1、本科毕业设计（20_届）水产养殖环境中菊酯类农药微生物降解菌的筛选及初步鉴定所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录中英文摘要引言21实验部分211实验材料2111样品来源2112主要溶液和试剂2113培养基2114实验仪器212实验方法3121菌株的富集和分离3122菌液中菊酯类农药降解率的测定3123菌株16SRRNA序列的PCR扩增与克隆32结果与讨论421菌落422菌株降解率的测定423菌株的初步鉴定5231基因克隆检测结果5232同源性比较523316SRRNA序列系统进化树的分析5234革兰氏染色63结论7致谢错误未定义书签。参考文献7摘要拟除虫菊酯类农药是
2、一类高效、广谱农药，在水产养殖过程中常用于杀灭寄生虫等，从而导致养殖水体及养殖生物中该类农药残留超标，影响人类健康。本研究从海水及底泥的富集培养物中分离获得一株可降解氯氰菊酯和溴氰菊酯的菌株，进一步利用气相色谱法对分离菌株的降解能力进行测定，结果表明，在28OC温度下，对浓度为100MG/L的氯氰菊酯和溴氰菊酯的降解率分别为943和977，通过革兰氏染色和16SRRNA序列分析，初步鉴定为噬甲基菌。关键词拟除虫菊酯；降解菌；生理特性；降解率ABSTRACTPYRETHROIDINSECTICIDESASAKINDOFPESTICIDEISJUSTAFTERORGANOPHOSPHATEANDC
3、ARBAMATEESTER,WHICHISWIDELYUSEDINPLANTEDCROPWITHITSHIGHEFFICIENCYANDLOWTOXICBUTTHEREMAININGPESTICIDESWILLGOINTOHUMANBODYTHROUGHTHEBIOLOGICCHAINANDAFFECTHUMANHEALTHAPYRETHROIDSDEGRADINGBACTERIASTRAINWASISOLATEDFROMSEAWATERANDSEDIMENTTHEDEGRADINGABILITYOFBACTERIAWEREDETECTEDBYTHEGCECDTHERESULTSSHOWEDT
4、HATTHESTRAINWASABLETODGRADECYPERMETHRINANDDELTAMETHRINBYAPPROXIMATELY943AND977RESPECTIVELYINTHEENVIRONMENTOF28CTHESTRAINWASPRELIMINARILYINDENTIFIEDASMETHYLOPHAGAMARINASTRAINKEYWORDSPYRETHROIDDEGRADINGBACTERIUMPHYSIOLOGICALCHARACTERISTICDEGRADATIONRATE2引言拟除虫菊酯类农药是杀虫剂中第三大类，为目前仅次于有机磷、氨基甲酸酯的一类杀虫剂，约占杀虫剂总
5、量的201。其中使用较广泛的主要有氯氰菊酯、溴氰菊酯、氟氯菊酯、甲氰菊酯等。其中氯氰菊酯和溴氰菊酯使用最为广泛，但其比较稳定，不易被对光、热分解2，由于长期大量使用的已经造成了生态系统的严重破坏。溴氰菊酯对鱼类具有强毒性3，可在40C以下存放六个月无分解，遇碱分解，无抗药性。拟除虫菊酯类农药具有高效广谱、作用迅速、持效长等特点，特别是对有机磷农药已产生抗性的害虫有很好的效果4。拟除虫菊酯类农药广泛应用于农作物如茶树、蔬菜、果树、棉花等生产中的害虫防治。在水产养殖中主要是清塘、毒杀杂鱼和有害生物以及杀灭寄生虫等5。由于其在渔业生产中的广泛使用，在养殖水环境以及养殖水产品中存在不同程度的残留6。蓄
6、积在水产品中的农药将会通过食物链进入人体，因而严重影响消费者的健康。市售养殖水产品不同程度存在拟除虫菊酯类农药的污染。蒋长征、戎江瑞6等对宁波市养殖水产品拟除虫菊酯类农药的残留问题进行调查，结果显示，在鱼、虾、蟹类中氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯等都存在不同程度的超标情况。有些微生物可降解除草剂、多环芳烃、石油、杀菌剂、人工合成高分子化合物，通过筛选降解菌可为受污染的土壤和水体的生物修复提供一条有效的途径。对于农药微生物降解的研究始于本世纪40年代，相对而言，用微生物降解方法解决农药残留问题是个较新的研究领域7。随着人民生活水平的提高，食品中农药残留的问题越来越受到人们的关注，用微生物降解方法解
7、决农药残留问题可为绿色食品生产提供一条新的途径8。有关农药微生物降解的研究，在对有机磷和有机氯的降解方面的研究较多，对于菊酯类农药的研究较少。而对于可降解菊酯类农药微生物的研究主要集中在农作物中，对于水产环境中的研究比较少9。生物修复是指生物尤其是微生物催化降解环境污染物，减少或最终消除环境污染的受控或自发过程，其基础是自然界中微生物对污染物的生物代谢作用10。将农药降解菌应用于水产环境的生物修复是目前国内外研究的重点。随着研究的发展，被发现的降解农药的微生物种类不断增多，对其降解机理的研究也日趋深入，降解菌降解效果的稳定性也日趋提高，目前国内已报道过多种具有降解菊酯类农药能力的微生物1113
