1、本科毕业设计（20届）胃蛋白酶提取乌贼皮中胶原蛋白的工艺研究所在学院专业班级食品科学与工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1前言12材料与方法121材料122仪器设备123方法2231乌贼皮基本成分测定2232蛋白酶活力的测定22321试剂22322标准曲线的绘制22323样品测定22324计算2233胶原蛋白得率的测定22331羟脯氨酸标准曲线的绘制922332提取液中羟脯氨酸质量的测定32333胶原蛋白得率的计算3234工艺流程3235乌贼皮的预处理3236单因素实验32361醋酸浓度的选择42362料液比的选择42363胃蛋白酶添加量的选择42364提取时间的选择4237正交实验
2、43结果与讨论431乌贼皮（原料）基本成分分析432胃蛋白酶活力的测定533羟脯氨酸标准曲线的绘制534酸浓度对乌贼皮中胶原蛋白得率的影响635料液比对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响636胃蛋白酶的用量对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响737酶提时间对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响738正交实验839验证试验94小结9参考文献111摘要胶原蛋白是构成生物体最重要的结构蛋白,在水生生物中含量很高。乌贼皮中粗蛋白含量达1664，约占乌贼皮干重的80。本文研究了利用胃蛋白酶提取乌贼皮中胶原蛋白的工艺条件。对提取过程中酸浓度、料液比、酶浓度、提取时间等因素进行了研究。在单因素实验的基础上，做了正交实验，实验结
3、果表明，胃蛋白酶提取乌贼皮中胶原蛋白的最佳工艺条件为在4下，酸浓度为01MOL/L，料液比为120，加酶量1400U/G，提取时间为12H，在此条件下得胶原蛋白的得率为1109。关键词胃蛋白酶乌贼皮胶原蛋白提取羟脯氨酸ABSTRACTCOLLAGENISTHEMOSTIMPORTANTSTRUCTURALPROTEININORGANISMSCRUDEPROTEINCONTENTIS1664INSQUIDSKIN,ACCOUNTINGFOR80OFITSDRYWEIGHTITEXISTSINTHESURFACEOFALLAQUATICORGANISMSSQUIDSKINCOLLAGENEXTRA
4、CTIONBYPEPSINISSTUDIEDINTHISPAPERTHEEXTRACTIONTECHNOLOGYINCLUDINGACETICACIDCONCENTRATION,SOLIDTOLIQUIDRATIO,ENZYMECONCENTRATION,IMMERSIONTIMEWASDISCUSSEDSINGLEFACTOREXPERIMENTSANDORTHOGONALTESTSHOWEDTHATTHEPARAMETERSAREASFOLLOWSAT4,IN01MOL/LACETICACIDBUFFERSOLUTION,THEADDEDENZYMEDOSAGEIS1400U/GANDTH
5、EWEIGHTRATIOOFSKINTOSOLVENTIS1TO20,IMMERSIONTIMEIS12H,THERECOVERYOFTHECOLLAGENSWAS1109KEYWORDSPEPSINSQUIDSKINCOLLAGENEXTRACTIONHYDROXYPROLINE11前言胶原蛋白是构成生物体最重要的结构蛋白,在人体中是皮肤、血管、骨骼、软骨及结缔组织最主要的蛋白质。胶原广泛存在于从低等脊椎动物的体表面到哺乳动物机体的一切组织中，胶原蛋白占哺乳动物体内蛋白总量的2530,体重的61。胶原蛋白用途广泛,其制品已应用于医药、保健品、食品、化妆品等众多领域。如胶原护肤霜、胶原面膜、胶
