECTRAOFHYALURONICACID4小结11本实验通过单因素和正交试验研究了酶解时间、PH值、酶解温度和加酶量对透明质酸提取率的影响，结果表明，采用中性蛋白酶一次酶解时的最佳工艺条件为酶解时间为4H，酶解温度60，加酶量为4，PH为原液PH66；采用链霉菌蛋白酶提取透明质
32、酸的最适工艺条件为酶解时间为4H，酶解温度50，加酶量为6，酶解PH75。在此条件下，得到的透明质酸粗品为浅黄色无定形粉末，均无臭，无味，提取率为1410，且样品分子量及纯度较高，有很大的发展前景。利用紫外可见光谱分析，发现经过二次酶解后的HA纯度增加，在260NM和280NM处核酸和蛋白质的特征吸收峰明显变小。若进行进一步的处理可以使得透明质酸不含蛋白质和核酸杂质。12参考文献1EVEREDD,WHELANJ,EDSTHEBIOLOGYOFHYALURONAN,CIBAFOUNDATIONSYMPOSIUM143MJOHNWILEYSONS,19896152张红霞，徐三魁程宝珠等提取法制备透
33、明质酸的研究J郑州工业高等专科学校学报，2002，18（3）63张彬，周武羊眼透明质酸的制备J食品科技，2004，14EGURA,MHIICKELPJMILLERSPECIFICDEGRADATIONOFRHEOLOGICALHYALURONICACIDANDITSPROPERTIESJPOLYMERDEGRADARIONANDSRABILITY，19982973025MIYAZAKIT，YOMOTAC，OKADASULTRASONICDEPOLYMERIZATIONOFHYALURONICACIDJPOLYMDEGRADSTAB,2001,7477856罗瑞明透明质酸HA的国内外研究现状J宁
34、夏农学院学报，2001，22（1）62647潘虹梅透明质酸的研究现状综述J四川食品与发酵，2003，1（5）698朱广平，方煜平透明质酸制备方法及应用研究的进展J中国医药工业杂志，1996，2（8），3823849陈忠杰，郭爱玲透明质酸的应用及生产J河南化工，2007，247484910张照明，冯强，高玲玲透明质酸的产需情况及市场分析J精细与专用化妆品，2007，159242711姚美琴鱿鱼眼透明质酸的提取工艺研究J食品科技，2009，34（5）24124412RICARDOPVIEIRA,CRISTIANAPEDROSA,PAULOASMOURAO,ETALEXTENSIVEHETEROGE
35、NEITYOFPROTEOGLYCANSBEARINGFUCOSEBRANCHEDCHONDROITINSULFATEEXTRACEDFROMTHECONNECTIVETISSUEOFSEACUCUMBERJJBIOLCHEM,1993,322254226213郑艾初，陈健等糙海参酸性粘多糖的提取纯化工艺探讨J现代食品科技，2007，235656714罗红宇，高鹏等赤魟软骨粘多糖的制备J中国海洋药物杂志，2005，244141715郭玉涛，陈斌，江元汝等从牛眼玻璃体中分离纯化透明质酸的新方法J精细化工，2008，25324625016赵玉红，韩琳琳，迟玉杰酶法提取鸡蛋壳膜中透明质酸的研究J食品研究与开发，2008，29（1）404317汪建，汪清，谢镇酶解条件控制对透明质酸工业化提取的影响J2010，41（1）202218刘成梅，万茵，涂宗财等百合多糖脱蛋白方法的研究J食品科学，2002，231899019沈敏，冯睿，刘贝贝等碱提菜籽多糖脱蛋白方法的研究J食品科技，2006，927327520魏宜秦应用正交试验选择中性蛋白酶活力测定最佳条件J山东省药品检验所，2010，404621叶菊芳酶法提取乌贼眼中透明质酸的研究D宁波大学，2010