8、。许育新1等从农药厂污泥中分离得到一株可降解氯氰菊酯的放线菌CDT3。对该菌进行了鉴定，并且研究了其生理特性。实验结果表明，CDT3能降解氯氰菊酯，其途径为共代谢。经16SRDNA序列分析，鉴定其为红球菌属（RHODOCOCCUSSP）。洪源范14等以农药废水池污泥为样品分离到1株命名为JQI45的细菌，该菌株的生长能以甲氰菊酯为唯一碳源。该菌株在24H内对20MG/L的甲氰菊酯的降解率可高达998，进一步根据其16SRRNAGENBANKACCESSIONNODQ177525序列相似性和生理生化特征分析，结果表明该菌为鞘氨醇单胞菌属SPHINGOMONASSP。拟除虫菊酯类农药是一类含酯键的
9、农药，具有多个苯环结构，为具有中等毒性的一类农药15。本实验利用划平板划线法筛选到了一株可降解溴氰菊酯和氯氰菊酯的菌株，并对其降解效率进行了详细研究，进一步通过革兰氏染色和16SRRNA分析，初步鉴定该菌株为噬甲基菌属（METHYLOPHAGAMARINA）。1实验部分11实验材料111样品来源宁波附近海域取海水、沉积物样品。112主要溶液和试剂浓度为20G/L的溴氰菊酯、氯氰菊酯，丙酮、正己烷、氯化钠、无水硫酸钠、异辛烷分析纯，购自国药集团药业股份有限公司，引物27F（5AGAGGTTTTGATCCTGGCCAG3）、1541R（5ACGGCTACCTTGTTACGACT3）购自南京金斯瑞生
10、物科技有限公司，PCR反应所需的DNTPS、RTAQDNA聚合酶及PMD19购自TAKARA公司。113培养基基础培养基海洋细菌培养基（PH76）蛋白胨，5G；磷酸高铁，001G；酵母膏，1G；过滤海水，1000ML；固体培养基，15G琼脂。富集培养基海洋细菌培养基中添加氯氰菊酯和溴氰菊酯的混合液，浓度为100MG/L。114实验仪器电热恒温水浴锅，核酸蛋白定量检测仪，离心机，氮气吹干仪，岛津GC2010，电子天平，PCR仪，无菌操作台，振荡器，摇床等。12实验方法121菌株的富集和分离1、将水样和沉积物样品经过初步过滤后各取10ML加入到灭菌后的海洋细菌培养基中，在75RMIN1、30C下摇
11、床培养24H。2、加入氯氰菊酯和溴氰菊酯，使其终浓度为100MG/L，然后，在120RMIN1，28C下继续摇床振荡培养。3、将水样和沉积物中通过摇床培养的混合菌接种到平板上，在温度28C，湿度88下培养24H，挑取单菌落接种到培养基中，28C150RMIN1摇床培养5天。122菌液中菊酯类农药降解率的测定利用正己烷/丙酮（11，V/V）混合溶剂提取菌液中的氯氰菊酯和溴氰菊酯，通过GCECD检测菌液中的农药残留，计算获得菌株的降解率。123菌株16SRRNA序列的PCR扩增与克隆1231菌液PCR采用16SRRNA反应引物27F和1541R进行PCR扩增；PCR反应条件经过94C预变性2MIN
12、后，循环扩增35次94C30S，60C30S，72C1MIN，循环结束后72C延伸10MIN。反应结束后，经琼脂糖凝胶电泳检测。表1PCR体系TAB1PCRSYSTERMPCR体系体积H2O1725L10BUFFER25L菌液1LDNTP2L引物L10L引物210LRTAQ025L总体积25L1232琼脂糖凝胶中DNA片段的回收将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，置于15ML离心管中；按13的比例加入300L抽提缓冲液；于恒温水浴中50C温育至凝胶融化，23MIN混合一次；将滤液转移至SPINCOLUMN内，在6000RMIN1离心，弃滤液；加入2500L抽提缓冲液后1200RMIN1离心，
13、弃滤液；向SPINCOLUMM管内加入750L淋洗缓冲液，12000RMIN1离心，弃去滤液；12000RMIN1离心1MIN，将SPINCOLUMM转移至无菌15ML离心管并彻底清除离心柱内残液；向SPINCOLUMM管内加入25L灭菌水，静置1MIN，12000RMIN1离心，置于20C下保存。1233质粒连接质粒连接体系PMD19TVECTOR1L；回收的PCR片段4L；SOLUTION25L。将上述反应体系置于PCR仪中16C反应1H。1234转化取100L感受态细胞悬液于15MLEP管中，加入PUC质粒DNA溶液轻轻摇匀，冰上放置30MIN；42C水浴90S立即转到冰上冷却数分钟；加