6、原美容口服片等系列产品,其内服外用效果良好,满足了当前消费者对功能性产品的强烈需求目前在欧美国家,服用胶原产品进行皮肤深层养护已成时尚11。据专家预测,我国的胶原热潮也即将到来。胶原也是人类皮肤的主要组成成分。人处于幼年时,皮肤中胶原的含量高,随着年龄的增长,其含量开始逐渐下降,导致皮肤渐渐丧失保湿功能,人体只有不断合成新胶原才能保持皮肤健康且具有弹性。胶原蛋白的阴离子侧链丰富,能吸附大量水分,维持皮肤的湿润、弹性2。牛和猪的皮、骨头通常是胶原蛋白的主要来源，然而，牛海绵状脑病（BSE）、传染性海绵状脑病（TSE）和口蹄疫（FMD）的爆发使得人们对陆生动物来源的胶原蛋白及其衍生产品的安全性产生
7、恐慌3。另外，由于宗教因素，如犹太教和伊斯兰教，从猪来源提取的胶原蛋白作为食物的组分，其应用受到限制2。因此寻找可替代的新来源的胶原蛋白就显得非常迫切4。乌贼加工会产生大量的下脚料,如乌贼皮、侧鳍、内脏、内骨骼等,如果不进行有效处理,不仅会造成环境的污染,而且会浪费大量的宝贵资源。如能充分利用这些成分,不仅可提高乌贼加工的附加值,同时可减少环境污染,获得良好的经济效益与社会效益1。而乌贼皮中胶原蛋白的含量很高，因此成为了可以代替猪、牛等陆生动物的胶原潜在来源。胶原蛋白的提取方法主要包括酶提法和酸提法，而酶提法的胶原蛋白得率比酸提法要大得多5。酸溶胀的鱼皮胶原具有更加松散的结构，从而更易被蛋白酶
8、作用6。因此本文采用加酸辅助胃蛋白酶提取乌贼皮中胶原蛋白的方法进行实验，分别对醋酸浓度、料液比（原料鱼皮W/酸体积V）、加酶量、酶解时间几个因素做单因素实验，并根据单因素实验结果选择醋酸浓度、料液比（原料鱼皮W/酸体积V）、加酶量、酶解时间四个因素，做四因素三水平正交实验，从而得出酸辅助胃蛋白酶提取乌贼皮中胶原蛋白的特点。2材料与方法21材料金乌贼SEPIAESCULENTAHOYLE，购买于宁波市庄市；胃蛋白酶，美国AMRESCO公司，冷藏于冰箱中；其余化学试剂，均为分析纯。22仪器设备组织捣碎匀浆机DS1上海标本模型厂电子分析天平梅特勒托利多仪器（上海）有限公司DKS24型电热恒温水浴锅上
9、海精宏实验设备有限公司冷冻高速离心机湖南湘仪离心机仪器有限公司T6新锐可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司数显电热鼓风干燥器1012A型上海锦屏仪器仪表有限公司凯氏定氮装置，消化炉，马福炉等。223方法231乌贼皮基本成分测定参照国家标准GB/T5009系列（2003年版），新鲜乌贼皮（金乌贼）的水分采用GB/T500932003直接干燥法；灰分参照GB/T500942003；蛋白质采用GB/T500952003第一法；总糖采用苯酚硫酸法测定。232蛋白酶活力的测定2321试剂福林试剂FOLIN试剂；04MOL碳酸钠溶液；04MOL三氯乙酸TCA溶液；2酪蛋白溶液；100G/ML酪氨酸溶
10、液7。2322标准曲线的绘制分别吸取不同浓度酪氨酸1ML，各加入04MOL碳酸钠5ML，再各加入已稀释的福林试剂1ML。摇匀置于水浴锅中。40保温发色20MIN在660NM波长测OD值。一般测三次，取平均值，同时做空白试验。2323样品测定称取酶粉0100G，加入PH72磷酸盐缓冲液定容至100ML，吸取此液5ML，再用缓冲液稀释至25ML，即成5000倍的酶粉稀释液。取样品稀释液1ML，置于40水浴中预热2MIN，再各加入经同样预热的酪蛋白1ML，精确保温10MIN，时间到后，立即再各加入04MOL三氯乙酸2ML，以终止反应，继续置于水浴中保温20MIN，使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另