14、入冰预冷的LB液体培养基890L，混匀后37C振荡培养1H，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因（AMPR）；将上述菌液摇匀后取100L涂布于含AMP100GML1的LB固体平板上，37C倒置培养16H；筛选白色菌落置于5ML含AMP的LB培养液中，37C培养5H。1235PCR检验及测序在LB固体平板上挑选白色菌落，利用菌落PCR扩增后，经琼脂糖凝胶电泳检测鉴定后，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行序列测定。12416SRRNA序列系统进化树分析BLAST序列比对将测序结果于NCBI上进行BLAST比对；绘制系统树选择同源性较高的细菌16SRRNA序列进行比对分析，构建系统进
15、化树。2结果与讨论21菌落用涂有农药的平板从水样、沉积物中取样划平板，通过一段时间的培养，平板上出现了生长较好的菌落，选取较明显的菌落标号。其中19号菌的菌落形态为规律的白色菌落，线条明朗，长势旺，厚重；1016号菌落形态为生长无规律，有单菌落，个体不大，散乱在整个平板上，并且有黄色小菌落；1719号菌落形态为生长2天的菌落个体不大，但密集且黏糊在一起，培养5天后菌落成较大圆形，菌落较多。22菌株降解率的测定挑选21株菌28C条件下进行摇瓶培养，19号菌培养过程中加入溴氰菊酯，终浓度为100MG/L，1019号菌培养过程中加入氯氰菊酯，终浓度为100MG/L，2021号菌培养过程中同时加入氯氰
16、菊酯和溴氰菊酯，终浓度各为100MG/L，培养7天后，通过GCECD法分析培养基中氯氰菊酯、溴氰菊酯的浓度，计算降解率。表2微生物降解率TAB2MICROBIALDEGRADATIONRATE序号降解率氯氰菊酯溴氰菊酯16572934388948665006787796284509674109011194212590134631490415967161000178818368199682085675921977943结果如表2所示，菌株14，69号菌可降解溴氰菊酯，其中7号菌降解率最高，为962；菌株1019号可降解氯氰菊酯，其中16号菌降解率最高，为1000；20、21号菌既可降解溴氰菊酯又
17、可降解氯氰菊酯，其中，21号菌对溴氰菊酯和氯氰菊酯降解率分别为977和943，具有较好的降解效果。23菌株的初步鉴定挑选3株降解能力较强的菌株7号、16号和21号，通过16SRRNA对三株菌进行初步鉴定。231基因克隆检测结果如图1所示，以16SRRNA引物扩增后片段大小为15KB左右，与引物设计时理论扩增片段大小相同。图1基因克隆后凝胶电泳图FIG1THERESULTOFTHEGELELECTROPHORESIS232同源性比较如表3所示，7号菌株的16SRRNA序列与红细菌属（RHODOBACTERACEAEBACTERIUM）的序列同源性为100。16号菌株的16SRRNA序列与噬甲基菌
18、属（METHYLOPHAGAMARINA）的序列同源性为100。21号菌株的16SRRNA序列与噬甲基菌属（METHYLOPHAGAMARINA）STRAIN222同源性为99。表3降解菌的测序和同源性比较TAB3DEGRADINGBACTERIUMSEQUENCINGANDHOMOLOGYCOMPARISON序号GENBANK搜索结果7RHODOBACTERACEAEBACTERIUM100同源16METHYLOPHAGAMARINA100同源21METHYLOPHAGAMARINASTRAIN22299同源23316SRRNA序列系统进化树的分析将21号菌株16SRRNA测序结果提交到NC
19、BI上进行BLAST，其核苷酸的序列同源性分析结果表明，该菌株的16SRRNA序列与多数噬甲基菌属（METHYLOPHAGAMARINA）的序列同源性均在99以上，将其最相近的10个16SRRNA序列构建进化树，如图2所示。系统树整体由2个分支构成，菌株21号处于噬甲基菌（METHYLOPHAGAMARINA）属部分菌株的系统进化树的一个分支中，根据16SRRNA的系统进化树及BLAST分析，21号菌属于噬甲基菌属（METHYLOPHAGAMARINA）。UNCULTUREDBACTERIUMCLONEUVRV058UNCULTUREDBACTERIUMCLONEUVRV007UNCULTUR
20、EDBACTERIUMCLONEUVRV070UNCULTUREDBACTERIUMCLONEUVRV080METHYLOPHAGAMARINASTRAINKM5METHYLOPHAGAMARINASTRAIN222METHYLOPHAGATHALASSICASTRAINATCC33146METHYLOPHAGATHALASSICASTRAINDSM5690UNCULTUREDBACTERIUMCLONEODP46B02METHYLOPHAGAAMINOSULFIDOVORANSMETHYLOPHAGAMARINASTRAIN101216图2基于16SRRNA序列同源性构建的菌株21和相关细菌