11、取滤液1ML，再加04MOL碳酸钠5ML，已稀释的福林试剂1ML，摇匀，40保温发色20MIN后进行光密度OD测定。空白试验测定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加04MOL三氯乙酸2ML，使酶失活，再加入酪蛋白7。2324计算在40下每分钟水解酪蛋白产生1G酪氨酸，定义为1个蛋白酶活力单位。样品蛋白酶活力单位干基10A4NW11式中A由样品测得OD值，查标准曲线得相当的酪氨酸微克数或OD值K；44ML反应液取出1ML测定即4倍；N酶液稀释的倍数；10反应10MIN；W样品水分百分含量。233胶原蛋白得率的测定胶原蛋白含有大量的甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸等，其中羟脯氨酸（HYDROXYPRO
12、LINE，以下简称HYP）和羟赖氨酸在其它蛋白中很少见6，为胶原蛋白所特有。通过测定羟脯氨酸的质量，然后乘以相应的系数就可以得到胶原蛋白的质量8。2331羟脯氨酸标准曲线的绘制9参考闫鸣艳9的方法绘制羟脯氨酸标准曲线，略有改变。配置羟脯氨酸标准工作液精确称取L羟脯氨酸标准品100MG，加入0001MOL/L盐酸中溶解，稀释并3定容到100ML。取其中1ML定容到100ML容量瓶中，该为质量浓度为10UG/ML的标准工作液。准确吸取羟脯氨酸标准工作于10、20、30、40、50ML，分别用蒸馏水定容到10ML，得到浓度分别为1G/ML，2G/ML，3G/ML，4G/ML，5G/ML的羟脯氨酸标准
13、溶液。取上述标准液各1ML于试管中，以0001MOL/L的盐酸溶液作为空白液，在标准溶液和空白液中分别加入1ML的氯胺T溶液，混匀，室温下静置10MIN，再加入1ML的高氯酸溶液，混匀，室温下静置5MIN，最后加入对二甲基苯甲醛溶液1ML，混匀，60加热20MIN进行显色反应，至于冷水中冷却。以空白液调零，测定560NM处得吸光度，绘制标准曲线。2332提取液中羟脯氨酸质量的测定吸取5ML提取液于具塞试管中，加入6MOL/L的盐酸5ML，封口后于130下水解4H。冷却后取出，用蒸馏水定容至10ML，脱色，滤纸过滤，取滤液1ML，调PH至中性后定容至50ML9。吸取1ML样品溶液，按羟脯氨酸标准
14、曲线的测定方法，以空白调零，测定待测样品的吸光度。由羟脯氨酸标准曲线换算出样品液中羟脯氨酸含量。提取液中羟脯氨酸质量按下式计算羟脯氨酸质量（MG）H10稀释倍数V提式中H标准曲线上相对应的羟脯氨酸的含量（G/ML）；V提提取液的总体积（ML）。2333胶原蛋白得率的计算胶原蛋白质量（）羟脯氨酸质量（MG）系数胶原蛋白得率（）提取液胶原蛋白质量（G）/原料质量（G）100由于HYP含量与胶原蛋白的含量是呈正相关性,将测定的HYP含量乘以相应的系数即可得出胶原蛋白的含量，本文中该系数取11110。234工艺流程剪碎的乌贼皮脱脂除杂蛋白匀浆加入酸溶液加入胃蛋白酶酶解沸水浴加热10MIN，使酶失活离心
15、（8000RMIN1）20MIN取上清液定容，测定提取液中羟脯氨酸质量，计算胶原蛋白得率。235乌贼皮的预处理（1）新鲜乌贼皮从乌贼体剥下后，仔细地将皮下肉、脂肪及结缔组织剔除，流水冲洗，室温晾干后剪碎，冷冻贮藏于冰箱中。实验前取出冷冻的碎鱼皮，室温下解冻晾干。（2）脱脂称量10G碎鱼皮，放入含1（VV）H2O2的001MOL/L氢氧化钠溶液120,W/V中，4下浸泡3H，之后水洗至中性，2000R/MIN离心20MIN，弃去滤液，取沉淀。（3）除杂蛋白将脱脂后乌贼皮（即沉淀）放入02MOL/L氯化钠溶液130,W/V中，4下浸泡6H，每3H更换一次溶液，之后水洗，2000R/MIN离心20M
16、IN，弃去滤液，残渣待用。（4）所得残渣加水至100G，间歇匀浆10MIN，制成匀浆液。236单因素实验分别吸取1000G匀浆液到锥形瓶中，加入适量的胃蛋白酶和酸溶液，于一定温度下提取一定时间，完成后沸水浴10MIN灭酶，静止冷却，8000R/MIN离心20MIN，取上清液定容，测定提取液中羟脯氨酸质量，计算胶原蛋白得率。试验所有提取条件的选择都以等量鱼皮提取后所得胶原蛋白得率作为指标。由于在低温下（4），胃蛋白酶更倾向于切除胶原蛋白的非螺旋结构的端肽，因而不会造成胶原结构的深度破坏。一般来说，胃蛋白酶活性在低PH条件下增强。而在室温2628下，胃蛋白酶表现出更高4的活性而且能够随意的切除鱼皮
17、中溶胀的胶原蛋白分子，但胶原分子结构在深度反应条件下被破坏11。因此，实验酶解温度都在4下进行。2361醋酸浓度的选择加酶量为1400U/G胃蛋白酶，料液比为110，实验在4进行，提取12H。醋酸浓度分别为01MOL/L、05MOL/L、10MOL/L和20MOL/L。2362料液比的选择加酶量为1400U/G胃蛋白酶，醋酸浓度05MOL/L，实验在4进行，提取12H。料液比（乌贼皮酸溶液，WV）分别为15、110、115、120和125。2363胃蛋白酶添加量的选择醋酸浓度05MOL/L，料液比为110，实验在4进行，提取12H。加酶量分别为700U/G、1400U/G、2100U/G和28
18、00U/G。2364提取时间的选择加酶量为1400U/G胃蛋白酶，醋酸浓度05MOL/L，料酸比为110，实验在4进行。提取时间分别为6H、12H、24H、36H和48H。237正交实验根据单因素实验结果，选取酸浓度（A）、料液比B、胃蛋白酶用量（C）和酶解时间D为试验因子，以胶原蛋白的得率为指标，采用L934正交试验设计，进行提取，对酶法提取乌贼皮中胶原蛋白的工艺条件进行优化表1，得到酶法提取的最佳工艺条件。水平LEVELS醋酸浓度（MOL/L）ACIDCONCENTRATION（MOL/L）料液比（原料酸）（W/V）SOLIDLIQUIDRATIO（W/V）加酶量U/GENZYMEDOSA
19、GEU/G酶解时间HHYDROLYSISTIMEH1011157006205120140012310125210024表1正交实验因素及水平表TABLE1FACTORSANDLEVELSOFORTHOGONALTEST3结果与讨论31乌贼皮（原料）基本成分分析表2乌贼皮一般成分表（以湿重计）TABLE2PROXIMATECOMPOSITIONOFSQUIDSKIN水分MOISTURE灰分ASH总糖TOTALSUGAR脂肪FAT蛋白PROTEIN含量（CONTENT796204520412516645从表2中可看出，乌贼皮虽是水产品加工的废弃物，但是其中含有丰富的蛋白质，粗蛋白含量达1664，约
20、占乌贼皮干重的80。32胃蛋白酶活力的测定所得酶活力标准曲线回归方程为Y00115X00095,相关系数R209987,其中Y为吸光度X为酪氨酸浓度UG/ML,标准曲线见图1。002040608112020406080100120酪氨酸浓度G/ML吸光度图1胃蛋白酶活力标准曲线FIG1THESTANDARDCURVESOFPEPSINACTIVITY根据福林（FOLIN）法操作说明与酶活力标准曲线，测得胃蛋白酶活力为14000U/G。33羟脯氨酸标准曲线的绘制参照文献9测定不同浓度的羟脯氨酸的A560值，根据可见分光光度计测定的数值，绘制羟脯氨酸标准曲线，如图2。用计算机拟合出标准回归方程为Y
21、00546X00071，Y为吸光度值，X为羟脯胺酸的浓度（G/ML）。羟脯氨酸浓度与吸光度之间呈直线相关（R209994）。因此，由此标准回归方程计算羟脯氨酸浓度准确可靠。通过该曲线方程，可得到羟脯氨酸含量，从而最终通过计算得到胶原蛋白得率13。Y00546X00071R2099940010203040506024681012羟脯氨酸含量（UG/ML）吸光度（A）吸光度（A）线性吸光度（A）图2羟脯氨酸的标准曲线FIG2THESTANDARDCURVESOFHYDROXYPROLINE634酸浓度对乌贼皮中胶原蛋白得率的影响按照以下条件，分别对等量的乌贼皮匀浆液进行提取。加酶量为1400U/G