21、的系统进化树FIG2PHYLOGONETICTREEBASEDONTHESEQUENCEHOMOLOGYOFSTRAINS21ANDBACTERIARELATED21号菌序列ACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTCATTGACCACAAAGTGGTAAGCGACCTCCCGAAGGTTAGTCTACCTACTTCTTTTGCAGCCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATTCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGAC
22、TACGACTAGCTTTATGGGATTAGCATACTCTCGCGAGTTAGCAACCCTTTGTACTAGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCATAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAACTAAGGACAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTTAGCGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCGCTA
23、CATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCAACTTATCGCGTTAGCTTCGATACACAAAGAATAAATTCTCCATACACCTAGTTGACATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTACCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTAATGGCCCAGTGAGTCGCCTTCGCCACTGATGTTCCTTCAGATCTCTAC
24、GCATTTCACCGCTACACCTGAAATTCCACTCACCTCTACCACACTCTAGCCATCCAGTATCAAAATGCAATTTCCCAGGTTGAGCCCGGGATTTCACATCTGACTTAAATAACCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTATAGGTAACGTCACAGTTGCAAGGTATTAACTTACAACCTTTCCTCCCTATTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCG
25、GCATTGCTGGATCAGGGTTGCCCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACAGATCGTCGCCTTGGTAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCTGATATAGGTTCATCTAATAGCACGAGGTCCGAAGAGCCCCCGCTTTCCTCCGTAGAGCGTATGCGGTATTAGCAGCCGTTTCCGGCTGTTGTCCCCCACTACTAGGCAGATCCCTATACATTACTCACCCGTCCGCCACT
26、AATCCGTCTAGCAAGCTAGACTTCATCGTTCGACTTGCATGTGTTAGGCATGCCGCCAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTCTA234革兰氏染色对16、21号菌株进行革兰氏染色生化实验，表明16、21号菌株是一株革兰氏阴性菌，这与噬甲基菌属（METHYLOPHAGAMARINA）特征相符17。图3100倍油镜10倍目镜下观察的16号菌株的革兰氏染色FIG3GRAMSSTAININGEXPERIMENTRESULTOFSTRAIN17BY100TIMESOILMIRRORAND10TIMESEYEPIECE图4100倍油镜10倍目镜下观察的21号菌
27、株的革兰氏染色FIG4GRAMSSTAININGEXPERIMENTRESULTOFSTRAIN21BY100TIMESOILMIRRORAND10TIMESEYEPIECE3结论从水产养殖环境中取样，经过筛选得到了一株可同时降解氯氰菊酯、溴氰菊酯的农药降解菌株21号菌，其在28OC温度下，对浓度为100MG/L的氯氰菊酯和溴氰菊酯溶液的降解率分别为943和977。进一步通过16SRRNA序列分析及革兰氏染色表明菌株21号与噬甲基菌属同源性为99，该菌为革兰氏阴性菌，这与噬甲基菌属特征相符。参考文献1许育新，戴青华，李晓慧，等氯氰菊酯降解菌卡朱CDT3的分离鉴定及生理特性研究J农业环境科学学报
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