22、胃蛋白酶，料液比为110，实验在4进行，提取12H。醋酸浓度分别为01MOL/L、05MOL/L、10MOL/L、20MOL/L。计算提取液中胶原蛋白得率，结果如图3所示。5678910110020406081121416醋酸浓度（MOL/L）胶原蛋白得率（）图3不同酸浓度对乌贼皮中胶原蛋白提取的影响FIG3EFFECTOFDIFFERENTTACIDCONCENTRATIONONEXTRACTIONOFCOLLAGENFROMSQUIDSKIN由图3可知，乙酸浓度为05MOL/L时，胶原蛋白得率最高，当酸浓度大于05MOL/L时，胶原蛋白提取率随着酸浓度的增大而减少，因此，提取乌贼皮中胶原蛋
23、白的最佳酸浓度为05MOL/L。35料液比对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响按照以下条件，分别对等量的乌贼皮匀浆液进行提取。加酶量为1400U/G胃蛋白酶，醋酸浓度05MOL/L，实验在4进行，提取12H。料液比（乌贼皮酸溶液，WV）分别为15、110、115、120和125。计算提取液中胶原蛋白得率，结果如图4所示。5678910111213105110115120125料液比胶原蛋白得率（）图4不同料液比对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响FIG4EFFECTOFDIFFERENTSOLIDLIQUIDRATIOONEXTRACTIONOFCOLLAGENFROMSQUIDSKIN7由图4可知，固液
24、比较小时，乌贼皮在溶液中密度太大，不能完全提取，提取率低，随着料液比逐渐增大，胶原蛋白提取率整体呈现出上升的趋势，而当料液比到达120后，提取率开始减少，因此，乌贼皮中胶原蛋白提取率的最佳料液比选择120。36胃蛋白酶的用量对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响按照以下条件，分别对等量的乌贼皮匀浆液进行提取。醋酸浓度05MOL/L，料液比为110，实验在4进行，提取12H。加酶量分别为700U/G、1400U/G、2100U/G和2800U/G。计算提取液中胶原蛋白得率，结果如图5所示。567891011050010001500200025003000加酶量（U/G）胶原蛋白得率（）图5不同胃蛋白酶用
25、来对乌贼平中胶原蛋白提取率的影响FIG5EFFECTOFDIFFERENTPEPSINCONCENTRATIONONEXTRACTIONOFCOLLAGENFROMSQUIDSKIN由图5所示，随胃蛋白酶用量的增加，胶原蛋白的提取率也增加，但胃蛋白酶用量超过1400U/G后，胶原蛋白提取率增加很缓慢。因此，从经济的角度考虑，胃蛋白酶的最佳用量为1400U/G较为合适。37酶提时间对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响按照以下条件，分别对等量的乌贼皮匀浆液进行提取。加酶量为1400U/G胃蛋白酶，醋酸浓度05MOL/L，料酸比为110，实验在4进行。提取时间分别为6H、12H、24H、36H和48H。计
26、算提取液中胶原蛋白得率，结果如图6所示。由图6可知，胶原蛋白提取率随着浸提时间的增加而增大，但在12H内，随浸提时间延长，胶原蛋白提取率增加较快，而超过12H后，提取率的增加变得很慢，因而，以1400U/G酶蛋白酶05MOL/L的乙酸为浸提剂，110的料液比条件下，提取时间12H为最佳。866577588599510105110102030405060时间（H）胶原蛋白得率（）图6不同浸提时间对乌贼皮中胶原蛋白提取率的影响FIG6EFFECTOFDIFFERENTIMMERSIONTIMEONEXTRACTIONOFCOLLAGENFROMSQUIDSKIN38正交实验根据单因素酶解的试验结果
27、，选取4因素3水平正交组合试验L934,确定酶提乌贼皮中胶原蛋白的最佳工艺条件。选取胃蛋白酶用量（A），酶解时间B，提取时间（C）和原料的固液比D为因素，每个因素三个水平，在4下进行正交试验，进行酶法提取工艺研究，测定了9组胃蛋白酶水解液的HYP含量，结果如表3所示。结果见表3。1根据极差确定因素的主次顺序由表54得出实验极差因素CDBA，说明影响因素排列依次为加酶量酶解时间料液比酸浓度。2较佳工艺的确定在该试验中，HYP含量越大越好，所以应挑选每个因素的K1、K2、K3中对应的那个水平，由于A因素系列K1K2K3B因素系列K2K1K3C因素系列K3K2K1D因素系列K3K2K1对于对于C因素
28、（酶浓度）和D因素（酶解时间），虽然都是K3K2，但实际二者相差不大，考虑经济因素，因此选C2和D2更优；所以，用酸辅助胃蛋白酶从乌贼皮提取胶原蛋白的较佳工艺为A1B2C2D2，即在4酶解温度下，酸浓度为01MOL/L，料液比为120，加酶量1400U/G，酶解时间12H。9编号NO因素FACTOR胶原蛋白得率/A酸浓度ACIDCONCENTRATION（MOL/L）B料液比（原料皮酸,W/V）SOLIDLIQUIDRATIO（W/V）C加酶量U/G）ENZYMEDOSAGEU/GD酶解时间H）HYDROLYSISTIMEH11011115170016793212120214002121092
29、31312532100324112342051231114522311065623128237310132110283213855933211023K1100271003082379603K210007100401076310057K3993398971096710307R0094014327300704表3L934正交实验设计与结果TABLE3L934ORTHOGONALDESIGNANDRESULTS39验证试验为检验正交法所得结果的可靠性，采用上述最优改性条件进行酸辅助胃蛋白酶提取乌贼皮中胶原蛋白实验，最佳工艺参数选取为在4酶解温度下，酸浓度为01MOL/L，料液比为120，加酶量140
30、0U/G，酶解时间12H，胶原蛋白实际得率为1109，表明实验设计和正交法优化得到的提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。4小结经醋酸处理的鱼皮，在溶胀之后具有了更加松散易渗的结构，因此，胃蛋白酶渗入鱼皮基质的能力增强了，胃蛋白酶提取胶原蛋白能力也就增强了，因此醋酸辅助提取胃蛋白酶的胶原蛋白得率比单独的酸法提取或酶法提取的胶原得率要高11。从单因素实验和正交实验的结果来看，影响胃蛋白酶法提取胶原蛋白的影响因素的几个因素排列依次为加酶量酶解时间料液比酸浓度。利用酸辅助胃蛋白酶提取乌贼皮中胶原蛋白的最佳工艺为在4酶解温度下，01MOL/L的乙酸，胃蛋白酶量1400U/G，提取时间为12H，料液比为1
31、20。在此条件下获得的胶原蛋白得率为1109。本文利用醋酸辅助胃蛋白酶提取乌贼皮中胶原蛋白，为其他研究人员后续的研究提供一定的数据支持，若投入产业化，不仅可提高乌贼加工的附加值,同时可减少环境污染,获得良好的经济效益与社会效益。参考文献1张虹,卓素珍,戴志远鮟鱇鱼皮中胶原蛋白的提取及性质研究J中国食品学报,2009,9（6）34392陈胜军，曾名勇，董士远水产胶原蛋白及其活性肽的研究进展J水产科学，2004，（6）44463吴丹，康怀彬，肖枫鱼皮胶原蛋白研究进展J肉类研究，2007,（6）23254丁卓平，刘振华，李仁冬，朱卫钦罗非鱼鱼皮胶原蛋白提取条件的研究J水产科技情报2006,33419
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